植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
基因克隆过程及注意事项
以猪APOA2基因为例一．提取总RNATRIzol法提取RNATRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和总蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。
并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。
Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。
例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。
当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8使用TRIzol注意事项TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术植物遗传工程是指通过改变植物的遗传物质，以达到改良、改变或创新植物性状的目的。
其中基因克隆与转化技术是植物遗传工程中的关键技术之一。
基因克隆指的是通过将特定基因从一个生物体中分离并扩增形成DNA片段，使其能够在其他生物体中稳定表达。
转化技术则是将克隆的基因导入到目标植物体内，使其能够在植物表达并产生相应的功能。
一、基因克隆技术基因克隆技术是植物遗传工程中的关键环节。
首先需要从源生物体中分离出目标基因。
常用的方法有PCR扩增、限制酶切片段分离等。
通过PCR扩增技术，可以快速、高效地扩增目标基因，提供足够的DNA片段用于后续的克隆工作。
限制酶切片段分离则是利用特定的酶将目标基因从源DNA片段中切割出来。
接下来，克隆基因需要被插入到适当的载体中，常用的载体包括质粒和病毒等。
将基因插入载体后，需要通过转化技术将其导入目标植物体内。
二、转化技术转化技术是将克隆的基因导入到目标植物体内的关键步骤。
常见的转化技术主要有基因枪法、农杆菌介导法和化学法等。
基因枪法是通过将DNA微粒射入植物细胞，使基因得以导入的方法。
此方法简单、高效，对不同植物都适用，因此被广泛应用于植物遗传工程中。
农杆菌介导法则是利用农杆菌将目标基因导入植物细胞。
这种方法克服了基因枪法的一些限制，可以导入更长的DNA片段，但受适用植物种类的限制。
此外，化学法也是一种常用的转化技术，通过利用化学物质使植物细胞的细胞壁通透性增强，从而实现目标基因的导入。
三、应用前景与挑战基因克隆与转化技术在植物遗传工程中具有广阔的应用前景。
通过基因克隆和转化技术，可以实现对植物农艺性状的改良，提高植物的抗病虫害能力、耐逆性和产量，从而促进农业的可持续发展。
此外，利用基因克隆和转化技术还可以为植物生物制药、环境修复等领域提供解决方案。
然而，基因克隆与转化技术在应用过程中也面临一些挑战。
首先，对于目标基因的选择和定位仍然是一个复杂的问题。
植物基因克隆方法
RT-PCR实验中的常见问题与对策
问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 原因：
1）RNA被降解
建议解决方法：利用无污染技术分离RNA； 如果使用RNase抑制剂，不要
加热超过45℃或pH超过8.0。
2）RNA中包含逆转录抑制剂 建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（白质具有抗原性及 生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。
第22页，共46页。
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differential display)
（4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而PCR两 条模板链通过变性完全打开双链
（5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成可能不 同步
（6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合酶一般不 耐热
（7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的
（8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与
淀进行清洗。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍盐。
第10页，共46页。
3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法： 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）起始RNA量不够
建议解决方法：增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链
cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 5）RNA模板二级结构太多
• 目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转录因子 通常由一个DNA结合域（BD)和一个或多个与其他调控蛋白相互作 用的转录激活域（AD）组成。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋 白即是一种典型的转录因子。
克隆基因的操作流程
克隆基因的操作流程
克隆基因是一种基因工程技术，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。
克隆基因的操作流程包括以下几个步骤：
1. 选择目标基因：首先需要确定感兴趣的基因，这个基因可以是任何生物体中的基因，如人类、动物、植物等，也可以是一种人工设计的基因。
2. 剪切DNA：通过限制性内切酶，将目标基因从DNA分子中切割出来。
这些切割出来的DNA片段被称为限制性内切片段。
3. 连接载体：将目标基因插入到载体DNA中。
载体是一种DNA 分子，可以承载基因并将其引入到目标生物体中。
在这个步骤中，需要使用一种酶来将目标基因和载体DNA连接起来。
这个过程被称为“重组”。
4. 转化宿主细胞：将重组后的载体DNA转化到宿主细胞中，使宿主细胞能够表达目标基因。
5. 筛选：筛选出表达目标基因的宿主细胞。
这个步骤可以通过一些特定的实验方法来实现，如PCR、Southern blotting等。
6. 验证：验证目标基因是否被正确地插入到宿主细胞中，并且是否表达出来。
通过这些步骤，就可以成功地克隆基因了。
克隆基因技术在医学、农业、工业等领域中有着广泛的应用，可以用来生产新药、改良农作物品种、生产高效酶等。
植物基因克隆的方法
人工合成并克隆基因
方法：根据已知的氨基酸或核苷酸序列，采
用植物偏爱的密码子，人工合成并克 隆该基因。（可对基因进行改造）
例子：根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，人工合
成并克隆了此肽的基因。 人工合成Bt基因。
例子：根据甜菜碱醛脱氢酶基因序列克隆
局限性：1、基因定位依赖分子标记。
方法一：根据已知基因的序列设计并合成一
要求分离一个纯度很高的蛋白质.
