酶的结构与功能

如NaBH4）
His
二乙基碳酸酯，光氧化
Arg
苯乙二醛，2，3-丁二酮
Tyr
四硝基甲烷，N-乙酰咪唑，碘
Trp
N-溴代琥珀酰亚胺
Asp（Glu）水溶性羰二亚胺
但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的
②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失 活， 因此不一定是活性中心基团被共价 修饰
某些试剂能与氨基酸残基的侧链基团反 应——引起共价结合、氧化、还原等，
使基团的结构和性质发生改变，视失活程 度，查找必需基团。
如①-NH2
试剂 ：乙酸酐 2，4—二硝基氟苯（DNFB） 异硫氰酸苯酯（PITC）
E-NH2 +
-N=C=S
S E - NH - C - NH-
②Ser-OH DIFP(二异丙基氟磷酸)
DIFP — P, P32 — 差别
酶蛋白 保护剂（S 或竞Ⅰ）
保护活性中心aa残基（SΒιβλιοθήκη Baidur-OH） 加DIFP（非标记）
结合活性中心以外的Ser—OH 去除DIFP 去除保护剂 加DIFP32
置换活性中心保护剂，活性中心被标记（P32）
含有P32 的活性中心的酶蛋白
完全水解
部分水解
鉴定aa- P32
DFP对 胰凝乳蛋白酶——S（Phe，Trp，Tyr） 胰蛋白酶——S（Lys Arg）都抑制，
而亲和试剂则能分开。
例：胰凝乳蛋白酶
S为芳香族氨基酸—aa（其它物质）形
成的肽键
↑
肽键
酯键
O
CH2 CH C NH
O=S=O
OH
酰胺 乙酯
NH2 O-CH2-CH3
甲苯磺酰苯丙酰胺 为最佳 S
甲苯磺酰苯丙酸乙酯
X-射线衍射技术：用于蛋白质及核酸三维结构的确 定，至今已有数百种蛋白质的结构被确定，分辨率 为A的量级，但蛋白质结晶难度大
X-Ray Diffraction
2．化学修饰法
应用最早、最广泛——鉴定酶活中心
原理：酶分子上的侧链基团，被化 学试剂修饰后若活力下降或丧失——则 为必需基团。
（1）专一性氨基酸共价修饰法
（贡献残基） structure residues 4.非贡献残基non-contributing residues
Common Features of the Active Sites
Active site
The active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product. The active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.
溴丙酮 碘乙酸 二硝基氟苯
碘重N化合物 四硝基甲烷
吲哚基 Trp 二硫键
巯基 Cys
2-羟 — 5-硝基溴苯
乙硫醇 二硫赤藓醇 碘乙酸（酰胺）二酰亚胺 N-乙基顺丁烯
表 各种氨基酸侧链的修饰剂
Cys
汞化物，如对-氯汞苯甲酸；二硫化物，
如5，5-二硫双（2-硝基苯甲酸）；碘
乙酰胺
Lys
三硝基苯磺酸，吡哆醛磷酸（还原剂，
CH 3
TPCK（甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮）
O
CH2 CH C CH2 Cl
NH O=S=O
亲和试剂 用甲苯磺酰－L－苯丙氨酸为基本
结构，将羧基换成氯甲基酮—活
泼烷化剂
CH3
表 一些酶的亲和试剂
酶 胰凝乳蛋白酶
胰蛋白酶
亲和试剂 被修饰的残基
TPCK TLCK
His Ser195 His
天冬氨酸转氨酶 β-溴丙酮酸 β-氯丙氯酸
表 重要基团的非特异共价修饰试剂
被修饰的基团 氨基
Lys or N-末端aa
试剂 乙酸酐 顺丁烯二酸 亚硝酸 DNFB
PITC
胍基 Arg
羧基 Asp Glu
丙二醛
cyclohexanedione 环己二酮
Phenylglyoxal 苯甲酰甲醛
硫化二亚胺
对溴苯酰甲基溴
咪唑基 His
酚基 Tyr
③不同部分的相同基团，修饰效果不同， 分子内部的必需基团，不易被修饰。
活性中心基团的鉴定标准
①失活程度与一定修饰剂浓度成一定比例
关系
②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。
先加S或竞Ⅰ 加共价修饰剂 去S或竞Ⅰ 活性不丧失
透析除
（2）差别修饰法（差别标记）
过量S 或 竞Ⅰ下加修饰剂 去除多余修饰剂及S 同位素修饰作用 则原来被保护基团带有同位素标记
胱氨酸 赖氨酸
清华大学学术专著
蛋白质化学修饰
周海梦 王洪睿 编著 清华大学出版社，1998
3．动力学分析
酶蛋白——两性电解质——pH改变 基团解离状 态改变 导致酶活性变化 根据pH变化——研究pH和活性的关系 提供某 些基团pK 推断基团的作用 参数Vmax,Km与pH关系 解离基团
需供助其它方法，进行推断
实际上化学修饰法也需动力学分析判断结果
胰凝乳蛋白酶 溶菌酶 木瓜蛋白酶 碳酸酐酶
Ser195 Asp102 His57
Asp129 Glu35
Cys25 His159 His93- Zn – His95
| His117
（二）活性中心的研究方法
1．X—衍射 研究蛋白质结构 X—射线撞击原子中电子后,产生衍射
图,分析结构——空间结构
第二节 酶的结构与功能
①酶催化作用的结构基础 ②酶催化作用的机制
一、活性中心（active site）
（一）活性中心的概念
酶分子中各种残基的作用
1960年Koshland将酶分子氨基酸残基或其 侧链基团分为四类。
1.接触残基 contact residues 2.辅助残基 auxiliary residues 3.结构残基 contributing residues
肽段
分离P32 肽段→测一级结构
（3）亲和标记法
利用酶对S的特殊亲和力，将酶加以标记— —亲和标记。
Y Y
X
Y
Y X-Y
Y
亲和修饰剂： ①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基
亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残 基亲和力小。 ②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性 中心的基团形成稳定的共价键。