抗狂犬病血清效价测定法
狂犬病、破伤风人免疫血浆抗体效价检测分析
狂犬病、破伤风人免疫血浆抗体效价检测分析雷静;程郁菁;王川;陈鄂湘;喻剑虹;李璞【摘要】为了解原料血浆中抗体水平,为狂犬病、破伤风抗体效价测定提供依据,同时为提高血浆站的抗体效价提供依据,进而提高狂免、破免产品的生产质量,本文对2015—2017年血浆站的狂犬病、破伤风抗体效价检测结果进行三年数据对比,采用ELISA法检测人血浆中狂犬病、破伤风的抗体效价,用柱状图分析各血浆站抗体效价9IU/mL以上、6~9IU/mL血浆所占百分比。
结果表明,破免血浆检测量逐年增多,2017年比2015年增长了103%,其中高效价血浆量也在逐年上升。
狂免血浆检测量2016年和2017年均比2015年下降了32%,其中高效价的血浆量逐年降低。
【期刊名称】《生物化工》【年(卷),期】2018(004)006【总页数】3页(P28-30)【关键词】狂犬病;破伤风;抗体效价;ELISA法【作者】雷静;程郁菁;王川;陈鄂湘;喻剑虹;李璞【作者单位】[1]国药集团武汉血液制品有限公司,湖北武汉430207;[1]国药集团武汉血液制品有限公司,湖北武汉430207;[1]国药集团武汉血液制品有限公司,湖北武汉430207;[1]国药集团武汉血液制品有限公司,湖北武汉430207;[1]国药集团武汉血液制品有限公司,湖北武汉430207;[1]国药集团武汉血液制品有限公司,湖北武汉430207;【正文语种】中文【中图分类】R446.6破伤风是由破伤风杆菌侵入人体伤口造成的一种特异性感染，是致死性传染病，其高毒力的痉挛毒素可阻断中枢神经系统的抑制性神经递质，引起肌肉强直和典型的全身痉挛[1]。
破伤风抗毒素（TAT）是由马血清制成的，部分人会出现过敏反应，而破伤风人免疫球蛋白（TIG）是人血制品，基本没有过敏反应。
破伤风人免疫球蛋白主要用于预防和治疗破伤风，尤其适用于对破伤风抗毒素（TAT）有过敏反应者。
狂犬病毒转移的发生起源于被感染宿主的伤口，引起咬伤伤口处唾液病毒的沉积。
抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂的制备
Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ ｃｏｎ．ｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｔｅｍｌｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｋｉｔ
ｗａｓ
ｔｌｌａｔ ｂｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ
ｔｅｓｔ
ｗａｓ
ｓｔｕｄｉｅｄ．
Ｒ鹳ｕｌｔｓ
Ｔｈｅ
ｗａｓ
ｃｏ—
ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ—ｒａｂｉｅｓ ｖｉｎｌｓ ＩｇＹ
层析柱，收集第１峰，作为免疫原，加弗氏佐剂，免疫
健康家兔。双向琼脂扩散效价≥１：３２时，颈动脉
采血，分离血清。用过碘酸钠改良法制备ＨＲＰ标记 的兔抗马ＩｇＧ，稀释成不同浓度１：５００、１：１
ｌ：１ ５００、１：２ ０００、１：２ ０００、
５００和１：３ ０００，用方阵滴
定法测定最适使用浓度。
１．８
应用１０、２０和４０恤ｇ／ｍｌ抗狂犬病病毒Ｉ“包
Ｏ．５７３ ｍｉｎ， ｒｎｏｌ／Ｌ Ｈ２ｓ０４
终止反应。在酶标仪上测定Ａ伽值，以Ｐ／Ｎ≥２．１
２．４灵敏度 经检测，试剂的灵敏度为Ｏ．０７２ ２．５特异性 经检测，小鼠、豚鼠、绵羊、家兔、小牛、人血清及
ＩＵ／ｌＩｌｌ。
ＩＵ／１１１ｌ开始倍比稀释，共５个稀释度，用本试
剂进行检测，以出现阳性的最高稀释倍数判定其灵 敏度。 １．１０特异性检测 将小鼠、豚鼠、绵羊、家兔、小牛、人血清（本所提 供）及ＩｇＹ（本所制备）共７份样品，从１：５０开始稀 释至１：ｌ ６００；抗狂犬病病毒马血清半成品（２０６ Ｉｕ／ｍ１） 从０．５７３ ＩＵ／ｍｌ开始、抗狂犬病病毒马血清（中和 指数为６ ０００）从１：２ ０００开始，均稀释至１：１６ 用本试剂测定Ａ伽值，判定其特异性。 １．１１精密性检测 １．１１．１批问精密性：用３批试剂检测１２份样品，
改良抗体结合实验检测灭活狂犬病疫苗效价
［ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ ０ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ：Ｔ ｏ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ａ ｍ ｏ ｄ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ｂ ｉ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ｔ ｅ ｓ ｔ （ Ｍ— Ａ Ｂ Ｔ ）ｆ ｏ ｒ ｐ ｏ ｔ ｅ ｎ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ ｔ ｉ ｎ ｇ ｏ ｆ ｒ ａ ｂ ｉ ｅ ｓ ｖ ａ ｃ ｃ ｉ ｎ ｅ
技 术 方 法
改 良抗体 结合 实验 检 测 灭 活狂 犬 病 疫 苗效 价
陈继军 ， 马超 ， 秦海 燕 ， 马瑞， 毛 晓燕
兰州生物制品研 究所有 限公 司， 甘 肃 兰州 ７ ３ ０ ０ ４ ６ ［ 摘要 ］ 目的 ： 建立抗体 结合 试验 检测狂犬病疫苗（ ａ Ｇ株 ） 效价的方法。方 法： 将待检测疫苗 与疫苗标准 品梯度稀释
ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ Ｃ ＶＳ —ｌ １ ｆ ｏｒ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｎ ｅ ｕ ｔ ｒ ａ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ，ｔ ｈ ｅ ｎ ｉ ｎ ｏ ｃ ｕ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ ＢＳ Ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ 。ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｄ ｆ ｏ ｒ ２ ４ ｈ ，Ｓ Ｕ ｂ ｉ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｔ ｏ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ —
时与小 鼠中和试 验法（ Ｎ Ｉ Ｈ法 ） 测定狂犬病疫 苗效价进 行 比较。结果 ： ２ 种方法对 ８ 个样 品效价 的检 测结果无显著统 计学差异（ Ｐ ＝ ０ 。 ９ ９ ７ ， 配对 ｔ 检验） 。结论 ： 初 步建 立 了改 良抗体结合试验 ， 可用于狂犬病疫苗 中间产 品的质量控制 。 ［ 关键词 ］ 狂犬病疫苗； 改良抗体结合试验； 效价 ［ 中图分类号 ］ Ｒ ３ ９ ２ ． １ ［ 文献标识码］ Ａ ［ 文章编号 ］ １ ０ ０ ９ — ０ ０ ０ ２ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ４ — ０ ５ ５ ４ — ０ ３
抗狂犬病血清
抗狂犬病血清Kangkuangquanbing XueqingRabies Antiserum本品系由狂犬病病毒固定毒免疫马所得的血浆，经胃酶消化后纯化制得的液体抗狂犬病球蛋白制剂。
用于配合狂犬病疫苗预防狂犬病。
1基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2制造2.1抗原与佐剂应符合“免疫血清生产用马匹检疫和免疫规程”的规定。
2.2免疫动物及血浆2.2.1免疫动物免疫用马匹必须符合“免疫血清生产用马匹检疫和免疫规程”的规定。
2.2.2免疫、采血及分离血浆与分浆按“免疫血清生产用马匹检疫和免疫规程”的规定进行。
免疫血清效价用动物法或其他适宜的方法测定，不低于100IU/ml时，即可采血。
分离之血浆可加入适宜防腐剂，并应做无菌检查（附录Ⅻ A）。
2.3胃酶进行类A血型物质含量测定，应不高于4μg/ml（附录Ⅸ I）。
2.4原液2.4.1原料血浆原料血浆的抗狂犬病效价应不低于80IU/ml(附录Ⅺ J)。
血浆在保存期间，如发现明显的溶血、染菌及其他异常现象，不得用于制备。
2.4.2制备2.4.2.1消化将免疫血浆稀释后,加入适量胃酶及甲苯，调整适宜pH值后，在适宜温度下消化一定时间。
2.4.2.2纯化采用加温、硫酸铵盐析、明矾吸附等步骤进行纯化。
2.4.2.3浓缩、澄清及除菌过滤浓缩可采用超滤或硫酸铵沉淀法进行。
澄清及除菌过滤后，制品中可加入适量硫柳汞或间甲酚或三氯甲烷作为防腐剂。
纯化后的抗血清原液应置2～8℃避光保存至少1个月作为稳定期。
2.4.3原液检定按3.1项进行。
2.5半成品2.5.1配制将检定合格的原液，按成品规格以灭菌注射用水准确稀释，调整效价、蛋白质浓度、pH值及氯化钠含量，除菌过滤。
2.5.2半成品检定按3.2项进行。
2.6成品2.6.1分批应符合“生物制品分批规程”规定。
2.6.2分装应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.6.3规格每瓶2.0ml，含狂犬病抗体应不低于400IU；每瓶5.0ml，含狂犬病抗体应不低于1000IU。
抗狂犬病病毒中和抗体效价快速荧光灶抑制试验_RFFIT_的建概要
20世纪60年代初,WHO 开始推荐使用小鼠脑内中和法(Mouse neutralization test ,MNT 测定抗狂犬病病毒中和抗体。
但自80年代中期开始,发现MNT 法实验时间较长(至少需14d ,受动物质量、攻击病毒的滴度、实验人员的操作技术和经验等多种因素的影响,重复性、一致性和灵敏性均较差,而且需要使用大量动物,不符合国际上动物实验3R 的原则[1]。
为此,WHO 在许多国家实验的基础上,推荐快速、精确和重复性好的体外检测抗狂犬病病毒中和抗体的方法,即快速荧光灶抑制试验(Rapid flu -orescence focus inhibition test ,RFFIT 和荧光抗体病毒中和试验(Fluorescent antibody virus neutralizationtest ,FAVNT [2,3]。
本文对RFFIT 法与MNT 法的相关性进行了分析,现将结果报道如下。
作者单位:1中国药品生物制品检定所病毒一室(北京100050;2Institut Pasteur,Paris,France.通讯作者:董关木,E -mail :gmdong@中国图书分类号R392Q33文献标识码A 文章编号1004-5503(200911-1145-04【实验技术】抗狂犬病病毒中和抗体效价快速荧光灶抑制试验(RFFIT 的建立及应用吴小红1李加1唐建蓉1Herv éBourhy 2刘景华1曲效民1曹守春1董关木1【摘要】目的建立抗狂犬病病毒中和抗体效价的快速荧光灶抑制试验(RFFIT ,验证其与小鼠脑内中和法(MNT 的相关性,并用于马抗狂犬病病毒血清(ERIG 和人狂犬病免疫球蛋白(HRIG 及狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体效价的测定。