因此可将与某一DNA标记连锁的基因在染色体上定位。
原理：
在转座过程中，原来位置的转座子并 未消失，发生转座的只是转座子的拷贝。 基因发生转座可引起插入突变，使插入位 置的基因失活并诱导产生突变型或在插入 位置上出现新的编码基因。通过转座子上 的标记基因（如抗药性等）就可以检测出 突变基因的位置和克隆出突变基因来。
analysis）
抑制性扣除杂交（suppression subtractive hybridization）
局限性：
表型克隆技术普遍存在着依赖于 PCR技术、重复性较差、加阳性率高、 对实验材料要求较高、材料间不能存 在过多的差异，结果不便确证等缺点。
功 能 克 隆（functional cloning）
1.2根据基因的表型突变互补功能
植物的许多基因与细菌或这一特性可分 离一些基因,如来自蛋白激酶基因和葡萄糖载 体基因等.利用此法分离基因需做大量的转 化工作,且转化细胞中突变体频率较低.
例子
1、分离纯化了黄瓜花叶病毒、马铃薯x病毒 等，并克隆了编码这些病毒外壳蛋白的 cDNA基因。
植物基因克隆的方法
优选植物基因克隆的方法
植物基因分离的图位克隆技术
有转 座子 示 踪 法 、 机 实 变体 筛 选 法 和 图位 克隆 法 。其 随
中 ． 座 子 示 踪 法 中 的 转 座 子 受 其 种 类 、 性 和 数 量 的 转 活
制约 ， 随机 突 变体 筛 选 法 随机 性 较大 且 不 能控 制 其失 活
基 因的种 类 和 数量 ， 限制 了其 应用 。 较 而言 ， 也 比 图位 克 隆 技 术 随 着 相 关 配 套 技 术 的 日 渐 成 熟 ， 成 为 分 离 基 因 已 的 常 规 方 法 ｔ 在 分 离 不 同 的 植 物 发 育 基 因 中 得 到 了 广 并 泛 的 应 用 。 本 文 对 图 位 克 隆 技 术 的 原 理 、 本 技 术 环 节 基 及 应用 作 一 介绍 ｌ 围位 克 隆技 术 的原 理 图 位 克 隆 技 术 叉 称 为 定 位 克 隆 技 术 ， 近 几 年 来 随 是 着 各 种植 物 的 分 子 标 记 图谱 相 继 建 立 而发 展 起 来 的 １ 种 新 的 基 因 克 隆 技 术 ； 是 根 据 目 的 基 因 在 染 色 体 上 的 它 位 置 进 行 基 因 克 隆 的 １种 方 法 ， 利 用 分 子 标 记 技 术 对 在 目 的 基 因 进 行 精 确 定 位 的基 础 上 ， 用 与 目 的 基 因 紧 密 使 连 锁 的 分 子 标 记 筛 选 ＤＮＡ 文 库 ， 而 构 建 目 的 基 因 区 从 域 的 物 理 图 谱 ， 利 用 此 物 理 图谱 通 过 染 色 体 步 行 逼 近 再 目 的基 因或 通 过 染 色 体 登 黯 的 方 法 最终 找 到包 含 该 目 的基 因 的克 隆 ， 后 通过 遗 传转 化 和 功 能 互 补验 证最 终 最 确 定 目的基 因 的碱 基 序列 。 ２ 围位 克 隆 的技 术 环节 ２ １ 筛选 与 目 的基 因紧 密 连锁 的分子 标 记 ． 筛选 与 目 的 基 因 连 锁 的 分 子 标 记 是 图 位 克 隆 技 术 的 关 键 ， 用 的 常 分 子 标 记 有 Ｒ Ｐ标 记 、 ＦＬ ＲＡＰ 标 记 、 卫 星 标 记 和 Ｄ 微 ＡＦ Ｐ 标 记 等 。 在 已 有 几 十 种 技 术 可 用 于 分 子 标 记 的 Ｌ 现 筛 选 ， 着 分 子 标 记 技 术 的 发 展 ， 些 植 物 的 遗 传 图 谱 随 一 构 建 和 比 较 基 因 组 的 研 究 也 为 分 子 标 记 的 筛 选 提 供 了 有 益 的 借 鉴 。 用 这 些 分 子 标 记 技 术 结 台 使 用 近 等 基 因 利
生物技术 园艺植物基因工程步骤
生物技术园艺植物基因工程步骤
园艺植物基因工程是指通过生物技术手段对园艺植物的基因进行改变或调控，以获得所需的遗传特性。
其步骤主要包括以下几个方面：
1. 目标设定：确定要改变的遗传特性和目标基因，例如提高植物的产量、抗性、品质等。
2. 基因克隆：从目标植物中提取DNA，并使用分子生物学技术将目标基因扩增、纯化，以获得目标基因片段。
3. 基因构建：将目标基因片段插入植物基因工程载体（例如农杆菌载体），并利用适当的限制性内切酶将其与载体DNA连接起来，形成重组DNA。
4. 转化方式选择：选择适合的转化方法将重组DNA导入目标植物细胞，主要有农杆菌介导转化、生物弹射法或冷冻融合法等。
