微生物检验学之细菌的生物化学试验
实验五 细菌的生化试验
酵管中，置37℃培养48h后，取出培养液加入甲基 红试剂2-3滴，观察结果。
[结果判定] ：培养液变红色，反应阳性，用+表示；
培养液不变色，反应阴性，用-表示。
4.乙酰甲基甲醇试验（V-P试验）
[基本原理]：某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，进 一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境下被氧 化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍 基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为VP试验阳性。
标记气室示意图
二 实验内容
（一）病毒的鸡胚分离培养
1.鸡胚：9-10日龄健胚
2.病毒：NDⅣ-Lasota株，100×稀释，加双抗各 5000单位/ml，室温下30min或4℃过夜
3.接种部位：尿囊腔接种
4.接种量：0.1-0.2ml/胚
5.接种步骤：照蛋→标记→打孔→接毒→封孔→37 ℃孵化箱中继续孵化，及时照蛋，24h内死胚丢 弃，以后死亡者随时取出，冷藏，120h不死者， 冻死。
[结果判定]：
溴甲酚紫是一种酸碱指示剂，在中性时为紫色，碱 性时为深红色，而在酸性时呈现黄色。
紫色无气泡，既不产酸也不产气，用-表示； 黄色无气泡，产酸不产气，用+表示； 黄色有气泡，产酸产气，用⊕表示。
2.吲哚（靛基质）试验
[基本原理]：有些细菌有色氨酸酶，能分解蛋白胨 中的色氨酸形成吲哚，吲哚与对位二甲基氨基苯 甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。该试验主要 用于肠道杆菌的鉴定。
[试验方法]：将待检菌液接种到葡萄糖蛋白胨水微 量发酵管中，置于37℃培养48h，取出后加入VP 试剂甲液3滴，乙液各1滴，充分摇动，静置1530分钟后，观察实验结果。
[结果判定]：管内变红色为阳性，用+表示； 管内不变色为阴性，用-表示。
微生物生物化学实验技术
微生物生物化学实验技术微生物生物化学实验技术是一门涉及微生物和生物化学的实验技术学科，其研究内容包括微生物的生长特性、代谢途径、原生态功能等方面。
在实验室中，通过一系列实验手段和技术手段，可以研究微生物的生物化学过程，揭示微生物在环境中的作用和影响。
一、菌种的保存和鉴定在微生物生物化学实验技术中，首先需要进行菌种的保存和鉴定工作。
菌种的保存是为了长期保存某种微生物，以备后续实验使用。
常见的保存方式包括在琼脂培养基上制备菌斑、制备冻干粉末或低温冷冻保存等。
而菌种鉴定则是为了确保所使用的微生物种属准确，常见的鉴定方法包括形态学观察、生理生化特性检测、分子生物学技术等。
二、微生物生长曲线的绘制和分析微生物生长曲线是研究微生物生长和繁殖规律的重要手段。
利用实验技术，可以通过不同培养条件下不同时间点的菌液浓度进行测定，从而得到微生物生长曲线。
通过绘制生长曲线并进行数据分析，可以了解微生物在不同生长阶段的生长速率、最大生长速率、最大生长速率等参数。
三、微生物代谢产物的检测和分析微生物代谢产物是微生物在代谢过程中产生的各种物质，包括有机酸、氨基酸、酶等。
通过实验技术，可以对微生物代谢产物进行检测和分析，了解微生物的代谢途径和代谢产物的种类及含量。
常见的检测方法包括高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法等。
四、微生物酶活性的测定和应用微生物酶是微生物体内产生的一种特殊蛋白质，具有催化作用。
通过实验技术，可以对微生物酶的活性进行测定，了解酶的催化特性和反应底物的种类。
此外，微生物酶在生物化学工程、食品工业、医药等领域有着广泛的应用，通过研究微生物酶的活性和性质，可以进一步开发和利用其潜在的应用价值。
五、微生物工程技术的发展趋势随着现代科学技术的不断发展，微生物工程技术也在不断更新和完善。
新兴的技术包括代谢工程、系统生物学、合成生物学等，将为微生物生物化学实验技术的发展带来新的契机和挑战。
同时，微生物生物化学实验技术在环境保护、资源利用、新药开发等方面具有广阔的应用前景，将为人类社会的可持续发展做出重要贡献。
临床检验技师-微生物检验(2019)练习第十章_细菌的生物化学试验
·2019 第十章细菌的生物化学试验一、 A11、在链球菌中，可作为 B 群链球菌特异性鉴定的试验是A、胆汁溶菌试验B、 CAMP试验C、凝固酶试验D、 O/129 抑制试验E、 DNA酶试验2、下列关于触酶试验的说法中，错误的是A、葡萄球菌触酶试验阳性B、微球菌触酶试验阳性C、链球菌触酶试验阳性D、触酶试验常用于革兰阳性球菌的初步分群E、有大量气泡产生的为触酶试验阳性3、下列说法中错误的是A、肠杆菌科细菌氧化酶试验阴性B、假单胞菌的氧化酶试验阳性C、奈瑟菌属氧化酶试验阳性D、莫拉菌属氧化酶试验阴性E、氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶4、主要用于肠杆菌科细菌属及种的鉴别的试验是A、明胶液化试验B、吲哚试验C、 ONPG试验D、糖类发酵试验E、硫化氢试验5、下列试验中，可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别的试验是A、糖类发酵试验B、 O/F 试验C、 ONPG试验D、甲基红试验E、七叶苷水解试验6、下列试验中，可区分细菌的代谢类型的试验为A、糖类发酵试验B、 O/F 试验C、 ONPG试验D、甲基红试验E、七叶苷水解试验第 1 页共 6 页·7、鉴定细菌最主要和最基本的试验是A、糖类发酵试验B、 O/F 试验C、 ONPG试验D、甲基红试验E、七叶苷水解试验8、 O/129 抑菌试验的培养基为A、普通琼脂培养基B、血琼脂培养基C、碱性琼脂培养基D、 SS 琼脂培养基E、 MH培养基9、 ONPG试验主要鉴定的细菌是A、发酵葡萄糖菌株B、发酵乳糖菌株C、迟缓发酵葡萄糖菌株D、迟缓发酵乳糖菌株E、迟缓发酵七叶苷菌株10、不属于碳水化合物代谢试验的是A、甲基红试验B、明胶液化试验C、 V-P 试验D、七叶苷水解试验E、 ONPG试验11、下列不属于糖类代谢试验的是A、菊糖分解试验B、甘露醇分解试验C、 O/F 试验D、吲哚试验E、甲基红试验12、不属于蛋白质和氨基酸代谢试验的是A、赖氨酸脱羧酶试验B、七叶苷水解试验C、硫化氢试验D、苯丙氨酸脱氨酶试验E、尿素分解试验13、关于甲基红试验原理不正确的是A、细菌分解葡萄糖产生丙酮酸B、丙酮酸进一步分解产生甲酸等C、使培养基pH 下降至 4.5 以下第 2 页共 6 页D、甲基红变色范围为pH4.4～ 6.2E、阳性时呈黄色14、关于吲哚试验，不正确的是A、培养基为蛋白胨水B、培养基中不含葡萄糖C、阳性的细菌含有色氨酸酶D、加入的吲哚试剂为四甲基对苯二胺E、有红色的玫瑰吲哚形成为阳性15、甲基红试验阳性结果为A、绿色B、黄色C、红色D、蓝色E、紫色16、吲哚试验阳性的细菌是因为它能分解A、葡萄糖B、胱氨酸C、靛基质D、色氨酸E、枸橼酸盐17、靛基质试验又称A、甲基红试验B、尿素酶试验C、糖发酵试验D、枸橼酸盐利用试验E、吲哚试验18、 CAMP试验阳性结果的溶血特点为A、箭头状B、线状C、月牙状D、环状E、 S 状19、链球菌与葡萄球菌的属间鉴别，可作初步确定的是A、 DNA酶试验B、触酶试验C、氧化酶试验D、葡萄糖发酵试验E、过氧化氢酶抑制试验20、可以区分大肠埃希菌和变形杆菌的试验是A、动力试验第 3 页共 6 页B、吲哚试验C、葡萄糖发酵试验D、尿素分解试验E、甲基红试验21、下列不属于蛋白质和氨基酸代谢试验的是A、 CAMP试验B、吲哚试验C、硫化氢试验D、明胶液化试验E、尿素分解试验答案部分一、 A11、【正确答案】 B【答案解析】在链球菌中，只有 B 群链球菌CAMP试验阳性，故可作为特异性鉴定。
【临床微生物实验】_3细菌生化反应
pH域
酚红 溴麝香草酚蓝 溴甲酚紫 甲基红 中性红
6.8--8.4 6.0--7.6 5.2--6.8 4.2--6.2 6.8--8.0
酸色
黄 黄 黄 红 红
碱色
红 蓝 紫 黄 黄
结果：
指示剂：酚红 酸性：黄色 碱性：红色
指示剂：溴甲酚紫 酸性：黄色 碱性：紫色