方法待测血清或免疫球蛋白在96孔板中作3倍系列稀释,与能感染80%~95%细胞量的攻击病毒混合后,37℃体外中和1h ,接种BSR 细胞,培养24h 后荧光染色,荧光显微镜下读取结果。
J抗狂犬病血清效价测定法
附录ⅪJ抗狂犬病血清效价测定法第一法小鼠中和试验法（仲裁法）本法系根据抗狂犬病血清能中和狂犬病病毒的作用，将供试品与标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液结合，小鼠脑内注射，在规定时间内观察小鼠存活和死亡情况，以测定供试品效价。
试剂（1）量取0.9%磷酸二氢钾溶液75ml、2.4%磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）溶液425ml、8.5%氯化钠溶液500ml，混合后加水至5000ml，调pH值至7.2～8.0。
于磷酸盐缓冲液98ml中，加入2ml灭能小牛血清，临用前配制。
（2）20％小牛血清磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)20.8g，加注射用水溶解并稀释至1000ml，溶解后过滤，调pH至7.6。
灭菌后pH值应为7.2～8.0。
于磷酸盐缓冲液80ml中，加入20ml灭能小牛血清，临用前配制。
中和用病毒悬液的制备（1）病毒悬液的制备取CVS毒种(一般为冻干毒种)制成10-2悬液，制法见本法（2）项，脑内接种体重10～12g小鼠每只0.03ml，待发病后取鼠脑再制成10-2悬液，接种于小鼠脑内进行传代，一般传2～3代。
选用第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液，按0.5ml分装安瓿,冻干后真空封口，制成冻干中和用病毒，-30℃冻存待用；或用第5天发病并麻痹的鼠脑用20%小牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10-1悬液，以每分钟2000转离心20分钟，取上清液混匀后分装小管，-70℃冻存待用。
（2）病毒悬液毒力的预测①冻干病毒的预测。
取含20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液1.0ml，吹打均匀后加入4.0ml 2%小牛血清磷酸盐缓冲液与病毒液充分混匀，以每分钟1500转离心10分钟，取上清液与等量的2%小牛血清磷酸盐缓冲液混合即为10-2悬液，然后再稀释至10-3、10-4、10-5、10-6，从10-6至10-2的稀释液中各取0.5ml置于5个小管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，置37℃水浴1小时。
研究狂犬病疫苗免疫后血清抗体检测结果
研究狂犬病疫苗免疫后血清抗体检测结果【摘要】目的：研究狂犬病疫苗免疫后血清抗体检测结果。
方法：选择本门诊中心于2018.10-2020.3月收治的540例被猫狗抓伤或者咬伤的患者，将所有患者进行狂犬疫苗的注射，全程共注射5针，在接种15天之后采用酶联免疫法检测患者的血清抗体水平。
结果：在接种狂犬疫苗后，540例患者中血清抗体阳性人数为528，抗体阳性率为97.78%，对于不同性别之间以及不同年龄之间的患者抗体阳性率无明显差异（P>0.05），无统计学意义。
结论：当患者在被猫狗抓伤或者咬伤后，及时接种狂犬疫苗后，患者的血清抗体转阳率比较高，并且对于不同年龄或者性别的患者抗体转阳率没有明显差异。
【关键字】狂犬疫苗；血清抗体监测；转阳率；狂犬病是一种由狂犬病毒所导致的具有急性传染的疾病，一般来说，狂犬病毒多存在于猫、狗、狼等犬类动物上，当人被具有携带狂犬病毒的犬类动物咬伤或者抓伤后，就会被传染上狂犬病，患者在患病后表现的症状主要有怕风、恐水以及偏瘫等，其中恐水的症状最为突出[1]。
在临床上，还没有效果特别好的治疗方法来治疗狂犬病，因此更多的是利用预防的方式来对其进行预防。
患者在受伤后，可以及时接种狂犬疫苗来进行预防，让身体中产生足够的抗体[2]。
本文中研究分析狂犬病疫苗的免疫效果，具体方法如下：1对象和方法1.1对象选取本门诊中心于2018.10-2020.3月收治的540例被猫狗抓伤或者咬伤的患者，其中男性患者有298例，女性患者有242例，年龄3-76岁，平均年龄42.15±2.44岁。
通过狂犬疫苗接种的规定为患者进行5针的狂犬疫苗接种。
在接种完成后的15天对患者的静脉血抽取3毫升，对其进行抗体的检测。
患者被犬类动物咬伤或者抓伤后，在患者受伤的当天、受伤3天后、受伤7天后、受伤14天后以及受伤的第28天后，各接种狂犬疫苗一剂，一共需要接种5针，若患者的咬伤程度比较严重，应该在咬伤的当天以及咬伤的第3天进行疫苗的加倍注射，在患者被咬伤的当天，可以用狂犬病免疫球蛋白侵润患者被咬伤的地方。
ELISA与RFFIT两种方法检测人狂犬病抗体的对比
ELISA与RFFIT两种方法检测人狂犬病抗体的对比熊春【摘要】【摘要】目的对比酶联免疫吸附试验（ELISA）与快速免疫荧光灶抑制试验（RFFIT）检测人狂犬病抗体的效果。
方法选取狂犬抗体疫苗接种者免疫后血清100份，分别随机选用ELISA与RFFIT检测。
