蛋白质降解与修饰-理论与实验 (1)
蛋白质基础及检测技术
各种氨基酸在结构上有下列共同特点： 组成蛋白质的氨基酸皆为α-氨基酸。
不同的α-氨基酸，其R侧链不同（氨基酸分类的依据）。它对蛋 白质的空间结构和理化性质有重要的影响。 除R侧链为氢原子的甘氨酸外，其它氨基酸的α-碳原子所连接的 四个原子或基团互不相同，该碳原子都是不对称碳原子。 20种氨基酸中的脯氨酸含有亚氨基，所以它是亚氨基酸。半胱 氨酸在蛋白质分子中多数是以胱氨酸的形式存在。
血红蛋白空间结构
蛋白质高级结构的实验解析方法
蛋白质结构实验分析主要有 三大技术平台
（1）X-衍射蛋白质晶体结构分析 （2）核磁共振波谱分析 （3）冷冻电镜技术
蛋白质晶体结构X-衍射分析
是目前分辨率最高的结构测定方法，高通量晶体 结构分析中的几大重要环节是：数据处理与分析 、重原子的定位、密度修饰、分子替换、图形整 合、模型加工和确认。
蛋白质基础及检测技术
1 蛋白质的基本概念
蛋白质（protein ）是生命的物质基础，是有机大分子， 是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没 有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。
2 蛋白质的元素组成
蛋白质不仅在功能上与糖、脂肪不同，在元素组成上 亦有差别。 根据蛋白质的元素分析表明，其元素组成依次为：碳 (50-55%)、氧（19-24%）、氮（13-19% ）、氢（6-7%） 硫（0-4%）。有的还含有少量磷、铁、铜、锌、锰、钴、 钼、碘等元素。一切蛋白质皆含有氮并且大多数蛋白质含 氮量比较接近而恒定，一般为15—17％，平均为16％。这 是蛋白质元素组成的一个重要特点，也是各种定氮法测定 蛋白质含量的计算基础。即用定氮法测得的含氮量乘以 6 ．25，即可算出样品中蛋白质的含量。但有的蛋白质中 氮的含量有一定差别，应根据其氮的真实含量进行计算。
浅谈蛋白质质谱分析
浅谈蛋白质质谱分析方法及应用董义龙(单位：毕节学院，化学与化学工程学院，2009级化学教育本科三班,学号:06320904031）摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要的综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式和应用，并对其发展前景着出展望。
关键词：蛋白质质谱分析原理与方法蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上。
作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行，调节代谢，抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此，蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。
关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。
随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。
1 蛋白质组学研究的背景和意义1．1蛋白质组学的产生20世纪90年代开始的人类基因组计划(}Iuman Genome Project，HGP)是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类基因组DNA3×109核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。
经过各国科学家十几年的努力，HGP已取得了巨大的成绩。
在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂和多交性之间存在着巨大的反差。
这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。
要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的。
对于生命活动的主要体现者——蛋白质进行更全面和深入的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务。
后因组时代中功能基因组(Functional Genomics)的研究采用一些新的技术，如微阵列，DNA芯片对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。
大学生物化学实验
生物化学实验安排实验一蛋白质及氨基酸的呈色反应一、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、实验原理1. 双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。
2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。
3.苯环的黄色反应Tyr+ 浓硝酸黄色TrpPhe+少量浓硫酸+浓硝酸黄色4. 乙醛酸的反应：检测Trp或含Trp蛋白质的反应。
当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中滴加时，产生分层现象，界面出现紫色环。
主要是由于蛋白质中的吲哚环作用。
5. 偶氮反应偶氮化合物都含有-N=N-这样结构，通常作为染料。
6. 醋酸铅反应()↓--→+--+Pb COO NH Pb COOH N H 2222Pr Pr三、实验步骤1. 双缩脲反应(biuret reaction)取1支试管，加乳蛋白溶液（蛋清：水= 1：9）约1ml 和10%NaOH 约2ml ，摇匀，再加1%CuSO4溶液2滴，随加随摇。
观察现象，记录。
2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction)（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液（蛋清：水= 1：9）和甘氨酸溶液1ml ，再各加0.5ml0.1%茚三酮，混匀，沸水浴中加热1-2分钟，观察颜色是否由粉红色变紫红色再变蓝色。