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2．氧化―发酵试验（O/F试验） 作用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴
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原理：
酶 不分解（－）
糖（苷、醇）
产酸不产气（＋）
产酸产气 ＋
常用糖（苷、醇）类底物：
单糖： 葡萄糖、果糖、半乳糖等 双糖： 乳糖、蔗糖、麦芽糖等 多糖： 淀粉、糊精、肝糖等 醇类： 甘露醇、卫矛醇、山梨醇等 苷类：七叶苷、水杨素等
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常用指示剂及颜色变化
＋－
5.氨基酸脱羧酶试验(amino acid decarboxylation test)
氨基酸(鸟氨酸，赖氨酸，精氨酸）
（ ）脱羧酶
胺（腐胺，尸胺，精胺） + CO2
pH
溴甲酚紫或酚红
培养基变紫或红色
应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。 ＋ －
＋－
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（三）碳源和氮源利用试验
葡萄糖 丙酮酸
脱羧
乙酰甲基甲醇
V-P试剂 (KOH+α-萘酚)
二乙酰 培养基变红
（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验
1．吲哚(靛基质)试验 注意：观察结果前需加吲哚试剂！
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吲哚(靛基质)试验(Indole test)原理
微生物检验第十章 细菌的生物化学试验讲义
第十章细菌的生物化学试验碳水化合物的代谢试验1.糖（醇、苷）类发酵试验：接种的细菌，若能分解培养基中的糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应。
若产气可使液体培养基中导管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。
若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。
鉴定细菌最主要和最基本的试验。
2.氧化-发酵试验（O/F试验）：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。
3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）：迟缓发酵乳糖菌株的鉴定。
碳水化合物的代谢试验4.七叶苷水解试验：D群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。
也可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。
5.甲基红试验：鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。
6.V-P试验：常与甲基红试验一起使用，因为前者为阳性的细菌，后者通常为阴性。
蛋白质和氨基酸的代谢试验其理为不同种类的细菌分解蛋白质的能力不同。
细菌对蛋白质的分解，一般先由胞外酶将复杂的蛋白质分解为短肽（或氨基酸），渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽类分解为氨基酸。
1.明胶液化试验某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶，能使明胶分解成氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体。
应用：肠杆菌科细菌的鉴别。
有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。
另外多数假单胞菌也能液化明胶。
2.吲哚（靛基质）试验某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成引噪（靛基质），当加入吲哚试剂（对位二甲氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚。
应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
3.硫化氢试验某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢，硫化氢遇铅或亚铁离子则形成黑褐色的硫化铅或硫化铁沉淀。
此试验可间接检测细菌是否产生硫化氢。
应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。
4.尿素分解试验原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性。
微生物鉴定的生理生化反应汇总
微生物鉴定的生理生化反应各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。
用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。
利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。
生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
一、碳水化合物的代谢试验1．糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。
检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。
所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。
将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。
若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不分解糖则无变化。
(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。
即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）多糖菊糖（多分子果糖）淀粉醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇非糖类肌醇2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
微生物生理生化反应实验报告
微生物的生理生化反应一、实验目的1.掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的测定方法。
2.了解细菌代谢类型的多样性。
3.了解细菌生长现象及代谢产物在鉴别中的意义。
4.学习接种技术。
二、实验原理在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌。
1.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。
产酸后再加入溴甲酚紫指示剂后会使溶液呈黄色，且杜氏小管中会收集到一部分气体。
若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且杜氏小管中无气体。
2.甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转变为红色，即甲基红反应。
大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