5. 遗传转化：将经过构建的重组DNA导入植物细胞，使目标基因插入植物染色体，形成转基因植物。
6. 试管繁殖：对转基因植物进行离体培养，通过细胞分裂和组织增殖等技术，大规模繁殖转基因植物。
7. 筛选和鉴定：利用分子生物学和生化分析等技术对转基因植物进行鉴定和筛选，确认目标基因的存在和表达情况。
8. 田间试验和推广：在试验田或实际种植场进行转基因植物的田间试验，评估其生长发育、产量、品质和抗性等性状，同时进行安全性评估和环境风险评估。
9. 商业化推广：通过权威部门的安全评估和监管审核，将合格的转基因植物品种进行商业化推广，使其广泛应用于园艺产业。
需要注意的是，园艺植物基因工程步骤可能会因具体目标和植物而有所差异，以上步骤仅供参考。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤植物基因的克隆08医用二班姚桂鹏0807508245简介克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。
通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。
本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。
关键词植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法Plant gene cloningIntroductionCloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes meansbased on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. KeywordsPlant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy一、植物基因的结构和功能基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。
第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)课件
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14(2) 如何从cDNA中找到所需要的基因？15转录水平上的基因克隆方法
l 差别杂交筛选 l 扣除杂交 l 代表性差别分析 l 差异显示 l cDNA阵列杂交 l 基因表达系列分析 l 抑制差减杂交
筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法)因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 令检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：
令例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17kb ，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。
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n基于EST信息的基因克隆
EST
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由杨树EST库获得基因序列
PCNA
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克隆的核酸酶
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26
2、基因组水平上的克隆
将ry) ：将某种生物的基因组DNA切割成 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组
➢差别杂交筛选
含有表达 目的基因
不含有表 达目的基因cDNA 铺平板转膜 转膜提取分离 mRNA
cDNA 探针
提取分离 mRNA
cDNA 探针
比较 分析
