3第三章_外植体的选择和灭菌
植物组织培养
• 培养室最重要的因子是温度，一般保持 在20~27°C左右，具备产热装置，并安 装窗式或立式空调机。
• 室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持 在70%~80%为好，可安装加湿器。
• 控制光照时间可安装定时开关钟，一般 需要每天光照10~16小时，也有的需要连 续照明。
• 现代组培实验室大多设计为采用天然太 阳能作为主要能源，这样不但可以节省 能源，而且组培苗接受太阳光生长良好， 驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。
水
培
无机盐
养
基
有机物
成
分
植物激素
培养体支持材料 辅助性物质
• 水（H2O）
• 配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母 液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程 发霉变质。
• 大规模生产时可用自来水。但在少量研究 上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不 良效果。
无机盐
• 元素名称
添加形式
•
N
• 大量
P
• 元素
它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛用于 植物的器官、花药、细胞和原生质体培养效果 良好。
（2）B5培养基：是1968年由Galmborg等为培养大 豆而设计的。
特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的 生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养 基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。
（3）White培养基：是1943年由White为培养番茄 根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White 改良培养基，提高了MgSo4的浓度和增加了硼素。 特点是无机盐数量较低，适于生根培养。
（5）再分化（redifferentiation）：将脱分化 形成的愈伤组织转移到适当的培养基上继续培 养，这些无定形的愈伤组织又会重新分化出根、 茎、叶、花形成完整植株的过程。
2-2外植体
衰败型
NH4＋ 生长素
保守分裂型
NH4＋ 生长素
细胞分裂素 NO3-
亢进分裂型
成功案例：王海波（1989）通过调整培养基中 2，4-D的水平建立了小麦胚性愈伤组织无性系， 诱导了松脆愈伤组织，建立了悬浮系，游离原 生质体
六、愈伤组织的细胞分化
维管组织是最先分化的组织。
1 影响维管组织分化的因子 （1）生长素 （2）蔗糖（麦芽糖、海藻糖） （3）细胞分裂素 （4）温度、光照
栽培胡萝卜： 培养基中不含还原氮，只要氧化氮浓度相 当高，也能形成体细胞胚，但发生率低。 还原氮和氧化氮的最适合比是 10mmol/L : 40mmol/L
只以还原氮为氮源时，经常调节培养基的 PH值使其保持在5.4，胚胎发生率可与两种 氮比例适宜时相当。但当PH在4天内降到 4-3.5，对胚胎发生有抑制。 最低数量的内源还原氮量：5mmol/kg鲜组 织。
1%
2% 2.5－3.5% 4%
很少形成
形成 形成 很少或不形成
不形成
很少或不形成 形成 形成
但葡萄糖、果糖、其它单糖无作用。生长 素对维管组织分化所起的作用在很大程度 上取决于糖的存在。
第六节
愈伤组织中的形态发生
一、器官发生（organogenesis)（茎芽分化） 二、体细胞胚发生(somatic embryogenesis) 三 人工种子
禾谷类植物
外植体 诱导培养基（2，4-D） 愈伤组织
再生培养基（分化培养基）
（不含2,4-D或含IAA或NAA） 茎芽分化
苜蓿
外植体 诱导培养基（2，4-D，激动素） 愈伤组织
再生培养基（分化培养基）
浅析植物离体快繁过程中常见的问题
目录摘要 (1)关键词……………………………………………………………………………………………1 Abstract……………………………………………………………………………………………1 Keywords (1)1 污染 (2)1.1 污染的种类 (2)1.2 污染的因素 (2)1.2.1 外植体本身 (2)1.2.2 外植体灭菌 (2)1.2.3 接种和培养环境 (3)2 褐化 (3)2.1 褐化原因 (3)2.2 影响褐变的因素 (3)2.3 防止褐变的方法 (4)2.3.1 外植体的选择 (4)2.3.2 适宜的培养基和培养条件 (4)2.3.3 加入抗氧化剂和吸附剂 (4)2.3.4 反复转接 (4)3 玻璃化 (4)3.1 玻璃化苗的特点与发生原因 (4)3.1.1 玻璃化苗的特点 (4)3.1.2 发生原因 (4)3.2 影响玻璃化苗的因素 (5)3.2.1 生长调节剂 (5)3.2.2 温度 (5)3.2.3 湿度 (5)3.2.4 消毒方法 (5)3.2.5 光照时间 (5)3.2.6 培养基 (5)3.2.7 继代次数 (5)4 其他常见问题及其解决措施 (5)4.1 初始培养阶段 (5)4.2 继代培养阶段 (6)致谢 (7)参考文献 (7)浅析植物离体快繁过程中常见的问题摘要探讨了影响了植物组织培养的主要因素，分析了污染、褐变、玻璃化及其他常见问题，并提出了解决措施。
认为：污染主要是由灭菌不彻底和环境不洁造成的，加强外植体和培养基的灭菌，对培养环境及其用具彻底消毒，可大大降低污染率。
植物品种、取材部位及环境条件与褐变的发生密切相关，选择适宜的外植体，进行外植体，调价抗氧化剂和吸附剂等可有效控制褐变。
培养基的种类、温度、通气状况等会影响玻璃苗的发生，选择适当培养基，降低温度，增强光照，改善通风等可使玻璃化率降低。