（2）在一块小滤纸上滴1滴0.5%的甘氨酸溶液，风干后再在原处滴1滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察是否有紫红色斑点的出现。
3. 苯环的黄色反应向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
鸡蛋清溶液（蛋清：水= 1：9）4. 乙醛酸的反应：向3个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
蛋白质溶液（蛋清：水= 1：20）5. 偶氮反应向3个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
分子生物学常用实验方法原理介绍
分子生物学常用实验方法原理介绍一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。
其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA 序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA 片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
实验记录-Western-Blot之蛋白的提取与定量
细胞蛋白的提取与测定蛋白提取原理：蛋白质是一切生命活动的承担者，为了研究及探索蛋白质的功能、特异性蛋白表达水平、翻译后修饰（甲基化磷酸化等）、蛋白-蛋白或蛋白-核酸之间相互作用的研究，进一步阐明众多疾病的机制，同时为疾病治疗提供理论依据，因此需要提取目的蛋白，由于蛋白质种类繁多，结构复杂，需要通过一些步骤使细胞裂解、杂志去除、蛋白纯化来得到目的蛋白。
一、贴壁细胞蛋白的提取：（所有操作均在冰上进行）准备相应数量的EP管标记后放放冰上备用1.裂解液制备：每1ml蛋白裂解液（RIPA）加入10ul蛋白酶抑制剂（如PMSF保护蛋白，使其免于被蛋白酶降解），配好后冰上备用；2.此处以6孔板为例，吸掉培养基后每孔加入1-2ml冰PBS溶液，清洗 2-3次，吸净残余BPS（如果有残留的话有可能使提取的蛋白稀释）；3.加入适当体积的裂解液，让裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min；4.裂解完成后，用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞及裂解液吸入离心管，放离心机4℃12000rpm 离心30min（离心机提前预冷），上清即为蛋白溶液，细胞碎片沉降于底部；5.蛋白提取完成后a.可放置于-20℃保存（长期保存放于-80℃）；b.可取出部分进行BCA 定量分析；c.做western blot，需要对蛋白进行变性处理后储存于-20℃或-80℃的冰箱中保存（根据蛋白变性条件不同有所不同，例如在100℃的高温下水浴锅煮5-10分钟）。
二、组织中总蛋白的提取：1.将已称重的冷冻组织（约50g）放入预冷好的研钵中，用研杵快速研磨组织，（有的需要加入液氮），直至组织被研磨成匀浆（无明显颗粒）；2.裂解液制备：取250ulRIPA裂解液+2.5ul 100mmol/L蛋白酶抑制剂+2.5ul蛋白酶抑制剂复合物Cocktail(多种小分子组成的抑制剂混合物能更好的保护蛋白不被蛋白酶降解)；3.取适量研磨的匀浆放入离心管，加入配好的裂解液，冰上孵育40min；4.离心：4℃ 12000rpm 离心15min 保留上清；5.将蛋白溶液防止于-20℃保存（长期保存放于-80℃）。
《生物化学与分子生物学》教学大纲全文
可编辑修改精选全文完整版《生物化学与分子生物学》教学大纲《生物化学与分子生物学》I 前言生物化学与分子生物学是研究生命化学的科学，它在分子水平探讨生命的本质，即研究生物体的分子结构与功能、物质代谢与调节、及其在生命活动中的作用。
由于生物化学与分子生物学越来越多地成为生命科学的共同语言，当今生物化学与分子生物学已成为生命科学领域的前沿学科。
生物化学与分子生物学的教学任务主要是介绍生物化学与分子生物学的基本知识，以及某些与医学相关的生物化学进展，包括生物大分子的结构与功能（蛋白质、核酸、酶），物质代谢及其调节（糖、脂、氨基酸、核苷酸代谢、物质代谢的联系与调节）；基因信息的传递（DNA复制、RNA转录、蛋白质生物合成、基因表达调控、重组DNA与基因工程）；相关的专题知识（细胞信息转导，血液的生物化学，肝的生物化学，维生素与微量元素，常用分子生物学技术的原理及其应用，基因组学与医学）。
本大纲适合于五年制临床医学、口腔、医学检验、影像、麻醉等专业使用，现将大纲使用中有关问题说明如下：一本大纲配套使用的教材为全国高等医学院校规划教材《生物化学》（案例版）第1版（刘新光主编）。
二本大纲内容按“掌握、熟悉、了解”三级要求学习及掌握。
其中，考试内容中“掌握”占70%左右；“熟悉、了解”的内容占30%左右。
“掌握”部分要求理解透彻，包括有关概念及其研究进展等内容细节，并能运用其理论及概念于相关学科的学习及今后的临床及科研工作；“熟悉”部分要求能熟知其相关内容的概念及有关理论，并能适当应用；“了解”部分要求能对其中的概念有一定认识，对相关内容有所了解。
三总教学参考学时为125学时，理论与实验比值约为2:1，即讲授理论学时为85学时（第一部分为生物化学部分，48学时；第二部分为分子生物学部分，37学时），实验学时为40学时。
II 正文第一部分生物化学第1章绪论熟悉“生物化学”的概念及其与“分子生物学”的关系。
了解生物化学的发展简史、当代生物化学研究的主要内容及生物化学与医学的紧密联系。
蛋白质分子设计[详细讲解]
![蛋白质分子设计[详细讲解]](https://img.taocdn.com/s3/m/cb55571cba68a98271fe910ef12d2af90242a891.png)
蛋白质分子设计[引言]蛋白质是一类非常有用的物质，在生物体的进化过程中起着非常重要的作用。
与其它化学试剂比较：（1）分子量非常大；（2）在机体内稳定；（3）专一性的优劣。
分子生物学的发展弥补了上述缺点，如定位突变、PCR使蛋白质可能工程化生产。
蛋白质设计（蛋白质的结构、功能预测）涉及多学科的交叉领域，包括材料学、化学、生物学、物理及计算机学科。
其应用范围涵盖了药物、食品工业中的酶、污水处理、疫苗、化学传感器等，设计的蛋白质也不仅仅限于20种天然氨基酸，也包括非天然氨基酸、有机/无机模块。
蛋白质设计的目的：（1）为蛋白质工程提供指导性信息；（2）探索蛋白质的折叠机理。