3.伏-普试验（VP）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成非酸性或中性末端产物，某些细菌产生丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被氧化成二乙酰，二乙酰与胍基作用，生成红色化合物，为阳性。
4.靛基质（吲哚）试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。
但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。
大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。
5.硫化氢实验：某些细菌分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫酸铵亚铁等铁盐可与硫化氢反应生成不溶性硫化亚铁之黑色沉淀，为硫化氢实验阳性。
微生物鉴定的生理生化反应汇总
微生物鉴定的生理生化反应各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。
用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。
利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。
生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
一、碳水化合物的代谢试验1．糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。
检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。
所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。
将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。
若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不分解糖则无变化。
(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。
即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）多糖菊糖（多分子果糖）淀粉醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇非糖类肌醇2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
微生物学检验细菌的生物化学实验
检测对象：特异性抗原
方法：直接凝集试验（玻片法）、荚膜肿
胀伤寒试杆验菌诊断血清 + 待检测细菌
（含抗伤寒杆菌抗体）
细菌凝集
玻片凝集试验：阳性
报告：检出伤寒杆菌
血清学诊断
试剂：含已知抗原 应用：检测待检者血清中有无相应的抗 体以及抗体的效价
球菌
种类: 革兰阳性 葡萄球菌属、链球菌属（链球菌、肺炎 链球菌）、肠球菌属、微球菌属等 革兰阴性 奈瑟菌属、布兰汉菌属
四种革兰阳性菌的比较
葡萄球菌属 微球属 链球菌属 气球菌属
排列方式 葡萄串状、 四联或成对 链状 成双或四联
触酶试验
+
+
-
弱+
氧化/发 酵
厌氧生长
发酵 +氧化 源自生长发酵 +发酵 弱
葡萄球菌属
最常见的化脓性球菌 医务人员的葡萄球菌带菌率高 革兰阳性、葡萄串状排列 产生不同的脂溶性色素 触酶试验阳性 发酵葡萄糖 金黄色葡萄球菌是主要致病菌
培养基不变色： － 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验， 主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
伏－普试验（V-P试验）
原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮 酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙 酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白 胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化 合物。
培养基：葡萄糖蛋白胨水
结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+ 培养基不变色： －
应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主 要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
葡萄糖
甲基红试验
丙酮酸 大量混合酸
pH降至4.4以下
甲基红试剂
培养基变红
葡萄糖
V－P试验
微生物鉴定中的生理生化试验
微生物鉴定中的生理生化试验一．实验目的1.证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
4.了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。
二．实验原理由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
具体的原理如下：1.大分子水解试验微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。
胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
如淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。
2.糖发酵试验糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、加完、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。
例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。
当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。
微生物鉴定之生化实验大全.doc
微生物鉴定之生化实验大全入社群：听大咖微课 +看医学视频 +会议直播微生物鉴定之生化实验大全不同的细菌具有各自的独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。
这些代谢产物又具有不同的生物化学特性，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。
掌握各种生化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础。
生理生化特性的测定主要根据Shirling ＆ Gottlieb 《International Journal of Systematic Bacteriology》中鉴定的有关试验。
（一）碳水化合物代谢实验：糖（醇、苷）类发酵实验（1）原理：细菌分解糖的能力与该菌是否含有分解某种糖的酶密切相关，故分解糖的能力各不相同，细菌分解糖类后的终产物亦不一致，在含糖培养基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。
（2）基本培养基：在培养基中加入 0.5%-1% 的糖类（单糖、双糖、或者多糖）、醇类（甘露醇、肌醇）苷类（水杨苷、菊糖等）。
培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。
（3）实验方法：取某一种细菌的24h 纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培养基内，37℃培养 24h ，观察结果并记录。
（4）结果判定如果接种进去的细菌可发酵某种糖或醇，则可产酸，使培养基由紫色变成黄色，如果不发酵，则仍保持紫色。
如发酵的同时又产生气体，则在微量发酵管顶部积有气泡。