用对照样品cDNA作探 针杂交的X光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的X光片中有 的印斑，可对照X光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因
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菌落杂交技术寻找目标DNA克隆
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文 库 的 抗 体 筛 选
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(2) T-DNA标签克隆基因
植物基因工程的一般步骤
植物基因工程的一般步骤一、目的基因的获取在植物基因工程中，首先需要获取目的基因。
目的基因是指那些对植物性状具有重要影响的基因，通过改变这些基因的表达或功能，可以实现植物的遗传改良。
目的基因的获取通常采用分子克隆技术，从植物基因文库或通过PCR等技术直接从植物组织中克隆目的基因。
二、植物表达载体的构建获取目的基因后，需要构建一个植物表达载体。
植物表达载体是一种将目的基因转移到植物细胞内的质粒或病毒载体，通常包括启动子、终止子等调控元件，以及选择标记基因等。
构建植物表达载体的目的是为了确保目的基因在植物细胞内的正确表达。
三、将目的基因导入植物细胞构建好植物表达载体后，需要将其导入到植物细胞中。
导入方法通常采用基因枪法、农杆菌转化法、花粉管通道法等。
这些方法各有优缺点，应根据目的基因和植物种类选择合适的方法。
四、目的基因整合到植物基因组中导入植物细胞后，目的基因需要整合到植物基因组中才能实现其功能。
这一过程通常需要采用分子生物学技术进行检测和鉴定，以确保目的基因已经正确地整合到植物基因组中。
五、目的基因的检测与鉴定为了确认目的基因是否已经表达以及表达水平如何，需要进行目的基因的检测与鉴定。
这一过程通常采用分子生物学技术，如PCR扩增、DNA测序、Northern blot、Western blot 等，对目的基因的表达进行检测和鉴定。
六、转基因植物的筛选与培育在目的基因成功整合到植物基因组中并表达后，需要筛选和培育转基因植物。
这一过程通常采用抗性筛选、分子检测等技术，对转基因植株进行多代选育，培育出遗传稳定性好、农艺性状优良的转基因植株。
七、转基因植物的遗传稳定性检测为了确保转基因植株的遗传稳定性，需要进行遗传稳定性检测。
这一过程包括对转基因植株的DNA进行多代跟踪分析，以评估目的基因的遗传稳定性及其对后代的影响。
八、转基因植物的安全性评估与环境释放在转基因植物培育成功后，需要进行安全性评估与环境释放。
植物基因分离的图位克隆技术
植物基因分离的图位克隆技术毛健民 李俐俐(周口师范高等专科学院生物系河南周口466000) DN A是遗传的物质基础。
遗传的基本单元是以基因的形式包含在DN A序列内。
要想从分子基础上来理解遗传的本质,基因的分离是最基本的前提。
现在分离和克隆植物基因的方法很多,如传统的功能克隆及近年来发展十分迅速的表型克隆。
但大多数情况下,我们并不知道基因的表达产物,在未知基因的功能信息又无适宜的相对表型用于表型克隆时,最常用的基因克隆技术有转座子示踪法、随机实变体筛选法和图位克隆法。
其中,转座子示踪法中的转座子受其种类、活性和数量的制约,随机突变体筛选法随机性较大且不能控制其失活基因的种类和数量,也限制了其应用。
比较而言,图位克隆技术随着相关配套技术的日渐成熟,已成为分离基因的常规方法,并在分离不同的植物发育基因中得到了广泛的应用。
本文对图位克隆技术的原理、基本技术环节及应用作一介绍。
1 图位克隆技术的原理图位克隆技术又称为定位克隆技术,是近几年来随着各种植物的分子标记图谱相继建立而发展起来的1种新的基因克隆技术。
它是根据目的基因在染色体上的位置进行基因克隆的1种方法,在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上,使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DN A文库,从而构建目的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因或通过染色体登陆的方法最终找到包含该目的基因的克隆,最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。