蛋白质设计分类：（1）基于天然蛋白质结构的分子设计；（2）蛋白质从头设计。
存在问题：与天然蛋白质比较：（1）缺乏结构独特性；（2）缺乏明显的功能优越性。
第一节基于天然蛋白质结构的分子设计一、概述蛋白质结构与功能的认识对蛋白质设计至关重要，需要多学科的配合。
蛋白质设计循环如下：1．对要求的活性进行筛选。
2．对蛋白质进行表征，如测定序列、三维结构、稳定性及催化活性。
3．专一型突变产物。
4．计算机模拟。
5．蛋白质的三维结构。
在PDB中搜索，无纪录即进行X射线、NMR方法或预测并构建三维结构模型。
6．蛋白质结构与功能的关系。
蛋白质突变体设计的三个主要步骤：1．突变位点和替换氨基酸的确定。
（1）确定对蛋白质折叠敏感的区域。
（2）功能上的重要位置。
（3）其它位置对蛋白质突变体的影响。
（4）替换或加减残基对结构特征的影响。
2．能量优化和蛋白质动力学方法预测修饰后蛋白质的结构。
3．预测结构与原始蛋白质结构比较，预测新蛋白质性质。
上述设计工作完成后，再进行蛋白质合成或突变实验，分离、纯化并对新蛋白质定性。
二、蛋白质设计原理1．内核假设。
假设蛋白质独特的折叠形式主要由蛋白质内核中的残基相互作用决定。
所谓内核指蛋白质在进化过程中的保守区域，由氢键连接的二级结构单元组成。
细胞总蛋白的制备, SDS-PAGE,Western Blot
医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot一、实验目的1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术二、实验原理1. 蛋白质提取常见裂解方法极其原理。
蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。
血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。
细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。
膜蛋白的抽提比较复杂。
膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。
外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。
固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。
在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。
较为理想的增溶剂是去垢剂。
目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。
增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。
纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。
抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶活力，以减少细胞的自溶过程。
主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。
常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。
2. Lowry法测定蛋白质浓度1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物；2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线3.SDS-PAGE分离蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。
蛋白质分子设计
疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及 不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力
蛋白质分子设计原理
金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。要 求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂 分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。
有机磷农药的长期广泛使用 已经使很多水体及土壤被严重 污染，而且直接影响到人们的 身体健康。
敌敌畏、对硫磷（1605）、 甲拌磷（ 3911）、内吸磷 （1059）、乐果、敌百虫、 马拉硫磷（4049）
例：甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase, MPH ）结构和功能的研究
• 二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即 “中改”。
一、定位突变
基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小 改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个 残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白 质工程中最广泛使用的方法，主要可分为 蛋白质修饰 和 基因定位突变 两类。
（一）定位突变的设计目标及解决方法
定位突变常见的设计目标： 提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低
• 1．活性设计 • 2．对专一性的设计 • 3．Scaffold设计(框架) • 4．疏水基团与亲水基团需合理分布 • 5．最优的氨基酸侧链几何排列
蛋白质分子设计原理
内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内 核中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）
Pr内部都是密堆积（很少有空穴大到水分子可以结 合一个水分子或惰性气体），没有重叠