（5）应用：是鉴定细菌最主要最基本的实验，特别是对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。
氧化型与发酵型 (O/F) 的测定（1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧的参加的，称为氧化型，细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。
发酵型细菌无论在有氧或者无氧的环境中都能分解葡萄糖。
不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。
这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。
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细菌的生物化学试验●考点碳水化合物的代谢试验蛋白质和氨基酸的代谢试验碳源和氮源利用试验各种酶类试验抑菌试验复合生化试验不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。
这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。
在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种鉴定，主要通过这些生物化学试验。
一、碳水化合物的代谢试验原理：细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。
据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。
1.糖（醇、苷）类发酵试验原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同，分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。
培养基：在培养基中加入0.5%～1%的糖类（单糖、双糖或多糖）、醇类（甘露醇、肌醇等）、苷类（水杨苷等）。
培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。
方法：接种，培养。
结果：产酸：培养基中的指示剂呈酸性反应。
产气：可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。
不分解：培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。
应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。
2.氧化-发酵试验（O/F试验）（1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。
氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。
细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。
发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。
不分解葡萄糖而分解蛋白胨的细菌称为产碱型。
利用此试验可区分细菌的代谢类型。
（2）培养基HL：Hugh-Leifson培养基。
（3）方法：将待检菌同时穿刺接种于两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液状石蜡（或其他矿物油），高度不少于1cm。
将培养基于35℃培养48小时或更长。
（4）结果：两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若仅不加液状石蜡的培养基产酸为氧化型。
（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌与不发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。
也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。
3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）（1）原理：有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-β-D半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻-硝基酚。
（2）试剂：0.75M ONPG溶液（3）方法：从培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。
将试管置37℃水浴5分钟，加入0.25mlONPG试剂，水浴20分钟～3小时观察结果。
（4）结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30分钟内显色。
（5）应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。
本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。
4.七叶苷水解试验（1）原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。
（2）培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。
（3）方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。
（4）结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。
（5）应用：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。
也可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。
5.甲基红试验（1）原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。
若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。
（2）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。
（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养2～4天，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。
（4）结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。
（5）应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。
此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。
6.V-P试验（1）原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，被空气中的氧氧化为二乙酰，进而与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，则为V-P试验阳性。
（2）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。
（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35℃培养48小时后加入甲液（6%α-萘酚乙醇溶液）和乙液（40%KOH溶液），振摇。
（4）结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于35℃4小时后仍如故者即为阴性。