2 图位克隆的技术环节2.1 筛选与目的基因紧密连锁的分子标记 筛选与目的基因连锁的分子标记是图位克隆技术的关键,常用的分子标记有RF L P标记、R APD标记、微卫星标记和A FL P标记等。
现在已有几十种技术可用于分子标记的筛选,随着分子标记技术的发展,一些植物的遗传图谱构建和比较基因组的研究也为分子标记的筛选提供了有益的借鉴。
利用这些分子标记技术结合使用近等基因系(N ILs)或分离群体分组分析法(BSA)就可以快速地从数量繁多的分子标记中筛选出与目的基因紧密连锁的分子标记。
植物抗病性状关键基因的克隆及功能分析
植物抗病性状关键基因的克隆及功能分析植物的抗病性状是保持健康的重要途径。
许多研究表明，植物的免疫响应与特定的基因有关。
在最近的研究中，研究人员已经克隆了一些植物抗病性状的关键基因，并对它们进行了功能分析。
本文将探讨这些研究的进展和意义。
一、克隆关键基因研究人员通过利用系统发育学、转录组学等手段，克隆了许多与植物抗病性状相关的基因。
例如，研究人员克隆了拟南芥的RPS5基因，它是拟南芥抗菌性的主要基因之一。
当拟南芥感染革兰氏阴性菌Pseudomonas syringae时，RPS5基因会激活拟南芥的免疫反应，使其产生一种叫做PAMPs的抗病物质。
具有RPS5基因的拟南芥在受到Pseudomonas syringae的侵染时能够快速抵抗病原体，从而减少了植物的损失。
此外，还有一些其他的关键基因被克隆了出来。
如拟南芥的EDS1和PAD4基因，这两个基因在植物抗病反应中发挥了重要作用。
EDS1和PAD4在植物免疫反应的前线，调控着植物抗病反应中的许多关键基因，从而增强了植物的免疫能力。
二、功能分析研究人员通过功能分析揭示了植物抗病基因在免疫响应中的作用机制。
例如，在拟南芥的抗病性中，RPS5基因的激活能够诱导许多免疫反应的基因，促进植物产生抗病物质。
这些抗病物质可以诱导一系列转录因子的激活，从而增强植物免疫反应。
此外，在MOI1基因的研究中，研究人员发现 MOI1 参与调控 E3 Ligase RING-BOX1（RBX1) 的 Ub 结合活性及其对 PAD4和EDS1的泛素化，从而激活 PAD4 和 EDS1 的活性。
这表明了 MOI1 在调节植物抗病性中的重要作用。
三、意义与展望研究植物抗病基因的意义在于提高植物抗病能力，减少病害对植物生长和产量的损失。
未来，研究人员将继续探索植物抗病性状的分子机制，同时，通过基因编辑技术和基因组学方法，研究人员可以设计出更具抗病性的作物品种，以满足人们对食品的需求。
植物抗旱性相关基因的克隆及其功能研究
植物抗旱性相关基因的克隆及其功能研究植物作为一种生命体，其中最基础的生理需求之一就是水分。
然而，在严峻的自然环境下，植物往往会面临着旱、涝等各种极端环境的压力，从而限制它们的生长和发展。
因此，寻找植物抗旱性相关基因已经成为了研究的热点之一。
一、基因克隆的过程在认识植物遭受旱情况下的应对机制之前，我们必须先了解基因的概念和克隆技术的原理。
基因是细胞内控制生长和发育的最基本单元，它负责着编码某一种功能性蛋白质或RNA分子的信息。
与此同时，基因在生物体中表现出来的物理表现形态则称为表现型。
因此，当我们想要了解某一种植物抗旱性的原理时，就需要通过克隆相关基因并进一步研究它们的功能。
那么，基因克隆的过程该如何进行呢？一般情况下，基因的克隆可以分为以下主要步骤：首先需要从植物中抽取一份总DNA，并进行酶切（即剪切DNA分子）；然后将切割后的DNA片段放入载体（如质粒）中；再将载体转化至宿主细胞内进行培育和筛选；最后，通过测序和分析，确认载体中所含有目标基因的DNA序列。
二、植物抗旱性相关基因既然了解了基因克隆过程的基本原理，接下来就可以具体研究植物抗旱性相关基因了。
在多年的研究中，科学家们已经确定了许多影响植物抗旱性的基因，其中不可或缺的几个基因包括：1.敲除基因DREB1A：它是一种调节植物抗旱性的转录因子，通过激活多个生物代谢途径而提高植物的抗旱能力。
2.敲除基因SRG：它在植物抗旱性方面的发挥机制比较特殊。
一方面，它可以激活组成叶绿体二级结构的相关基因，从而修复受到旱情况下的叶绿体结构；另一方面，它也可以抑制叶绿素合成，在极端干旱的情况下促使植物速速进入休眠状态。
3.抑制基因TFIIAβ-4：它是一种拓扑异构酶，能够强烈抑制植物中的ABA合成，进而让植物免于遭受旱情况下的生长压力。
三、基因功能的研究对于植物抗旱性相关基因的研究，其中关键的一步就是了解它们的具体功能。