结果免疫0 d、3 d、7 d、14 d和45 d时ELISA法检测阳性率分别为9.00%、12.00%、25.00%、48.00%、86.00%；RFFIT法检测阳性率分别为0.00%、0.00%、23.00%、100.00%、100.00%。
结论ELISA与RFFIT两种方法检测人狂犬病抗体均可适用于抗狂犬病毒抗体检测，但ELISA法免疫早期假阳性率较高，后期假阴性率较高。
【期刊名称】中国卫生标准管理【年(卷),期】2016(007)013【总页数】2【关键词】【关键词】人狂犬病抗体；ELISA；RFFITdoi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.13.099狂犬病是世界范围内广泛流行的人兽共患传染病，控制和消除人狂犬病的根本前提是防控动物狂犬病，而接种疫苗免疫预防是其重要的控制手段［1］。
衡量免疫效果的关键指标是动物或人接种狂犬病疫苗后的狂犬病中和抗体水平。
狂犬病疫苗免疫成功的关键是是否产生足够抗体，疫苗加强免疫的依据是抗体水平以及抗体持续时间［2］。
快速免疫荧光灶抑制试验（RFFIT）和酶联免疫吸附试验（ELISA）是检测抗狂犬病毒中和抗体水平的常用方法。
本研究对这两种检测方法结果进行了对比，报道如下。
1 材料与方法1.1 人血清选取2014年1月～2015年12月狂犬抗体疫苗接种者免疫后血清100份，分别随机选用ELISA与RFFIT检测。
1.2 ELISA法试剂盒为武汉生物制品研究所生产的狂犬病毒抗体ELISA测定试剂盒。
由专业人员按照试剂盒说明书进行严格操作。
血清抗体滴度≥0.5 EU/ml为抗体阳性。
冻干抗狂犬病血清
用法用量
用法：受伤部位应先进行处理。若伤口曾用其他化学药品处理过时，应冲洗干净。先在受伤部位进行浸润注 射，余下的血清进行肌内注射。（头部咬伤可注射于颈背部肌肉）。
用量：注射量均按体重计算，每1kg体重注射40IU（特别严重可酌情增至80～100IU），在1～2日内分次注射， 注射完毕后开始注射狂犬病疫苗。亦可同时注射狂犬病疫苗。
简介
冻干抗狂犬病血清拼音名：Donggan Kangkuangquanbing Xueqing 英文名：Lyophilized Antirabies Serum 本品系用狂犬病固定毒免疫的马血浆，经酶消化、盐析、冻干制成。
制法
照抗狂犬病血清项下的方法制备，灌装后立即冷冻干燥制成。
性状
本品为白色或乳白色的疏松体。加入规定量的灭菌注射用水，应在15分钟内溶解为无色或淡黄色的澄明液体。
3.使用抗血清须特别注意防止过敏反应。注射前必须做过敏试验并详细询问既往过敏史。凡本人及直系亲属 曾有支气管哮喘、枯草热、湿疹或血管神经性水肿等病史，或对某种物质过敏，或本人过去曾注射马血清制剂者， 均须特别提防过敏反应的发生。
（1）过敏试验：用氯化钠注射液将抗血清稀释10倍（0.1ml抗血清加0.9ml氯化钠注射液），在前掌侧皮内 注射0.05ml，观察30分钟。注射部位无明显反应者，即为阴性，可在严密观察下直接注射抗血清。如注射部位出 现皮丘增大、红肿、浸润，特别是形似伪足或有痒感者，为阳性反应，必须用脱敏进行注射。如注射局部反应特 别严重或伴有全身症状，如荨麻疹、鼻咽刺痒、喷嚏等，为强阳性反应，则应采用脱敏注射，并做好抢救准备， 一旦发生过敏休克，立即抢救。无过敏史者或过敏反应阴性者，也并非没有发生过敏休克的可能。为慎重起见， 可先注射小量于皮下进行试验，观察30分钟，无异常反应，再将全量注射于皮下或肌内。
精制抗狂犬病血清3效价IU测定方法
精制抗狂犬病血清3效价IU测定方法1 中和用病毒悬液的制备要求中和用病毒悬液经37℃水浴作用1小时的LD50在32～320之间。
1.1病毒株的选择：选用CVS毒种。
1.2 病毒株的传代：取CVS毒种（一般为冻干毒种）制成10-2悬液，脑内接种体重10～12g健康小白鼠0.03ml，待发病后取脑再制成10-2悬液，接种于小白鼠脑内进行传代，一般传至2～3代即可制成冻干中和用病毒或–70℃冻存的中和用病毒，但要选用小白鼠在第5天发病并麻痹的服制备。
1.3 冻干病毒的制备：用第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液，按0.5ml分装安瓿冻干后真空封口，存-30℃待用。
1.4-70℃冻存病毒的制备：用第5天发病并麻痹的鼠脑用20%小牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10-1悬液，经2000r/min20分钟沉淀，取上清混匀后分装小管，存-70℃冰箱待用。
1.5 病毒悬液的预测1.5.1冻干病毒的预测：取含20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入含2%小牛血清PBS1.0ml，吹打均匀后再用4.0ml上述稀释液与病毒液充分混匀，1500r/min沉淀10分钟，取上清与等量的稀释液混合则为10-2悬液，然后再用10-3、10-4、10-5、10-6稀释，从10-6至10-2各取0.5ml加入5个小管内，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，放置37℃水浴一小时。
用体重10~12g小白鼠30只，分成5组，每组6只，经用37℃作用的10-6至10-2病毒悬液接种小白鼠，每个稀释度接种6只小白鼠，每只小白鼠脑内接种0.03ml，观察14天，每天观察小白鼠发病死亡情况，接种后4天内死亡的小白鼠按非特异性死亡计。
以接种5天后的发病死亡小白鼠统计LD50。
1.5.2-70℃冻存病毒悬液的预测：取含10%脑悬液的冰冻病毒用流水融化后即为10-1悬液，然后再做10-2至10-7稀释。
