分子标记技术的类型原理及应用

分子标记

1.分子标记技术及其定义

1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。

2.分子标记技术的类型

分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。

2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术

(1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记；

(2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。

2.2 以重复序列为基础的分子标记技术

(1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA；

(2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA;

(3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。

2.3 以PCR为基础的分子标记技术

(1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA；

(2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性；

(3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性；

(4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性；

(5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性；

(6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域；

(7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。

2.4以mRNA为基础的分子标记技术

(1) ESTs( Expressed Sequence Tags) 表达序列标签；

(2) DD( Differential Dislay ) 差异显示；

(3) RT-PCR( Reverse T ranscription PCR)逆转录PCR；

(4) DDRT-PCR ( Differential Display Reverse Transcription PCR) 差异显示逆转录PCR；

(5) RAD( Representative Difference Analysis) 特征性差异分析；

(6) SAGE( Serial analysis of gene expression) 基因表达系列分析。

2.5以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术

SNP( Single Nucleotide Polymorphism) 单核苷酸多态性标记。

2.6 以特定序列为核心的分子标记技术

mtDNA ( Mitochondrial DNA) 线粒体DNA分子标记。

3.代表性分子标记技术

3.1RFLP限制性片段长度多态性

RFLP( Rest rict ion Fragment Length Po ly mor phism ) 作为最早的分子标记技术由Grozdicker创立, 并于1980年由Bostein再次提出[ 3] 。其原理是限制性内切酶能识别并切割基因组DN A分子中特定的位点, 如果因碱基的突变、插入或缺失, 或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生。那么利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA, 就可以得到长短、数量、种类不同的限制性DNA片段, 通过电泳和So uthern杂交转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上, 选用一定的DNA标记探针与之杂交, 放射自显影后就可得到反映个体特异性的DNA限制性片段多态性图谱。RFLP分析中所使用的探针通常是随机克隆的与被检测物具有一定同源性的单

拷贝或低拷贝基因组片段或cDNA片段。其中cDNA探针保守性较强, 许多同科物种cDNA 探针都可以作为通用探针。

RFLP 标记技术的优点是: (1) 标记广泛存在于生物体内, 不受组织、环境和发育阶段的影响。(2) RFLP标记的等位基因是共显性的, 不受杂交的影响, 可区分纯合基因与杂合基因。( 3) 可产生的标记数目很多, 可覆盖整个基因组。但是RFLP标记技术需要酶切, 对DNA质量要求高;由于编码基因具有相当高的保守性, RFLP的多态性程度偏低；分子杂交时会用到放射性同位素,对人体和环境都有害; 探针的制备、保存和发放也很不方便。此外, 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。所以, RFLP标记技术的应用受到一定限制。目前RFLP 标记技术已经在基因突变分析、基因定位、基因诊断、个体识别、亲缘鉴定、物种分类和进化关系研究, 以及组建高密度的遗传图谱和育种操作等方面都有一