2、三级结构的确定性较差
第一节 蛋白质分子设计原理
计算机模拟
基因构建
蛋白质变质一级结构变化-概述说明以及解释
蛋白质变质一级结构变化-概述说明以及解释1.引言1.1 概述蛋白质是生命体内最为重要的有机化合物之一，对维持生命的正常功能起着至关重要的作用。
蛋白质的结构可分为四个级别：一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。
其中，一级结构是指蛋白质中氨基酸的线性排列顺序，也被称为氨基酸序列。
蛋白质一级结构的变化是指其氨基酸序列的改变，这可能是由于突变、突变累积、修饰等因素导致的。
蛋白质一级结构的变化对蛋白质的功能和性质产生重要影响。
正因为如此，研究蛋白质一级结构变化的影响因素以及其对蛋白质功能的影响，对于深入理解蛋白质的结构与功能具有重要意义。
本文将首先介绍蛋白质一级结构的定义和重要性，然后探讨蛋白质一级结构变化的影响因素，最后总结蛋白质一级结构变化的重要性并展望其未来的研究方向。
通过对蛋白质一级结构变化的深入研究，我们可以更好地理解蛋白质的结构与功能之间的关系，为相关领域的科研和应用提供有益的指导。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以是文章的章节组织和内容安排。
文章结构部分内容示例：文章结构部分旨在介绍本篇文章的章节组织和内容安排，以帮助读者更好地理解整个文章的整体框架。
本篇文章共分为引言、正文和结论三个主要部分。
首先，引言部分主要包括以下三个方面内容：概述、文章结构和目的。
在概述中，会简要说明蛋白质变质一级结构变化的背景和重要性。
在文章结构部分，我们将详细介绍文章的章节组织和内容安排。
最后，在目的部分，我们将明确本篇文章的研究目的和意义。
接下来，正文部分是本篇文章的核心内容。
在正文部分的第2.1节中，我们将对蛋白质一级结构的定义和重要性进行详细阐述，为后续的内容提供基础知识。
在第2.2节中，我们将探讨蛋白质一级结构变化的影响因素。
通过对蛋白质一级结构变化的原因和机制的探究，可以更好地理解其对蛋白质功能和稳定性的影响。
最后，结论部分总结了蛋白质一级结构变化的重要性，并展望了未来蛋白质一级结构变化研究的方向。
第四讲蛋白质的化学修饰(共94张PPT)
二、确定修饰程度和修饰部位
通过对被修饰蛋白质的降解和氨基酸分析后鉴定修饰部 位。
通过纯化被修饰蛋白质的氨基酸及其衍生物，测定其同位素标 记量或光谱强度或顺磁共振谱或荧光标记量等来确定反应程度 。
一般认为：测定被修饰的氨基酸，要比测定氨基酸的减少 量更准确。
三、化学修饰数据的分析
⒈化学修饰的时间进程曲线 以修饰时间对蛋白质活性作图
蛋白质构象改变会导致微区极性的局部改变，这 种改变对
Trp，Met和Cys的反应性影响最小; 对氨基和咪唑基的反应性影响较大; 而对Tyr，Hcys和COOH的反应性影响最大
。此外，极性的变化也影响到反应类型。
⑵氢键效应
氢键对维持天然蛋白质及其离子稳定性有重要影响， 氢键的变化也可能导致pK发生改变。
S er O H
O H O C C H 2 C H 2
N O 2
⑸局部环境的极性
溶剂极性可能与反应速度有关，如下表：
反应类型
降低极性对速度的影响
⒈RSR+ICH2CONH2
[R2S+CH2CONH2]I- 适当或大大降低
⒉RSR+H2O2
R2SO+H2O
没有影响
⒊RS-+ ICH2CONH2
⒈试剂选择
不同实验，对修饰的专一性要求也不同，因此选择试剂在很大程 度上要依赖修饰目的。
例如，对氨基的修饰，仅修饰氨基；仅修饰α-氨基；修饰暴露的 或反应性高的氨基。
一般通过选择试剂和反应条件来控制修饰的部位和程度
•如果希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，应该选择能引入最大
电荷量的试剂。
•例如用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性条件下带正电荷的氨基转变成
蛋白质的生物合成与修饰
01
蛋白质生物合成概述
蛋白质生物合成的重要性
维持生命活动
蛋白质是生物体结构和功能的基 础，参与细胞代谢、信号传导、 免疫应答等生命活动。
肽键的形成
通过转肽反应，新加载的氨基酸与前一个氨基酸形成肽键，使肽链不 断延伸。
肽链合成的终止和释放
终止阶段
当遇到终止密码子时，释放因子识别并与之结合，导致肽链合成 的终止。
肽链的释放
在释放因子的作用下，完成合成的肽链从核糖体上释放出来。
后续修饰
释放后的肽链可能还需要经过一系列的修饰和加工，如剪切、折叠、 磷酸化等，才能成为具有生物活性的蛋白质。
合形成活化形式的过程。
活化反应的机制
02
氨基酸活化通常涉及与ATP等核苷酸的反应，形成氨酰-AMP等
中间产物，再进一步与特定tRNA结合。
活化反应的意义
03
活化后的氨基酸才能被用于蛋白质的生物合成，保证合成过程
的顺利进行。
tRNA的转运机制
tRNA的结构与功能
tRNA是一种小分子RNA，具有特定的三叶草结构，能够识别并 携带特定的氨基酸。
合成生物学
利用合成生物学技术设计和构建人工生物系统，实现高效、 可持续的蛋白质生产。
01
精准医疗
基于蛋白质生物合成的精准医疗将实现 个性化诊断和治疗，提高医疗效果。
02
03
伦理与法规
随着蛋白质生物合成技术的不断发展， 相关伦理和法规问题也日益凸显，需 要加强监管和公众科普教育。
THANKS
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修饰
蛋白修饰分析报告
蛋白修饰分析报告1. 引言蛋白修饰是生物体内一种重要的生物化学过程，通过改变蛋白质的结构或功能来调节细胞内的信号传导、代谢活性和基因表达。
蛋白修饰可以发生在蛋白质的氨基酸残基上，常见的修饰类型包括磷酸化、甲基化、乙酰化等。
本文将介绍蛋白质修饰的分析方法和步骤。
2. 磷酸化分析磷酸化是蛋白质修饰中常见的一种类型，通过酶催化将磷酸基团添加到蛋白质的氨基酸残基上。
磷酸化的分析可以采用质谱法进行。
以下是磷酸化分析的步骤：•样品制备：将待分析的蛋白质样品提取出来并纯化，以得到高纯度的样品。
•消化降解：使用特定的酶对蛋白质进行消化降解，以获得适合质谱分析的肽段。
•液相色谱分离：将消化后的样品通过液相色谱进行分离，以分离出不同的肽段。
•质谱分析：将分离出的肽段通过质谱仪进行分析，其中包括质量/电荷比（m/z）的测定和碎片谱的记录。
•数据分析：对质谱数据进行分析，通过数据库查询和标准库匹配来鉴定磷酸化位点。