关键词组织培养；污染，褐化，玻璃化According to the rapid propagation process of in vitro incommon problemAbstractDiscusses the influence of the main factors of plant tissue culture, this paper analyzes the pollution, Browning, vitrification and other common problems, and proposes the measures. Think: pollution is mainly composed of sterilization is not complete and the environment caused by the unclean, strengthen the explant and culture medium sterilization for training environment and its appliance disinfection, can greatly reduce the rate of pollution. Plant variety, based site and environment and the occurrence of Browning closely related, the choice of appropriate explant, explant, introduce antioxidants and adsorbent, etc can effectively control the Browning. The kinds of culture medium, temperature and ventilation situation will influence the occurrence of glass seedlings, choose proper culture medium, reduce the temperature, and enhance the illumination, improve ventilation can make glass transition rate to decrease.KeywordsTissue culture; Pollution, Browning, vitrificatio1 污染污染是指在培养过程中由于外界真菌、细菌或植物材料的内生菌所侵染，从而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败。
外植体及消毒
灭菌(STERILIZATION)
6、培养室灭菌
熏蒸灭菌： 2ml/m3甲醛 + 0.2g/m3 高锰酸钾
新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次； 隔2-5天用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰
酸钾擦架1次； 喷洒75%酒精灭菌降尘。
消毒(SANITIZATION)
消毒(Sanitization)：杀死、消除或抑制部分微生 物，使之不发生作用。
因此，外植体选择需要具有明确的目的，选择具有一 定代表性的基因型，以提高成功率及实用性。
外植体取材部位
不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导 条件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有 的部位很难脱分化，或者再分化频率很低，甚至只 分化出芽不长根或只分化出根而不长芽。 如百合科不同属的植物:风信子、虎眼万年青易于 再生形成小植株、而郁金香较难；同种百合鳞茎的 鳞片外层比内层再生能力强，下段比中上段再生能 力强。 对大多数植物来讲，茎尖是较好的部位，其形态 已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，但易受材 料来源的限制。因此，茎段、叶片、花粉、胚珠等 材料也是常用的取材部位。
抗生素（ANTIBIOTIC）
烟草、西番莲的组培中发现，植株下部组织产生营养 芽的比例高，而上部组织产生花器官的比例高；木本 植物幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条做外植体效果 较好。
外植体大小
外植体的大小，应根据培养目的而定。
如果是胚胎培养或脱毒，则外植体宜小；如果是进行 快速繁殖，外植体宜大。
但外植体过大，杀菌不彻底，易于污染；过小 离体培养难于操作、成活。
一般外植体大小在0.5—1.0cm为宜。具体说叶片、花 瓣等约为5mm2，茎段则长约0.5mm，茎尖分生组织带 一两个叶原基0.2—0.3mm大小等。
植物组织培养-外植体的选择与建立
第三节 外植体（培养物）的建立
污染（Infection） 能否有效地控制微生物污染是植物离体培养是否成功的关键技术之一。对于离体培养的 探索性研究实验，污染会导致实验失败；对于大规模的离体繁殖生产来说，污染使生产 成本大大增加。因此，无论是科研机构还是生产厂家都十分重视微生物污染问题。 植物离体培养中的污染可分为外植体、培养基、无菌操作和培养环境四个方面。其中培 养基和无菌操作方面的污染，目前已得到十分有效的控制。外植体方面污染最复杂，也 最难控制，其可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生性的，也可 能是内生性的。近年来，国外较重视各种微生物的鉴定，并根据不同的微生物种类采取 相应的控制措施，这方面的研究进展较快。
（3）、污染估算及对策：
污染估算：首次接种通常污染率 40—60% 按40%计：接种100个材料 1个材料/容器：
污染量=100X40%=40 获得量=100-40=60。 2个材料/容器： 2污染：1X40%X40%=16% 1污染：2X40%X40%=32% 2未污染：60%X60%=36% 弃掉 污染率=100-36=62% 污染量=100X62%=62
添加标题
不具原基结构的外植体：根、茎、 叶、花、果等器官，需要脱分化。
第二节 外植体 （培养物）的 选择
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的 选择
第二节 外 植体（培养 物）的选择
第二节 外植体（培 养物）的选择
4、根据外植体的大小选择： 外植体大小 外植体建立 外植体大小与外植体建立
第三节 外植体（培养物）的建立
第三节 外植体（培养物）的建立
三． 褐化发生的可能因素： 与组培植物品种有关： 不同的植物种与品种之间常有很大差异，有人把此归结为基因型的
4 外植体的选择和灭菌
吐温的使用:0.1%,表面活性剂, 吐温的使用:0.1%,表面活性剂,浸润作用 无菌水: 无菌水:在用灭菌剂之前和之后均需用无菌水冲 洗数遍. 洗数遍.
