分子标记技术

的分子标记，它又分为两类： ③基于 PCR的分子标记 的分子标记
基 于 PCR 技 术 的 DNA 扩 增 方 法 它 RAPD （Random amplified polymorphic DNA） DAF（DNA amplification fingerprinting） SSCP（Single strand confirmational polymorphism） 小卫星DNA（Minisatellite DNA） 小卫星 卫星DNA（Microsatellite DNA）,又 卫星 ISSR（Inter simple sequence repeat） AP-PCR（Arbitrary primer PCR） SCAR（Sequence characterized amplified region） 的 PCR标记 标记 SSR（Simple sequence repeat） 多 位 点 标 记 方 法
分子标记的特点
（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发 育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否 等问题； （2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限； 2 （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。
ISSR原理简介 原理简介
ISSR(inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz等于1994 年在微卫星基础上发展起来的一种新的分子标记。其基本 原理是:用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3‘端 或5’端加上2-4个随机核昔酸，在PCR反应中，锚定引物可 引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的 重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的两个SSR区 域之间的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩 增谱带多为显性表现。由于微卫星在基因组中广泛分布， 且等位变异特别丰富，因而可以检测到高的多态性。
应用领域
种质资源鉴定 遗传作图 基因定位 遗传多样性 系统与进化 分子生态学
PCR 产物需经电泳分离、染色显示后才能进行谱带观察、 统计。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前通用 的两种电泳技术。一般采用1.5%-2%的琼脂糖凝胶电泳或 5%-8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者EB 染色紫外光下观 察、拍照；后者经银染可见光下观察记录，拍照。一般当 琼脂糖电泳分离效果不理想时采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 谱带统计分析采用相关软件NTSYS 或PAUG。
特性 分布 遗传 多态性 等位检测 检测位点数 样品信息量 基因组区域 技术难度 重复性 DNA样品量 耗费时间 可靠性
RFLP 普遍存在 共显性 中 是 1~3 低~中 底拷贝编码 中等 高 2~30g 慢 高
RAPD 普遍存在 多数显性 高 不是 1~10 高 整个基因组 简单 中等 1~100ng 快 中等
分子标记的类型
①基于杂交的分子标记，如RFLP（Restriction fragment 基于杂交的分子标记 length polymorphism,即限制性长度片段多态性）。 ②基于 DNA序列和芯片的分子标记，如SNP（Single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）。
ISSR实验流程 实验流程
DNA提取及检测 提取及检测
引物设计 必须对扩增条件进行优化，包 括对Tag酶、引物浓度及其退 火温度、M g 2+浓度、模板浓 度等。
PCR扩增 扩增
电泳检测
结果统计及分析
引物设计是 ISSR技术中最关键、最重要的一步。基因组中SSR 一般 为 2~6个寡聚核苷酸，用于ISSR的引物常为 5’或 3’端加锚定的二核 苷酸、三核苷 酸、四核苷酸重复序列，重复次数 一般为4~Байду номын сангаас 次，使 引物的总长度达到 16~18bp 。 5’或 3’端用于锚定的碱基数目一般为 1~4个，锚定的目的是引起特定位点退火， 使引物与相匹配 SSR的一 端而不是中间结合，从而对基因组中特定片段进行扩增、检测。由于 植物基因组中SSR最多的 是 (AT) n、(TA) n、(GA) n 、(CT) n等二核苷 酸重复序列 ，在选择 ISSR引物时，应以二核苷酸重复序列为主，少 选寡聚三核苷酸、四核苷酸引物。
ISSR (Inter-simple sequence repeat) 分子标记技术
主讲人： 主讲人：关 锰
分子标记的概念
广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检 测的DNA序列或蛋白质。 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基 因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基 因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。 狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被 广泛采纳： 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片 片 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的 间的差异。 段，它直接反映基因组DNA间的差异。 它直接反映基因组 间的差异
STS (Sequence tagged site)
PCR 与 酶 切 相 结 合 的 方 法
AFLP（Amplified fragment length polymorphism） AFLP是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增
CAPS（Cleaved amplified polymorphic sequence） CAPS是先扩增，再酶切扩增
微卫星DNA 微卫星
Microsatellite，MS/Simple Sequence Repeat,SSR 短的，简单的串联重复序列； 基元是1-6个碱基(有的定义为1-5个碱基)； 广泛存在于真核细胞整个基因组的不同位置上； 特点 高度多态性(微卫星DNA长度的多态性) ； 微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列； 共显性标记。
SSR 普遍存在 共显性 高 是 1~5 高 整个基因组 简单 高 50-100ng 快 高
ISSR 普遍存在 多数显性 高 不是 0~50~ 0~50~更多 高 整个基因组 简单 高 2~50ng 快 高
AFLP 普遍存在 多数显性 非常高 不是 20~100 非常高 整个基因组 中等 高 100ng 中等 高
ISSR分子标记的特点 分子标记的特点
优点： 优点：ISSR 标记结合了RAPD 和SSR 的优点,所需DNA模 板的量少、多态性丰富, 无需试剂盒、结果记录方便、实 验成本低、操作简单、稳定性较高、呈孟德尔式遗传
缺点： 缺点：是PCR 扩增时最适反应条件需要一定时间摸索, 其 标记大多为显性标记, 在解决交配系统、计算杂合度和父 系分析等问题时效果不佳