3. 甲基化分析甲基化是蛋白质修饰中另一种常见类型，通过酶催化将甲基基团添加到蛋白质的氨基酸残基上。
甲基化的分析同样可以采用质谱法进行。
以下是甲基化分析的步骤：•样品制备：将待分析的蛋白质样品提取出来并纯化，以得到高纯度的样品。
•消化降解：使用特定的酶对蛋白质进行消化降解，以获得适合质谱分析的肽段。
•液相色谱分离：将消化后的样品通过液相色谱进行分离，以分离出不同的肽段。
•质谱分析：将分离出的肽段通过质谱仪进行分析，包括质量/电荷比（m/z）的测定和碎片谱的记录。
•数据分析：对质谱数据进行分析，通过数据库查询和标准库匹配来鉴定甲基化位点。
4. 乙酰化分析乙酰化是蛋白质修饰中的另一种常见类型，通过酶催化将乙酰基团添加到蛋白质的氨基酸残基上。
乙酰化的分析同样可以采用质谱法进行。
以下是乙酰化分析的步骤：•样品制备：将待分析的蛋白质样品提取出来并纯化，以得到高纯度的样品。
•消化降解：使用特定的酶对蛋白质进行消化降解，以获得适合质谱分析的肽段。
蛋白质组学主要技术简介
有机荧光团染料
包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者 最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等荧光染料。
这三种染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，
约30~60min完成，灵敏度为2~10ng。染色后的凝胶用
标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线 性范围为3个数量级。
聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。 过度聚焦会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋 白丢失。
最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长
度通过经验来确定。
4. IEF后胶条的平衡
一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在
两片塑料膜间于－80°保存数月。
德国Carl Zeiss公司PALM激光显微切割系统
第三代技术特点：
全自动系统，速度快 适应蛋白分析的需求
荧光激发模块
无接触的样品收集方式
•样品收集器可快速更换收集管 •多样品收集，可以通过软件控制自动选择样 品收集器的收集管
适用的组织样品
LCM优点和特性
快速简单、有效减少交叉污染 样品的切割与分离由激光一步完成，并可以保 持被分离的样品的完整性。 对制样的要求灵活多样，使用范围较广
但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以
便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而
在SDS-PAGE时电泳能顺利进行。
5. 胶条向第二向转移
将IEF后的胶条转移到垂直板聚丙烯酰胺上，
用1%的琼脂糖封闭，从而使胶条上的蛋白转
移到第二向分离胶中，根据分子量大小将pI接
近的蛋白进行进一步分离。
蛋白质工程论文
论文蛋白质工程——第二代遗传工程技术背景：目前,蛋白质工程技术日趋成熟,已经公认是第二代遗传工程技术。
美国加利福尼亚州的两个生物技术公司Genentech和Cetus在这个领域正处于领先地位。
工业上日益需要具有特殊性质的新的耐热、耐酸碱的稳定蛋白质。
酶是特殊类型的蛋白质,只能在较窄的条件(类似于产酶的动物或植物细胞内的条件)范围内起作用。
因此,酶很昂贵,容易变性。
要获得稳定酶,一个途径是蛋白质工程。
概念：中文名称：蛋白质工程英文名称：protein engineering定义1：按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。
包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。
为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功能，常对已知的其他蛋白质进行模式分析或采取分子进化等手段。
定义2：利用遗传工程手段，包括用基因的点突变和基因表达等改造蛋白质分子的结构与功能的技术。
蛋白质工程蛋白质工程，是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学，计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识通过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰，改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白质的技术。
研究内容：蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。
其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。
在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。
原理：蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。
可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。
由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。
蛋白质磷酸化修饰的研究进展_姜铮
doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2009．02．025综述蛋白质磷酸化修饰的研究进展姜铮，王芳，何湘，刘大伟，陈宣男，赵红庆，黄留玉，袁静中国人民解放军疾病预防控制研究所，北京100071［摘要］蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，它参与和调控生物体内的许多生命活动。
通过蛋白质的磷酸化与去磷酸化，调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程。