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二,外植体的灭菌方法
具体的灭菌方法和步骤: 具体的灭菌方法和步骤:依不同的材料而不同
P61:图4-1 P61: 植物外植体消毒的一般程序
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第三节 外植体的接种和培养
二,外植体的接种
擦—冲—开—灭—切— 冲 开 灭 切 烧—取—烧—夹—放—烧—包 取 烧 夹 放 烧 包
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三,培养条件
温度:25±2℃; 温度:25±2℃; 光照:包括光照,光质和光周期; 光照:包括光照,光质和光周期; 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 pH:5.6 离子, pH应在5.2以下 应在5.2以下. 离子, pH应在5.2以下. 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 培养 室的湿度70 70室的湿度70-80%. 气体: 气体:氧;二氧化碳;乙烯等. 二氧化碳;乙烯等.
2
Байду номын сангаас
外植体种类
带芽外植体 胚 分化器官, 分化器官,组织 花粉, 花粉,雌配子体中的单倍体细胞
3
外植体的部位选择
原则上可用植物的任何部位; 原则上可用植物的任何部位 但不同种类植物及同 一植物的不同部位对诱导条件反应不同; 一植物的不同部位对诱导条件反应不同 选择优良种 质,增殖能力强的外植体 外植体应容易得到 应考虑得到无毒苗 注意:外植体的幼化程度,年龄 与着生部位. 注意:外植体的幼化程度, 与着生部位. 易形成花器官. 植物主轴 向上的部分 生理年龄老 易形成花器官 向基部的部分 生理年龄小 易形成根等器官. 易形成根等器官 幼年组织较老年组织具有较高的形态发生能力
组培苗生产技术—外植体的选择、处理与接种(植物组织培养课件)
3、蔬菜（龙牙百合） 龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎 包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶 多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵 呈喇叭状长筒形，白色，有清香。
不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外 植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常 生长和繁殖.
• 消毒剂的要求 • 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的
组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后 外植体的生长和分化.
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果
2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
（二）实例分析 1、花卉（非洲菊） • 常用茎尖、嫩叶、花托进行非洲菊的组织培养，也有利用
种子进行组织培养的。 • 茎尖培养操作麻烦，但对于脱毒苗的生产是最有效的。 • 花托培养可直接成苗， 既可保持种性，又易行、 耗时短，是首选的外植体。
• 首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选 择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进 行取材。
• 一旦选出优株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花 蕾。作为外植体的花蕾要选取直径在1㎝左右，而且未露 心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果 。
2、水果（草莓）
（1）选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7 月份最为适宜。
龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托 、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞 片作外植体的较多。
外植体的选取
百合组培快繁（二）---外植体的选取、灭菌与接种一、实验的目的和意义通过动手操作，掌握组织培养材料的选取、表面消毒、灭菌、及无菌操作的技术，并掌握各种不良现象出现的可能原因和改进方法。
二、实验材料百合成株、子球等烧杯、量筒、玻璃棒、培养皿、镊子、解剖刀、剪刀、酒精灯；无菌水、乙醇、0.1%升汞；超净工作台等。
三、实验步骤与操作(一)培养材料的灭菌未受病害、虫害侵袭的植物组织块内部被看作是无菌的。
因此，只要用化学灭菌剂对植物材料进行表面灭菌，便成为无菌材料。
常规灭菌方法按如下步骤进行：1、材料的选取与清洗（1）选择无病斑，虫害植株作为取材母株。
（2）剪取所需叶片(整片)与茎段(2～3~m长)。
一般为茎尖、嫩叶、花蕾等幼嫩部位。
（3）除去老叶，把上述材料先置于烧杯中，然后放在自来水下，用流水冲洗20-60分钟，而后用无菌水冲洗1-3次。
2、表面灭菌（1）将植物材料放在有盖容器中，倒入75%酒精使之没过外植体，并轻晃以除去气泡，经过10-20秒，将乙醇倾去，用无菌水冲洗外植体。