一般而言，我们可以通过以下几种方法来了解目标基因的功能：1.敲除或过表达基因：通过基因工程技术，可以剔除或过度表达目标基因，从而进一步证明该基因对植物抗旱性的贡献。
植物基因克隆研究进程分析
植物基因克隆研究进程分析作者：李卓雨来源：《种子科技》2022年第03期摘要：随着科学技术的发展及人类基因工作的推进，植物基因克隆技术研究取得了一定的成就。
近年来，我国植物基因克隆技术有了新发展，玉米、小麦及水稻等均克隆了较多与植物产品品质、产量等相关的基因。
就植物基因克隆技术展开研究，以供借鉴。
关键词：植物;基因;克隆技术文章编号：1005-2690（2022）03-0010-03 中国图书分类号：S336 文献标志码：B植物基因克隆技术是现代生命科学的关键组成，也是现代生命科学技术最为关键的要素，基于20世纪70年代初级DNA体外重组技术的诞生，经历了甄别、分离特异性的基因并得到基因完整的序列，明确其在染色体上的确切位置，阐明其生化功能，以及结合生物工程方式应用于生产实践中的过程[1]。
通常基因克隆策略包含两类，即正向遗传学方式和反向遗传学方式。
前者主要以待克隆基因所表现出的功能为前提，基于对包括基因表达产物及其表现现状实现克隆，包含了功能方面以及表观方面等多个部分;后者更多综合基因自有的序列或基因组之中的特殊点位进行克隆，如定位克隆和同源序列法克隆等。
随着DNA测序和生物信息学等理念不断完善，电子克隆等新兴技术诞生[2]。
目前，包括烟草在内的多类植株已在品质、抗性以及性状等多个维度实现了克隆。
对植株基因克隆涉及的相关技术进行分析，可以更好地了解植物基因克隆技术的发展过程，并对其未来发展趋势进行展望。
1 功能克隆技术功能克隆是以蛋白质的功能为基础进行的基因克隆，主要内容是综合确切的生化问题或已知与这一功能存在关联性的蛋白质，对纯化蛋白进行分离，测定出相关氨基酸序列，结合遗传密码研究明确潜在的编码序列，开发出相关的核苷酸探针、杂交筛选基因组文库等，基于抗原反应锁定特异克隆，完成测序处理，继而获得对应的序列。
结合该形式克隆基因的核心分离得到纯蛋白，得到其部分序列以及相关抗体，随后搭建基因组文库，并结合文库予以筛选[3]。
植物分子生物学植物基因的同源克隆PowerPoint 演示文稿
植物总RNA提取的难点 1.内外源RNase的污染。 2.多酚类物质的干扰 3.蛋白质的干扰 4.多糖的干扰
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创造一个无RNase的环境
20
1.器械的消毒：用0.1%DEPC—二乙基焦碳酸盐 （Diethyl Pyrocarbonate )浸泡处理2hr以上， 然后高压灭菌去除DEPC；或高温（250℃） 干热消毒4hr以上或200℃干热消毒过夜。
9
植物DNA提取的难点
1.多酚类物质的干扰:多酚类物质被氧化后，与DNA 分子发生不可逆的结合，使提取的DNA样品呈棕 褐色。
2.多糖类物质的干扰：多糖与DNA形成粘稠的胶状 复合物，DNA被包埋在这种复合物中难于溶解。
3.其它次生物质的干扰：乳胶、树脂等，与DNA共 沉淀。 这种褐色、粘稠的DNA不易被限制性内切酶和Taq DNA聚合酶所识别，从而导致PCR扩增和酶切的 失败 。
29
植物RNA提取过程中蛋白质污染的排除
30
1.在冷冻条件下研磨植物材料，以抑制 RNase的活性。 2.在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂（苯 酚、胍、SDS、CTAB等）。 3.利用蛋白酶K降解蛋白质。 4.利用苯酚、氯仿抽提。 5.用70%高氯酸钠溶液沉淀蛋白质。
31
植物DNA和RNA的检测
5.研磨时加入大分子聚合物或吸附剂除多酚： PVP、PVPP：2-6.0%（W/V）；活性炭： 0.1-0.3%（W/V）。
13
6.高盐去多糖法：在氯仿/异戊醇的抽提后的水相 中加入0.5V的5MNaCl混匀，然后加入2V的无 水乙醇沉淀DNA，大部分多糖留在上清液中； 在DNA的水溶液中，加入5MNaCl使其终浓度 为0.5-3.0M，以2.0M除糖效果最好。
植物基因的同源克隆
植物中抗逆性相关基因的鉴定与克隆
植物中抗逆性相关基因的鉴定与克隆随着全球气候的变化和环境的污染，植物遭受的压力越来越大，为了能够适应这些压力并保持生长和发育能力，植物本身有着很多抗逆性相关基因。
这些基因的鉴定和克隆对于植物的研究和生产具有重要意义，本文将详细介绍这方面的内容。