随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。
我们介绍了蛋白质磷酸化修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质分析样品的富集及制备、磷酸化蛋白的鉴定及磷酸化位点的预测、蛋白分离后磷酸化蛋白的检测，及蛋白质磷酸化的分子机制，并综述了近年来国内外的主要相关研究进展。
［关键词］磷酸化修饰；磷酸化蛋白鉴定；磷酸化位点检测［中图分类号］Q52［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2009)02－0233－05Progress on Protein／Peptide PhosphorylationJIANG Zheng,WANG Fang,HE Xiang,LIU Da－Wei,CHEN Xuan－Nan,ZHAO Hong－Qing,HUANG Liu－Yu,YUAN JingInstitute of Disease Control and Prevention,Academy of Military Medical Sciences,100071Beijing,China［Abstract］Phosphorylation is one of the most important post－translational modifications of proteins,which is related to many activities of life．By reversible protein phosphorylation eukaryotes control many cellular processes including signal transduction,gene expression,and the cell cycle etc．As the development and application of the proteomics,the studies of the protein phosphorylation have become more important．This article has introduced the main types and functions of the protein phosphorylation,the enrichment and preparation of phosphoproteins and phosphopeptides,the identification of the phosphopeptides,the determination and prediction of the specific－phosphorylation－site,the phosphorelated modifications of the proteins,and the progress on studies above as well．［Key words］phosphorelated modifications;identification of the phosphopeptides;determination of the specific－phosphory-lation－site几乎所有的蛋白质在合成过程中或合成后都要经过某些形式的翻译后修饰，一些不合适的修饰常常与疾病相关，某些特定的翻译后修饰还被作为疾病的生物标志或治疗的靶标。
生物化学与分子生物学课程标准
《生物化学与分子生物学》课程标准二、课程性质、地位和目标（一）课程性质、地位《生物化学与分子生物学》是我校医学生必修的基础医学课程，近二十多年来分子生物学迅速崛起，极大的提高了人们对生命本质的认识，也大大促进了其他学科的发展，本课程要探讨的是最深入、最微观、最基础和最前沿的知识，主要研究生物体的分子结构与功能、物质代谢与调节及其在生命活动中的作用，为学习其它基础医学和临床医学课程、在分子水平上认识病因和发病机理、诊断和防止疾病奠定扎实的基础，是学习基础医学、临床医学和军事医学课程的必备课程，在医学人才培养中具有不可代替的作用。
（二）课程目标通过本课程的学习，使学员掌握人体的化学组成、重要生命物质的结构和物质代谢的基本规律，以及物质结构、代谢与生命活动的联系；掌握基因信息的传递、表达，了解其调控及基因诊断、基因治疗和基因工程等领域的基本理论和基本技术，为其它后续课程的学习及今后的发展提高打好基础。
三、内容标准绪论[教学目标]了解：生物化学与分子生物学的发展简史。
理解：1. 解释生物化学与分子生物学的概念，阐述生物化学与分子生物学基本内容。
2. 比较生物化学与分子生物学与其他生命学科的关系，说明其在现代医学发展中的地位和作用。
应用：能使用生物化学与分子生物学的学习方法。
[重点难点]重点：生物化学与分子生物学的概念及基本内容。
难点：在现代医学发展中的地位和作用。
[学时分配] 1学时第一篇生物大分子的结构与功能第一章蛋白质的结构与功能[教学目标]了解：1. 描述肽单元和分子伴侣。
2. 举例几种重要的生物活性肽。
3. 描述多肽链中氨基酸序列分析的原理（自学）。
4. 描述蛋白质空间结构预测的原理和意义（自学）。
5. 描述蛋白质的沉淀，等电点沉淀，凝胶过滤，超滤和超速离心。
6. 说出蛋白质的分类。
理解：1. 说明蛋白质的元素组成特点，解释氨基酸的结构通式和氨基酸的分类，熟记氨基酸三字和一字英文缩写符号。
2. 解释肽、肽键与肽链和生物活性肽的概念，说明多肽链的书写规则。
高三化学蛋白质教案(精选3篇)
高三化学蛋白质教案（精选3篇）1. 高三化学蛋白质教案-蛋白质的结构与性质教学目标：- 了解蛋白质的结构特点和分类；- 掌握蛋白质的氨基酸组成和多肽链的形成；- 了解蛋白质的性质及其在生物体内的重要作用。
教学重点：- 蛋白质的结构和分类；- 蛋白质的性质和作用。
教学难点：- 蛋白质的多种结构形式及其功能。
教学过程：1.导入（5分钟）- 提问：你们知道蛋白质是什么吗？蛋白质在生物体内有什么作用？- 学生回答。
2.理论讲解（20分钟）- 讲解蛋白质的结构特点和分类；- 讲解蛋白质的氨基酸组成和多肽链的形成；- 讲解蛋白质的性质及其在生物体内的重要作用。
3.实验演示（10分钟）- 进行鸡蛋蛋白和热处理后的鸡蛋蛋白的比色实验，观察蛋白质变性的现象；- 分析观察结果。