因为酒精的渗透力很强，不宜灭菌时间过长。
（2）接着用0．1％的升汞溶液浸泡外植体5～10分钟，处理过程中要轻摇2-3次，将外植体表面的气泡除去。
（3）灭菌结束后，倒出消毒液，用无菌水冲洗3-6次。
沥干水分备用。
如果材料本身带菌，则可在培养基内加入少量抗生素，如橄榄霉素20ppm，氨苄青霉素50-500 PPm与适量制霉菌素。
以便控制细菌与霉菌的生长，在抗菌素培养基上经多次继代培养，可使植物组织无菌化。
常用的灭菌剂及其效果详见下表(2—1)。
（二）无菌操作1、花卉组织培养常用的接种工具和试剂有镊子、剪刀、解剖刀、解剖针、酒精灯、酒精棉、消毒剂、无菌水等。
这些工具在使用前必须严格消毒。
2、接种前，无菌室要用紫外灯或化学杀菌剂(如甲醛、来苏水等)消毒，紫外灯照射要在30min以上。
在进行室内消毒时，要注意人身安全和过敏反应，比如，要防止紫外灯长时间照射和甲醛等化学试剂对人体的毒害作用。
组织培养解答
2）丛生芽方式 培养基：为了促进丛生芽的形成，细胞分裂素与生长素的比值应该较大。 但是细胞分裂素的浓度不宜过高，否则多次继代后会造成外源激素在体 内的积累，而抑制内源激素的作用，使植物生长封顶，茎细弱，叶片细小 卷曲，形成类似莲座状的结构。所以，在进行培养时，要注意激素的搭配 比例，或与其它种类的细胞分裂素进行一定轮次的交替使用，增加生产的 稳定性，降低无效苗消耗。 但增殖过程中要尽量避免基部愈伤组织上形成的不定芽，尤其不能将不 定芽用于中间繁殖体的继代增殖，以增加生产的稳定性。 不同植物种类，甚至不同品种，丛生芽的增殖能力差异比较大，进行大 规模的商业化生产时，应注意及时调整培养基，减少各种无效消耗。这种 繁殖方式是目前生产中应用最普遍的类型。 应用：这种方式与短枝扦插型类似，遗传性状稳定，而且成苗速度快，繁 殖量大，适合于大规模的商业化生产，适合丛生型植物种类，如非洲菊、 菊花、玉簪、萱草等。
4.原球茎(protocorm)的发育
在兰科或部分球根植物培养中应用较多。原球茎最初是兰花种 子发芽过程中的一种形态学构造，种子萌发初期并不出现胚 根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，胀大的胚呈小 圆锥状，称做原球茎。常从茎尖、种子或侧芽的培养中产生 一些原球茎，原球茎本身可以增殖，也可萌发成小植株。
二者区别 胚状体能形成植株，而不定芽也能形成植株，二者有什么区别 呢？ ①起源 胚状体：形成的初级阶段，多来自单个Cell，很早就具有明显 的根端与菌端的两极性结构，不需诱导生根直接形成植株。 不定芽：最初是由分生细胞团形成单极性的生长点，发育为芽， 再转移至生根介质中，诱导形成根，然后才能形成完整的植 株。 ②与周围Cell的联系不同 胚：由胚状体发育成的小植株与周围Callus母体组织块几乎没 什么结构性联系；小植株是独立的，易于分离。 不定芽：不定芽与母体组织和Callus之间有着较紧密的联接， 包括一些维管束组织，皮层，无表皮组织等，因而不易分离。
植物组织培养 组培苗生产技术外植体的选择处理与接种护理课件
ห้องสมุดไป่ตู้湿度
保持培养环境湿度适宜， 以防止培养基干燥和外植 体失水。
培养过程中的观察与记录
定期观察外植体的生长状 况，包括颜色、质地、生 长速度等，并记录观察结 果。
观察外植体是否有异常表 现，如病变、死亡或生长 异常等，及时采取相应措 施。
记录外植体的生长曲线， 以便了解其生长动态和规 律。
培养过程中的问题处理
污染问题
如发现外植体受到微生物污染， 应及时采取措施，如更换培养基、
增加消毒频率等。
褐化问题
外植体褐化是常见的现象，可以通 过添加抗氧化剂、调整培养基成分 等方法减轻褐化程度。
玻璃化现象
玻璃化是指培养中的植物组织出现 半透明状的现象，可以通过降低激 素浓度、增加培养基湿度等方法进 行改善。
外植体的繁殖与移栽
生根过程
无根苗在生根培养基上生长，经过细胞分裂和分 化形成根原基，进而发育成完整的根系。
移栽前的准备
在生根培养过程中，需要对外植体进行适当的炼 苗处理，以适应外界环境，提高移栽成活率。
移栽与驯化
移栽是将培养好的组培苗从培养 容器中取出，移植到自然环境中 的过程。
移栽后的管理：保持适宜的光照、 温度、湿度和水分条件，及时除 草、防治病虫害，促进组培苗健 康生长。
外植体的接种
无菌操作技 术
操作前准备
在操作前，需要对外植体进行彻底清洗，去除表面的污垢 和微生物。同时，操作人员需要对手部进行消毒，确保无 菌操作。
灭菌处理 外植体需要进行严格的灭菌处理，以消除附着在表面上的 微生物。常用的灭菌方法包括使用酒精、次氯酸钠或氯化 汞等消毒剂。
接种环境
接种环境需要保持无菌状态，通常在超净工作台或无菌室 内进行。同时，接种工具也需要进行消毒处理，避免交叉 污染。
第三章_外植体的选择和灭菌
要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进 行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。
精品课件
2 污染的防治措施
2.1 防止材料带菌的措施 2.2 外植体的灭菌 2.3 玻璃器皿的灭菌 2.4 金属器械的灭菌 2.5 布质制品的灭菌 2.6 无菌操作室的灭菌 2.7 操作
小结
第一节 外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适 的时期、适宜的大小。
第二节 外植体的灭菌方法：常用灭菌药剂的使用及其 效果 、外植体的灭菌方法。
第三节 污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预
防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属