从10-7至10-3各取0.5ml加至5个小管内，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，放置37℃水浴1小时，用体重10～12g小白鼠30只，分成5组，每组6只，用经37℃作用的10-7至10-3病毒悬液接种小白鼠，每个稀释度接种小白鼠6只，每只小白鼠脑内接种0.03ml，观察14天，每天观察小白鼠发病死亡情况。
抗狂犬病血清效价测定法
抗狂犬病血清效价测定法第一法小鼠中和试验法（仲裁法）本法系根据抗狂犬病血清能中和狂犬病病毒的作用，将供试品与标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液结合，小鼠脑内注射，在规定时间内观察小鼠存活和死亡情况，以测定供试品效价。
试剂（1）量取0.9%磷酸二氢钾溶液75ml、2.4%磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）溶液425ml、8.5%氯化钠溶液500ml，混合后加水至5000ml，调pH值至7.2～8.0。
于磷酸盐缓冲液98ml中，加入2ml灭能小牛血清，临用前配制。
（2）20％小牛血清磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)20.8g，加注射用水溶解并稀释至1000ml，溶解后过滤，调pH至7.6。
灭菌后pH值应为7.2～8.0。
于磷酸盐缓冲液80ml中，加入20ml灭能小牛血清，临用前配制。
中和用病毒悬液的制备（1）病毒悬液的制备取CVS毒种(一般为冻干毒种)制成10-2悬液，制法见本法（2）项，脑内接种体重10～12g小鼠每只0.03ml，待发病后取鼠脑再制成10-2悬液，接种于小鼠脑内进行传代，一般传2～3代。
选用第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液，按0.5ml分装安瓿,冻干后真空封口，制成冻干中和用病毒，-30℃冻存待用；或用第5天发病并麻痹的鼠脑用20%小牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10-1悬液，以每分钟2000转离心20分钟，取上清液混匀后分装小管，-70℃冻存待用。
（2）病毒悬液毒力的预测①冻干病毒的预测。
取含20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液1.0ml，吹打均匀后加入4.0ml 2%小牛血清磷酸盐缓冲液与病毒液充分混匀，以每分钟1500转离心10分钟，取上清液与等量的2%小牛血清磷酸盐缓冲液混合即为10-2悬液，然后再稀释至10-3、10-4、10-5、10-6，从10-6至10-2的稀释液中各取0.5ml置于5个小管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，置37℃水浴1小时。
重庆狂犬抗体检测_狂犬疫苗的血清学效果评价分析
狂犬疫苗的血清学效果评价分析泓域健康（MacroAreas Health）致力于健康管理模式的集成与创新，专注于“狂犬病中和抗体检测”、“HPV中和抗体检测”等疫苗接种后效果评价的管理与运营，利用“医疗服务+互联网、健康服务+大数据”平台，应用于各级公立医院及医疗机构，打造智慧健康管理服务产品体系，以传统医疗机构为基础，撬动医疗服务资源向健康管理服务延伸。
一、狂犬疫苗的血清学效果评价WHO仅推荐小鼠脑内中和试验和荧光灶抑制试验（RFFIT）检测中和抗体，两种方法均可以正确评价疫苗免疫后的中和抗体水平，WHO认为免疫后血清中的病毒中和抗体≥0．5IU/ml即达到有效保护水平。
国内外疫苗的临床研究数据显示，疫苗按暴露后的5针法或2-1-1等免疫程序接种，大多可在接种后7天出现中和抗体，14天100%抗体阳转。
而美国ACIP认为，疫苗暴露后免疫的14-28天中和抗体滴度已处于峰值，28天的第五针注射不能使抗体继续升高，因此，推荐美国健康成年人的暴露后免疫采用0、3、7和14天的4针免疫程序。
分析二、狂犬病病死率高危害极大狂犬病是一种危害极大的病毒性人畜共患病，它是有史以来病死率最高的疾病（病死率为100%），狂犬病在全世界绝大多数国家均有流行，世界卫生组织估计全球每年因狂犬病死亡达5．9万人。
根据中国疾控中心统计数据显示，2020年，中国人间狂犬病发病数为202例，死亡人数为188人，病死率较高。
2021年1月至3月，中国人间狂犬病发病书为13人，死亡12人，病死率较高。
三、当前狂犬疫苗发展面临的问题与困境疫苗的质量直接关系到国家公共卫生健康与安全，下一代人类疫苗通常是为了减少不良事件或提高现有疫苗的功效而开发的。
目前上市的几款狂犬疫苗在预防狂犬病方面已经取得了巨大的成功，但仍然存在一定的局限性，因此仍然需要利用现代生物技术进一步改进完善。
疫苗本身开发模式具有特殊性：研发即生产。
车间产能的持续迭代背后存在大量时间成本、审批成本，产量决定了临床规模及商业化规模。
抗狂犬病血清生产工艺及检查
抗狂犬病毒血清：由狂犬病毒固定毒免疫马所得的血浆，经胃酶消化后纯化制得。
生产工艺流程：1.原液：从免疫马匹（单采血浆术）获得免疫血浆，分离血浆(血浆精制:去除杂蛋白)（可加入适宜防腐剂），并做无菌检查即得原料血浆（其抗狂犬病效价应不低于80IU/ml）；免疫血浆稀释，加适量胃酶（用生理氯化钠溶液将胃酶配制成1mg/ml溶液），进行类A血型物质含量测定（通则3415，血凝抑制法），必要时可加适量甲苯，调整适宜PH值后，在适宜温度下消化一定时间(胃酶消化:切去Fc端)。