4.练习与讨论（15分钟）- 练习：阅读材料，回答相关问题；- 讨论：请学生讨论蛋白质的结构与功能之间的关系。
5.总结（5分钟）- 请学生总结今天所学的内容；- 总结蛋白质的结构特点和分类，以及蛋白质的性质和作用。
6.布置作业（5分钟）- 布置相关的练习题，进行巩固和拓展。
2. 高三化学蛋白质教案-蛋白质合成与调控教学目标：- 了解蛋白质合成的基本过程；- 掌握蛋白质合成的调控机制；- 了解蛋白质合成在细胞中的重要作用。
教学重点：- 蛋白质合成的基本过程；- 蛋白质合成的调控机制；- 蛋白质合成的作用。
教学难点：- 蛋白质合成的调控机制。
教学过程：1.导入（5分钟）- 复习前一节课所学的蛋白质的结构和分类；- 引出本节内容。
2.理论讲解（25分钟）- 讲解蛋白质合成的基本过程；- 讲解蛋白质合成的调控机制；- 讲解蛋白质合成在细胞中的重要作用。
3.案例分析（15分钟）- 分析一个案例，让学生思考蛋白质合成的调控机制；- 学生进行小组讨论。
4.实验设计（10分钟）- 设计一个实验，观察蛋白质合成的过程；- 讨论实验步骤和结果。
5.总结（5分钟）- 请学生总结今天所学的内容；- 总结蛋白质合成的基本过程和调控机制。
蛋白降解测的指标
蛋白降解测的指标1.引言1.1 概述蛋白降解是生物体内一种重要的生化过程，它涉及到蛋白质的降解与清除。
在细胞运作、代谢调控以及生物发育过程中，蛋白降解起着至关重要的作用。
随着对蛋白降解认识的不断深入，人们对于蛋白降解过程中的指标也越来越关注。
蛋白降解测的指标是用来评估蛋白质降解过程的衡量标准，它可以揭示蛋白降解的速度、程度和效率等重要信息。
通过对这些指标的研究和分析，可以更好地了解蛋白降解的机制、调控和功能，从而为疾病治疗、生物技术研究等领域提供理论支持和实践指导。
蛋白降解测的指标具有多样性和复杂性。
常见的指标包括蛋白质的半衰期、蛋白酶的活性、蛋白质降解产物的种类和数量等。
通过这些指标的测定和分析，可以对蛋白降解过程进行全面而深入的评估，帮助科研人员更好地理解蛋白降解的本质和特点。
在本文中，我们将重点介绍蛋白降解测的指标的意义和应用前景。
通过对这些指标的深入探究，我们将更好地了解蛋白降解的重要性以及其在不同领域中的应用价值。
同时，我们也将探讨当前蛋白降解测的指标研究中存在的挑战和问题，以期为未来的研究提供一定的启示和参考。
1.2文章结构文章结构是指文章所采用的组织方式和内容分布方式。
一个良好的文章结构能够使读者更容易理解文章的主题和内容，同时也有助于作者更好地表达自己的观点和论据。
在本篇长文中，文章结构包括引言、正文和结论，每个部分都有其独特的目的和特点。
下面将详细介绍每个部分的内容。
引言部分是文章的开头，旨在引起读者的兴趣并明确文章的主题和目的。
在引言的概述部分，可以简单介绍蛋白降解测的指标这个主题，并提供一些背景信息，如该领域的研究重要性和发展现状。
接着，可以说明本文将要探讨的问题和目标，即蛋白降解测的指标的意义和应用前景。
正文部分是文章的核心内容，将对蛋白降解的重要性和机制进行详细讲解。
在2.1节中，可以阐述蛋白降解在生物体中的重要作用，如维持细胞稳态、调节细胞周期和响应环境压力等。
同时，可以介绍一些相关的研究成果和案例，以支持这一观点。
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Ubiquitin (泛素）
泛素由76个氨基酸残基组成，其中包括7个赖氨酸残基(K), 其C末端可与 底物的赖氨酸残基形成异肽键，从而引起底物泛素化。泛素的K11、K29 、K48和K63均能参与形成泛素与泛素间的异肽键 (Isopeptide bond)。 The C-terminal glycine 76 (Gly76) was identified to attach to the lysine site of protein substrate during ubiquitination 。
失调蛋白
底物
修饰
肿瘤类别
———————————————————————————————————————— SKP2 p27 (KIP) Polyubiquitylation Malignant melanoma MDM2 p53 Polyubiquitylation Non-small-cell lung cancer, soft-tissue carcinoma, colorectal cancer HAUSP p53, MDM2 De-ubiquitylation Non-small-cell lung cancer lymphoma APC Cyclin B, Polyubiquitylation Colorectal cancer securin FANCL FANCD2 Monoubiquitylation Fanconi anaemia-related cancers CYLD IKKγ De-ubiquitylation Cylindromatosis IAP2 BCL10 Polyubiquitylation MALT lymphomas CBL RTKs HIF Multiple monoubiquitylation Polyubiquitination Lymphoma, AML and gastric carcinoma von Hippel-Lindau disease
泛素化途径的异常与人类重大疾病
• 神经退行性疾病（如帕金森氏症）： Parkin, UCH-L1 • 癌症: BRCA1, CYLD, Mdm2, Nrdp1, pVHL • 传染病病原体的入侵、致病机制: E6-AP
泛素化失调与肿瘤
—————————————————————————————————————————
b1
a4
a2
a1
11 S ‗alternative‘ Proteasome cap
REGa, REGb, REGg
20S Proteasome
a b
a7’ a6’ b1 b 7’ b 6’ b 5’ b2 b3 b4 a1 a2 a7 a6 a5 a4
a5’
a4’
a3
A barrel-shaped cylinder composed of four stacked rings. Each ring contains seven distinct polypeptide subunits
The Protein Degradation Systems in Cells
1. 溶酶体 (Lysosomes) Non-selective