器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、
操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进
第一节 外植体的选择 第二节 外植体的灭菌方法 第三节 污染原因和预防措施
精品课件Βιβλιοθήκη 1 外植体的灭菌方法➢预处理：先对植物组织修整，去掉不需要的部分，流水 中冲洗干净。 ➢预处理的植物材料的灭菌： ➢ 原则： 充分灭菌，但不伤外植体 不同的外植体，灭菌的要求也不一样
精品课件
2 常用灭菌药剂的使用和效果
精品课件
2.4 金属器械的灭菌
火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一下， 然后放在火焰上燃烧灭菌。 这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。
干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用纸包好， 盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。
精品课件
2.5 布质制品的灭菌
湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布 质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的 的布质品，放入高压锅中，用1.1公斤/ 厘米2 （即15磅/英寸2），121 ℃的温 度，灭菌20 min～30min。
外植体的选择与培养
(2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒 精火焰上方转动，灼烧数秒钟；
(3)用灼烧过的镊子夹取外植体送入试管内，轻轻插入 或放在培养基表面；
(4)接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟；
(5)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、 走动和咳嗽等；
(6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染；
21
b
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第四节、试管苗驯化与移栽
草莓
试管苗
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第四节、试管苗驯化与移栽
一、试管苗的特点
1、试管苗的生态环境： 高温且恒温、 高湿、 弱光、 无菌
百合试管苗
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第四节、试管苗驯化与移栽
2、特点：(与常规苗相比）
(1)生长细弱； (2)光合作用差 (3)叶片气孔数目少，活性差 (4)根的吸收功能弱 (5)对逆境的适应和抵抗能力差
(3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖 鞋等；
(4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手。然后70%酒精喷 雾降尘，并擦拭工作台面；
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95% 酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。
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第三节 外植体的选择与培养
接种时的无菌操作技术：
(1)对接种材料进行消毒；
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第三节 外植体的选择与培养
（二）、外植体的褐变
1、定义：
是指外植体在培养中体内的多酚氧 化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化 成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养 基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响 材料的培养。
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第三节 外植体的选择与培养
2、褐变的主要原因
(2021年整理)植物组织培养试题及答案总结
(完整版)植物组织培养试题及答案总结编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整版)植物组织培养试题及答案总结）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
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本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请下载收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步,以下为 <（完整版）植物组织培养试题及答案总结〉这篇文档的全部内容.《绪论》复习题及参考答案一、填空:★1、根据培养的材料，植物组织培养分：愈伤组织培养、器官培养、细胞培养、原生质体培养、悬浮培养等类型.2、植物组织培养的发展分为三个阶段:萌芽阶段、奠基阶段和快速发展和应用阶段。