一、什么是抗逆性相关基因？抗逆性相关基因主要是指植物为了适应环境压力而产生的各种抗逆性基因，这些基因可以激活植物本身的防御机制，进而提高植物的适应性和生存能力。
比如，有些植物会在遭受干旱等环境压力时，产生一些蛋白质分子，这些分子可以保持植物内部的水分平衡，从而减缓植物的水分流失，提高其抗旱能力。
二、抗逆性相关基因的鉴定方法抗逆性相关基因的鉴定方法主要有以下几种：1.基因芯片基因芯片技术可以同时检测和分析上万个基因的表达情况，包括植物的各种抗逆性基因。
这种方法操作简单、快速，能够大大提高基因鉴定的效率。
2. 差异表达分析差异表达分析主要是通过比较不同条件下植物的基因表达情况来鉴定抗逆性相关基因。
比如，在干旱和正常状态下分别收集植物的RNA样品，然后通过高通量测序技术分析RNA序列，找出不同条件下不同表达的基因，然后通过生物信息学工具分析这些基因的功能，最终确定哪些基因是抗旱相关的基因。
3.基因组学方法基因组学方法是指通过对植物基因组的全面分析和比较，鉴定出抗逆性相关基因。
比如，对于某些已经被鉴定出来的抗逆性相关基因，可以通过生物信息学方法在其他植物基因组中进行寻找，并带领这些基因进行鉴定和分析。
4. 蛋白质组学方法蛋白质组学方法是指通过分析植物不同环境条件下的各种蛋白质组成变化，从而鉴定和分析抗逆性相关基因。
蛋白质组学方法主要包括两种技术：蛋白质质量分析和蛋白质结构分析。
这些方法可对所提取的蛋白质进行扫描冷冻电子显微镜（Cryo-EM）分析，从而测出其三维结构，从而确定哪些蛋白质是抗逆性相关的。
三、抗逆性相关基因的克隆方法鉴定出抗逆性相关基因后，下一步的任务就是进行基因克隆。
植物抗病基因的克隆与鉴定
植物抗病基因的克隆与鉴定植物病害是世界各地农民和园艺爱好者所面临的一个普遍问题。
为了保护农作物和花卉的健康，植物学家和遗传学家们一直在致力于研究植物抗病基因的克隆和鉴定。
抗病基因的发现与研究为了确定植物中的抗病基因，研究人员首先需要从这些植物中分离出基因。
基于现代分子生物学技术，研究人员能够对基因进行克隆和鉴定。
最近，科学家们在研究拟南芥的抗黑线病基因时取得了一定的进展。
研究表明，该抗病基因能够依靠其基因编码产物来刺激植物的免疫反应，从而保护植物不受病原体的伤害。
抗病基因的克隆与鉴定抗病基因的克隆过程通常包括两个步骤：DNA文库构建和筛选。
DNA文库是指植物细胞中所有基因序列的集合。
文库中的DNA通常是通过群体DNA提取方法或单细胞PCR方法获得的。
研究人员将DNA文库插入DNA载体中，构建出含有全部植物基因序列的基因文库。
接下来，研究人员需要验证一些基因是否为抗病基因。
通常这种工作是通过功能鉴定进行的。
功能鉴定的方法有很多种，包括转基因技术、基因敲除技术、基因启动子分析和蛋白质互作鉴定等。
利用这些技术，研究人员可以确定哪些基因与植物的免疫反应有关联。
抗病基因的功能分析与利用基因鉴定后，研究人员通常会进行功能分析和利用。
其中一种方法是通过转移、喷雾或浸泡等方式利用基因工程技术将抗病基因转接到植物中去。
这个过程通常称为转基因。
转基因作物被引入后，它们就能够抵御一系列的病原体，从而提高农民的产量和收益。
此外，研究人员还在寻找其他类型的抗病基因。
研究表明，一些植物物种的抗病基因和人类免疫系统中的基因有些相似之处。
这可能意味着这些植物基因能够为人类的免疫系统研究提供思路。
未来，研究人员将继续利用分子生物学和基因工程技术去寻找新型抗病基因，从而保护我们的农业和花卉生产。
植物转基因的操作流程
植物转基因的操作流程
植物转基因的操作流程主要包括以下步骤：
1. 选取目标基因并克隆
根据需要改良的性状选取对应的基因，并利用分子生物学技术从已知的基因库中克隆出该基因的DNA序列。
2. 构建基因载体
基因载体是将外源基因导入目标细胞中的工具。
将已克隆好的目标基因插入基因载体的适当位点，并加入一些必要的辅助元件（如启动子、终止子和激活子等）来调控基因的表达。
3. 转化植物细胞
把构建好的基因载体经过化学方法或物理方法导入目标植物细胞中，使其成为转基因细胞。
4. 筛选转基因植物
利用特定筛选工具（如抗生素抗性或苯丙烯酰胺酶等）来区分转基因细胞和非转基因细胞，从而筛选出转基因植物。
5. 鉴定转基因植物
采用多种方法（如PCR、Southern blot、Northern blot等）来验证转基因植物中是否成功导入了目标基因，并确定其正确性
和表达级别。
参考资料：
1. 罗欣. 十五种转基因植物的制备方法和应用. 生物工程学报, 2007, 23(9): 2247-2254.