加热、硫酸铵盐析、明矾吸附进行纯化；超滤法或硫酸铵沉淀法进行浓缩，加适量防腐剂硫柳汞或间甲酚，然后澄清、除菌过滤后即得到原液。
2.半成品：合格原液按成品规格以灭菌注射用水稀释，调整效价、蛋白质浓度、pH值及氯化钠含量，除菌过滤。
3.成品：分批、分装、包装。
F(ab')2 ：Fragment antigen-binding即抗原结合片段。
抗体免疫球蛋白IgG经胃酶处理,切除pFc'段,纯化获得的F(ab')2。
图1被胃蛋白酶消化的抗体产生两个片段：F（ab'）2片段和pFc'片段。
免疫双扩散法：指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线；将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
酶联免疫吸附试验(以下简称ELISA)：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)，N，N，N’，N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
药典三部(2015版)-通则-3503人用狂犬病疫苗效价测定法(NIH法)
3503 人用狂犬病疫苗效价测定法（NIH法）本法系将供试品免疫小鼠后，产生相应的抗体，通过小鼠抗体水平的变化测定供试品的免疫原性。
试剂稀释液（PBS）量取0.9%磷酸二氢钾溶液75ml、2.4%磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）溶液425ml、8.5%氯化钠溶液500ml，混合后加水至5000ml，调pH值至7.2～8.0。
攻击毒株CVS制备启开毒种，稀释成10-2悬液，接种10～12g 小鼠，不少于8只，每只脑内接种0.03ml，连续传2～3代，选择接种4～5天有典型狂犬病症状的小鼠脑组织，研磨后加入含2%马血清或新生牛血清制成20%悬液，经每分钟1000转离心10分钟，取上清液经病毒滴定（用10只18～20g小鼠滴定）及无菌检查符合规定后作攻击毒用。
参考疫苗的稀释参考疫苗用PBS稀释成1:25、1:125和1:625等稀释度。
供试品溶液的制备供试品用PBS做5倍系列稀释。
测定法用不同稀释度的供试品及参考疫苗分别免疫12～14g 小鼠16只，每只小鼠腹腔注射0.5ml，间隔1周再免疫1次。
小鼠于第一次免疫后14天，用经预先测定的含5～100LD50的病毒量进行脑内攻击，每只0.03ml；同时将攻击毒稀释成100、10-1、10-2和10-3进行毒力滴定，每个稀释度均不少于8只小鼠。
小鼠攻击后逐日观察14天，并记录死亡情况，统计第5天后死亡和呈典型狂犬病脑症状的小鼠。
计算供试品和参考疫苗ED50值。
计算相对效力：P=TS ×d Td S×D式中P为供试品效价，IU/ml；T为供试品ED50的倒数；S为参考疫苗ED50的倒数；d T为供试品的1次人用剂量，ml；d S为参考疫苗的1次人用剂量，ml；D为参考疫苗的效价，IU/ml。
【附注】（1）动物免疫时应将疫苗保存于冰浴中。
（2）各组动物均应在同样条件下饲养。
（3）攻击毒原病毒液（100）注射的小鼠应80%以上死亡。
人用狂犬病疫苗效价测定法NIH法
附录ⅪA人用狂犬病疫苗效价测定法（NIH法）本法系将供试品免疫小鼠后，产生相应的抗体，通过小鼠抗体水平的变化测定供试品的免疫原性。
试剂稀释液（PBS）量取0.9%磷酸二氢钾溶液75ml、2.4%磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）溶液425ml、8.5%氯化钠溶液500ml，混合后加水至5000ml，调pH值至7.2～8.0。
攻击毒株CVS制备启开毒种，稀释成10-2悬液，接种11～13g小鼠，不少于8只，每只脑内接种0.03ml，连续传2～3代，选择接种4～5天有典型狂犬病症状的小鼠脑组织，研磨后加入含2%马血清或小牛血清制成20%悬液，经每分钟1000转离心10分钟，取上清液经病毒滴定（用10只18～20g小鼠滴定）及无菌检查符合规定后作攻击毒用。
参考疫苗的稀释参考疫苗用PBS稀释成1∶25、1∶125和1∶625等稀释度。
供试品溶液的制备供试品用PBS做5倍系列稀。
测定法用不同稀释度的供试品及参考疫苗分别免疫12～14g小鼠16只，每只小鼠腹腔注射0.5ml，间隔1周再免疫1次。
小鼠于第一次免疫后14天，用经预先测定的含5～100个LD50的病毒量进行脑内攻击，每只0.03ml。
同时将攻击毒稀释成100、10-1、10-2和 10-3进行毒力滴定，每个稀释度均不少于8只小鼠。
小鼠攻击后逐日观察14天，并记录死亡情况，统计第5天后死亡和呈典型脑症状的小鼠。
计算供试品和参考疫苗ED50值。
计算相对效力P＝T/S×dT /dS×D式中P为供试品效价，IU/ml;T为供试品ED50的倒数；S为参考疫苗ED50的倒数；dT为供试品的一次人用剂量，ml；dS为参考疫苗的一次人用剂量，ml;D为参考疫苗的效价，IU/ml。
【附注】（1）动物免疫时应将疫苗保存在冰浴中。
（2）各组动物均应在同样条件下饲养。
（3）攻击毒原病毒液(100 )注射的小鼠应80%以上死亡。
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附录ⅪJ抗狂犬病血清效价测定法第一法小鼠中和试验法（仲裁法）本法系根据抗狂犬病血清能中和狂犬病病毒的作用，将供试品与标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液结合，小鼠脑内注射，在规定时间内观察小鼠存活和死亡情况，以测定供试品效价。