Hydrolyze proteins from autophagy Digest proteins from endocytosis/Autophagy Membrane proteins Extracellular proteins
Ub E1 Ub-E2 底物
ATP
E3
AMP+PPi
-E1 Ub
E2
蛋白酶体
Ub: 泛素 (Ubiquitin)，一高度保守的，由76个氨基酸组成的多肽。 E1: 泛素激活酶 (Ubiquitin-activating enzyme)，人类仅有2种E1。 E2: 泛素载体蛋白 (Ubiquitin-carrier protein)， 人类约有 30 种E2s。 E3: 泛素－蛋白连接酶 (Ubiquitin-protein ligase)， 人类有1000多种E3s 。
Three of the seven b-subunits have functional threonine protease sites, each generating different proteolytic activities
b3
b5
Chymotypsin-like
泛素－蛋白酶体通路
泛素化(ubiquitination)即蛋白质被泛素 (ubiquitin，由76个氨基酸组成的多肽）共价 修饰的过程，在几乎所有的真核细胞活动中 起着关键作用。泛素 –蛋白酶体(proteasome) 通路则是真核细胞内最主要的蛋白质降解途 径。泛素化调控的细胞活动至少包括: 细胞周期（Cell cycle progression） 细胞凋亡（Apoptosis） 转录调控（Transcriptional regulation） DNA修复（DNA repair） 免疫应答（Immune response） 蛋白质降解及质量控制（Protein degradation and quality control )
蛋白质降解和修饰 的理论与实验
生化与分子生物学技术与原理
（华东师范大学研究生课程）
李晓涛 教授
2016年12月4日
Overview
Principle and assays for protein degradation ----Protein degradation systems ----Brief introduction of assays Principle and assays for protein modification ----Ubiquitination ----Sumoylation ----Autophagy
3. 非泛素-蛋白酶体通路
Immunoproteasome REGgamma dependent protein degradation
Selective and ATP-independent
Proteasomes are responsible for degradation of most cellular proteins
pVHL
—————————————————————————————————————————
泛素连接酶Mdm2和E6-AP与p53的降解和癌症
宫颈癌
人乳头瘤病毒（HPV）
HeLa
11S proteasome activator ( consist of REG or PA28 a, b or g)-binds to the a rings of the 20S proteasome, enhancing proteolytic activity in an ATP- and ubiquitin- independent manner. Immunoproteasome (PA28a/b) – In response to interferon-g, the b1, b2, and b5 subunits are replaced during proteasome de novo biogenesis by b1i (LMP2), b2i (MECL1), and b5i (LMP7) to form the immunoproteasome. PA28a/b complex-a hetero-oligomer complex; interferon-g inducible; nuclear and cytosol localization; function: antigen processing. PA28g complex-a homo-oligomer complex; non-interferon-g inducible; nuclear localization; cellular targets: SRC-3, p21, HCVcore protein.
Proteasome core
19 S Proteasome cap
Rpn6 Rpn11Rpn12 Rpn3 Rpn9 Rpn8 Lid Rpn5 Rpn7 Rpn10
b5 b6 b7 a7 a6 a5
Base
a1 b1 b4 a2 b2 b3 a3 a3 b3 b2 a4 b4
Rpn1
Rpn2
Rpt1Rpt2 Rpt6 Rpt4 Rpt5 Rpt3
The 26S proteasome is a multisubunit complex, consisting of the 20S catalytic particle and the 19S regulatory particle, and selectively degrades ubiquitinated proteins in the presence of ATP. Upon immune responses, cells generate special types of proteasomes, immunoproteasomes, which possess distinct regulatory particle (11S ) and catalytic particle (with different catalytic subunits), for more efficient antigen presentation. Novel protein degradation short-cut pathway was recently disclosed. A representative is the REGgamma-mediated protein degradation.
篇数
年份
蛋白质泛素化研究简史