2. 陆典昭, 龙光. 植物转基因技术的研究现状及展望. 科技信息, 2018, 33(34): 160-162.
3. 王若荃, 王磊. 植物转基因的技术流程及其应用研究进展. 河南农业科学, 2012, 41(11): 2-6.。
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植物基因的克隆
08医用二班姚桂鹏0807508245
简介
克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。
通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。
本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。
关键词
植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法
Plant gene cloning
Introduction
Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords
Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy
一、植物基因的结构和功能
基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。
一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。
（一）植物基因的启动子
启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。
（二）植物基因的增强子序列
增强子（enhancer）是另一类调控基因表达的DNA序列，其中包含有多个能被反式作用因子识别与结合的顺式作用元件。
（三）植物基因的起始子序列
起始密码子前后的序列被称为其实子序列。
它在核糖体识别和翻译的其空中有重要作用，起始子序列的特性直接影响着翻译过程中核糖体识别及翻译的效率。
（四）植物基因的加尾信号序列
（五）植物基因的密码子偏好
虽然所有生物大多使用通用的密码子系统，但植物基因在同义密码子间的选择上有一定的偏好。
二、基因克隆的载体
基因克隆的目的是使目标DNA片段得到扩增或表达，但是外援DNA片段本身不具备自我复制和表达的能力，所以必须借助于“载体”及其“记住细胞”来实现外源DNA片段的扩增和表达。
所谓载体（vector）是一类能够携带外源DNA片段进入寄主细胞内，并实现外源DNA片段复制或表达的DNA分子。
按照载体功能的不同，可分为克隆载体和表达载体两大类。
克隆载体的用途是在寄主细胞中扩增外源DNA片段；表达载体的用途主要是在寄主细胞中实现外源DNA的表达。
按照载体的组成不同，又可分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体和人工染色体载体等几种。
（一）质粒载体
1、质粒是一种广泛存在于细菌细胞中染色体以外的能自主复制的裸露的环状双链DNA 分子，它的结构比病毒更简单，既没有蛋白质外壳，也没有细胞外生命周期。
2、质粒载体的特征
作为基因克隆的载体必须具备以下特征能在记住细胞中进行独立复制和表达；具有1~2个选择标记；具备多克隆点，自身分子量较小。
（二）噬菌体载体
（三）黏粒载体
（四）人工染色体载体
三、基因克隆的工具酶
在基因克隆的过程中，DNA分子的切割、连接、修饰及合成等操作都会涉及到一系列工具酶的应用。
比如，限制性核酸内切酶、DNA连接酶、末端转移酶、碱性磷酸酶、DNA聚合酶以及反转录酶等，下面就对这些工具酶的特点及应用进行简要的介绍。
（一）限制性核酸内切酶及其应用
1、分类
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。
根据限制酶的作用特点可将限制性核酸内切酶分为三种类型，及I型、II型和III型。
I型限制性核酸内切酶是一种单一的多功能酶，兼具限制酶、修饰酶、ATP 酶和DNA 解旋酶的功能。
II型限制性核酸内切酶是基因工程中的最重要的工具酶之一。
其主要原因是，组成II型酶的限制-修饰系统的限制酶和修饰酶是独立分开的，且II型限制酶的分子量较小；在酶切反应时，进需哟啊Mg作为辅助因子，而且可以精确特异性。