试剂（1）量取0.9%磷酸二氢钾溶液75ml、2.4%磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）溶液425ml、8.5%氯化钠溶液500ml，混合后加水至5000ml，调pH值至7.2～8.0。
于磷酸盐缓冲液98ml中，加入2ml灭能小牛血清，临用前配制。
（2）20％小牛血清磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)20.8g，加注射用水溶解并稀释至1000ml，溶解后过滤，调pH至7.6。
灭菌后pH值应为7.2～8.0。
于磷酸盐缓冲液80ml中，加入20ml灭能小牛血清，临用前配制。
中和用病毒悬液的制备（1）病毒悬液的制备取CVS毒种(一般为冻干毒种)制成10-2悬液，制法见本法（2）项，脑内接种体重10～12g小鼠每只0.03ml，待发病后取鼠脑再制成10-2悬液，接种于小鼠脑内进行传代，一般传2～3代。
选用第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液，按0.5ml分装安瓿,冻干后真空封口，制成冻干中和用病毒，-30℃冻存待用；或用第5天发病并麻痹的鼠脑用20%小牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10-1悬液，以每分钟2000转离心20分钟，取上清液混匀后分装小管，-70℃冻存待用。
（2）病毒悬液毒力的预测①冻干病毒的预测。
取含20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液1.0ml，吹打均匀后加入4.0ml 2%小牛血清磷酸盐缓冲液与病毒液充分混匀，以每分钟1500转离心10分钟，取上清液与等量的2%小牛血清磷酸盐缓冲液混合即为10-2悬液，然后再稀释至10-3、10-4、10-5、10-6，从10-6至10-2的稀释液中各取0.5ml置于5个小管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，置37℃水浴1小时。
用体重10～12g小鼠30只，分成5组，每组6只，用经37℃作用的10-6至10-2病毒悬液接种小鼠，每个稀释度接种6只小鼠，每只小鼠脑内接种0.03ml，每天观察小鼠发病死亡情况，观察14天，接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。
以接种5天后的发病死亡小鼠统计LD50。
②-70℃冻存病毒的预测。
取含10%脑悬液的冰冻病毒融化后即为10-1悬液，然后再稀释至10-2～10-7。
从10-7至10-3各取0.5ml加至5个小管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，置37℃水浴1小时。
用体重10～12g小鼠30只，分成5组，每组6只，用经37℃作用的10-7至10-3病毒悬液接种小鼠，每个稀释度接种小鼠6只，每只小鼠脑内接种0.03ml，每天观察小鼠发病死亡情况，观察14天。
接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。
以接种5天后的发病死亡小鼠统计LD50。
（3）中和用病毒悬液的制备按病毒悬液预测的100个LD50的病毒稀释度作为中和用病毒悬液稀释倍数，用于小鼠中和试验。
要求中和用病毒悬液经37℃水浴作用1小时的病毒量在32～320LD50之间。
抗狂犬病血清标准品溶液的制备由国家药品检定机构提供，或用经国家药品检定机构认可的各生产单位工作用标准品。
配制方法按使用说明书进行。
供试品溶液的制备用2%小牛血清磷酸盐缓冲液将供试品进行2倍稀释，一般可采用1∶800、1∶1600、…、1∶102400，但可根据供试品实际效价适当降低或提高最低稀释倍数，如采用上述8个稀释倍数，则按稀释液2.7ml加入供试品0.3ml作为1∶10供试品溶液，然后再用稀释液3.5ml加入混匀的1∶10的供试品溶液0.5ml作为1∶80供试品溶液，再按稀释液2.7ml加入1∶80的供试品溶液0.3ml作为1∶800供试品溶液（1）。
再按0.5ml加0.5ml做倍比稀释制备供试品溶液（2）～（8），它们的稀释倍数依次为1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200和1∶102400。
测定法取8个稀释度的供试品溶液（1）～（8）各0.5ml置8支小试管中，另取8个稀释度的抗血清标准品溶液各0.5ml置8支小试管中，共16支小试管，分别加入中和用病毒悬液0.5ml，放置37℃水浴1小时，供注射小鼠用。
另用相同体重的小鼠测定中和用病毒悬液的实际LD50。
其方法可将中和用病毒悬液作为原倍再稀释100、10-1、10-2、10-3等共4个稀释度，以上4个稀释度各加入0.5ml于小管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，同样放置37℃水浴1小时作为中和病毒对照。
将已中和的供试品和标准品的不同稀释度的悬液以及病毒对照分别接种小鼠，供试品和标准品按从浓到稀的倍数接种小鼠，而病毒对照则按从稀到浓的倍数接种小鼠。
小鼠体重10～12g，每只小鼠脑内接种0.03ml。
每稀释度注射6只小鼠。
每天记录小鼠的发病死亡情况，共观察14天，接种后4天内死亡的小鼠作为非特异性死亡计。
供试品效价(IU/ml)= B1____ ×DB2式中B1为供试品ED50的倒数；B2为抗血清标准品ED50的倒数；D为抗血清标准品的国际单位，IU/ml。