（5）应用：本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。
（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验其原理为：不同种类的细菌分解蛋白质的能力不同。
细菌对蛋白质的分解，一般先由胞外酶将复杂的蛋白质分解为短肽（或氨基酸），渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽类分解为氨基酸。
具体试验方法有：①明胶液化试验；②吲哚试验（靛基质试验）；③硫化氢试验；④尿素酶试验；⑤苯丙氨酸脱氨酶试验；⑥氨基酸脱羧酶试验。
1.明胶液化试验（1）原理：某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体。
（2）方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22℃培养7天，每日观察结果。
若用35℃孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察结果前，先置4℃冰箱内30分钟，再看结果。
（3）结果：培养基呈液化状态为阳性。
（4）应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。
有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。
另外多数假单胞菌也能液化明胶。
2.吲哚（靛基质）试验（1）原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基质），当加入吲哚试剂（对位二甲氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚。
（2）培养基：蛋白胨水培养基。
（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35℃培养24～48小时，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。
（4）结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。
（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
3.硫化氢试验（1）原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢，硫化氢遇铅或亚铁离子则形成黑褐色的硫化铅或硫化铁沉淀。
此试验可间接检测细菌是否产生硫化氢。
（2）培养基：醋酸铅培养基。
（3）方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于35℃培养24～48小时观察结果。
（4）结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。
（5）应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。
如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴性。
沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。
4.尿素分解试验（1）原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性。
（2）培养基：尿素培养基。
（3）方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35℃培养18～24小时观察结果。
（4）结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。
（5）应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。
奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性，另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。
5.苯丙氨酸脱氨酶试验（1）原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿色反应。
（2）培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。
（3）方法：将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于35℃培养18～24小时，滴加10%三氯化铁试剂3～4滴，自斜面上方流下。
（4）结果：出现绿色为阳性。
应立即观察结果，延长反应时间会引起褪色。
（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。
6.氨基酸脱羧酶试验（1）原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培养基变碱。
使指示剂显示出来。
（2）培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。
（3）方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液状石蜡或矿物油，于35℃培养1～4天，每日观察结果。
（4）结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。
若对照管呈现紫色则试验无意义，不能作出判断。
（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。
志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。
（三）碳源和氮源利用试验是细菌对单一来源的碳源利用的鉴定试验。
在枸橼酸盐培养基中，细菌只有利用枸橼酸盐作为碳源，分解后生成碳酸钠使培养基变碱性，pH指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿色变为深蓝色。
常用的试验方法有枸橼酸盐利用试验、丙二酸盐利用试验。
1.枸橼酸盐利用试验（1）原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源，并且利用枸橼酸盐作为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变为碱性。
（2）培养基：枸橼酸盐培养基。
（3）方法：将被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于35℃培养1～4天，每日观察结果。
（4）结果：培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性；不能利用枸橼酸盐作为碳源的细菌，在此培养基上不能生长，培养基则不变色，为阴性。
（5）应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。
在肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常为阳性。
2.丙二酸盐利用试验（1）原理：有的细菌可利用丙二酸盐作为唯一碳源，将丙二酸盐分解生成碳酸钠，使培养基变为碱性。
（2）培养基：丙二酸盐培养基。
（3）方法：将被检菌接种于上述培养基，35℃培养24～48小时后观察结果。
（4）结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。
（5）应用：肠杆菌科中属间及种的鉴别。
克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其他菌属均为阴性。
（四）各种酶类试验1.氧化酶试验（1）原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。