第二法快速荧光灶抑制试验（新增）本法系根据抗狂犬病抗体能中和狂犬病病毒的作用，将供试品与标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液结合，感染敏感细胞，在规定的时间内用荧光抗体染色并观察荧光灶减少的情况，以测定供试品效价。
试剂：（1）含5%和10%小牛血清的DMEM细胞培养基并加入终浓度为100u/ml抗生素和0.03％谷氨酰胺，临用前配制。
（2）80% 冷丙酮取80ml丙酮，加到20ml PBS(pH7.6，0.1mol/L)中，混匀，加盖密封后4℃冰箱保存。
（3）磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）1.44g、氯化钠8g，加蒸馏水溶解并稀释至1000ml，用氢氧化钠调pH至7.2，临用前配制。
（4）80%甘油量取80ml甘油，加入20ml蒸馏水中，混匀，加盖后4℃冰箱保存。
（5）0.25% 胰蛋白酶- EDTA。
（6）FITC标记抗狂犬病毒核蛋白抗体：按说明书要求稀释到工作浓度。
中和用病毒的制备（1）病毒悬液的制备：取CVS－11毒种（一般为冻干毒种）作适当稀释，以0.1 MOI 的感染量接种生长良好的BSR细胞，37℃ 5% CO2培养1天后转入34℃继续培养，2天后收集培养上清，4℃条件下4000RPM离心10分钟去除细胞碎片，取上清液加入10％小牛血清，混匀后分装小管，-70℃以下冻存备用。
（2）病毒液的预滴定：取冻存的毒种一支，冷水速融后在24孔培养板上从1：5开始做5倍系列稀释（100μl病毒样品加入400μl含5%灭能小牛血清的DMEM培养液中每孔，充分混匀后，然后每个稀释度取100μl转移至96孔培养板，每个稀释度平行做2份，每孔再加入5×106/ml的BSR细胞悬液50μl，37℃5% CO2孵箱中培养24小时。
培养结束后弃上清，PBS洗一遍，再用80％冷丙酮（每孔50μl）-30℃固定10分钟，甩干，室温干燥后每孔加入50μl工作浓度的FITC标记抗狂犬病毒核蛋白抗体染色，37℃孵育30分钟后，PBS 洗3遍，每孔加50μl80％甘油于荧光显微镜下观察；计数每孔中的荧光灶数，取每孔荧光灶数在30以下的孔，记录相邻2孔荧光灶数，取其平均值，计算如下：病毒滴度FFU/ml = （最高稀释倍数孔荧光灶平均值×5 + 相邻孔稀释倍数较低的荧光灶平均值）/2×稀释倍数较低孔病毒稀释倍数×20（3）中和用病毒液的滴定方法同（3）病毒液的预滴定。
在荧光显微镜下计数每孔中的荧光灶比例，选用可致80%的细胞被病毒感染而的病毒稀释度为中和试验用病毒稀释度。
（4）中和用病毒的准备取一支冻存的病毒，流水融化后，用5%灭能小牛血清的DMEM培养液将病毒稀释至能致按“（3）中和用病毒液的滴定”项要求可致80%细胞被感染的病毒稀释度，置冰浴备用。
抗狂犬病血清标准品的制备由国家药品检定机构提供，或用经国家药品检定机构认可的各生产单位工作用标准品。
配制方法按使用说明书进行。
供试品的制备供试品预先经56℃ 30分钟灭能，用含5%灭能小牛血清的DMEM培养液将供试品作3倍系列稀释，即在96孔培养板中每孔预先加入100μl培养液，取50μl供试品加入其中，成为1：3稀释度，充分混合和后，吸取50μl加入下一孔100μl培养液中，成为1：9稀释度，如此系列稀释至第12孔。
RFFIT方法取供试品及标准品各稀释度50μl 于96孔培养板中，加入中和用病毒，50μl/孔，同时设空白孔对照（只加100μl DMEM于孔中），以及中和用病毒对照孔（含5%灭能小牛血清的DMEM 50μl，加入中和用病毒50μl），混匀后置37℃中和1小时，每孔加入1×106细胞/ml 的BSR细胞悬液50μl，置37℃ 5% CO2孵箱中培养24小时。
待培养结束吸干培养液，每孔中加入100μl/ PBS清洗并吸干后，每孔加入预冷至4℃的80％丙酮50μl ，-30℃固定10分钟，弃丙酮，待挥发干燥后加入工作浓度的荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白抗体，50μl /孔，37℃孵育30分钟，甩掉液体，用PBS洗板2～3次，甩干液体，每孔加入80％甘油50μl，荧光显微镜观察。
计算公式如下：标准品ED50 = lg (1/ 标准品低于50%荧光灶比例的稀释度) —（0.5 —标准品低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比）/ (高于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比—低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比) ×lg稀释倍数供试品ED50 = lg (1/ 标准品低于50%荧光灶比例的稀释度) —（0.5 —供试品低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比）/ (供试品高于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比—供试品低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比) ×lg稀释倍数供试品效价= （标准品ED50 —供试品ED50）的倒数×标准品的效价供试品效价单位为IU/ml。
『附注』（1）中和用病毒滴度不得小于106 FFU/ml。
（2）病毒稀释时，应尽可能在冰浴中进行。
（3）病毒对照孔应有80%细胞被荧光着色，细胞对照孔应无荧光，试验方可成立。