3、1902年, Haberlandt提出了植物细胞“全能性”学说，1934年，White出版了《植物组织培养手册》从而使植物组织培养为一门新兴学科。
二、名词解释：★1、植物组织培养(plant tissue culture）：是指通过无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术.由于培养材料已脱离了母体，又称为植物离体培养（ Plant culture in vitro）。
第三章 离体培养的操作方法
8
• 按状态分
固体培养基
培养材料与培养基接触不充分 有毒物质容易积累 污染局部 通气好
液体培养基
培养材料与培养基接触充分 有毒物质不容易积累 污染全部 通气不好
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2、培养基的成分 、
无机盐 激素 有机物质 琼脂 碳源 大量元素 微量元素
10
2-1、大量元素 、
N、P、S、K、Ca、Mg 、 、 、 、 、
5
选择合适的大小
根据不同植物而异。太大容易污染，太小， 根据不同植物而异。太大容易污染，太小，多形 成愈伤组织，甚至难于成活。一般在0.5 1.0cm。 0.5成愈伤组织，甚至难于成活。一般在0.5-1.0cm。 如果是胚胎培养或脱毒的外植体，则更小。 如果是胚胎培养或脱毒的外植体，则更小。
选择外植体的时期
24
培养基配制过程
• 自制录相
25
三、无菌技术
培养基灭菌 器皿试材和接种工具的灭菌 培养室和接种室的灭菌
26
污染的情况
真菌污染长孢子 细菌污染长菌落
真菌污染长孢子
27
一、无菌室
培养室和接种室
室内灭菌可用 2%新洁尔敏擦洗 2%新洁尔敏擦洗 75%乙醇喷雾 75%乙醇喷雾 UV照射20分钟 UV照射20分钟 照射20
When stationery supports are needed gelling agent can be used. But please bvear in mind that gelling agent is not the only measure that works for stationery purpose. Others are filter paper, cotton, cheesecloth, vermiculite 16 and special membrane rafts within a liquid medium
植物组织培养 第3章 植物组织培养技术——灭菌方法无菌操作技术ppt(共35张PPT)
4.过滤灭菌（不耐热的物质 ）
对象：不耐热又不能用高压灭菌处理的
第二节 外植体的接种和培养
制剂。如：一些生长调节剂，如赤霉素、 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。
选取性状优良的种质或特殊的基因型
玉米素、脱落酸和某些维生素等。 ☆升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗6～10次。
(1)紫外线灭菌
紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最 强，要求距照射物以不超过为宜。
(2)熏蒸灭菌
使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物 体表面的微生物。方法简便，空间关闭紧密即可。
常用熏蒸剂：高锰酸钾、甲醛。 常用方法：房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将甲醛置 于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可 预先喷湿以加强效果。
外植体 部位
每个外植体形成不定芽分生组织的数目
由培养基上增 殖苗中的叶片
由温室生长2年的完 整植株上的叶片
叶柄
6.7
6.7
叶片
8.0
50.3
总数
养基中，实验用外植体数为70
二、灭菌与消毒
（一）有菌和无菌的范畴 有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，
它的表面都是有菌的。
本节教学重点、难点：
重点：无菌操作技术；组培苗的培养 难点：无菌操作技术
第一节 外植体的选择和消毒
一、外植体的选择
选取性状优良的种质或特殊的基因型
1.选择健壮的植株 ： 健壮、无病虫 、发育正常
代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功
2.选择最适的时期 ：旺盛生长期
注意植物的生长季节和生长发育阶段：茎尖、花蕾、嫩叶
任务三：外植体的选择和处理
（3)不定芽的发育 在培养中由外植体产生不定芽，通常首 先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细 胞。然后，经再分化 。 （4)体细胞胚状体的发生与发育 体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不 同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子 叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗 。
园艺植物快繁与脱毒技术
任务三、外植体的选择和处理
学习目标：学习外植体的取材方法及外 植体褐变和玻璃化的处理方法 任务要求: 能够对外植体进行选择及处理 ，能够对掌握试管苗的驯化基本步骤， 能够对外植体的褐变及玻璃化采取相应 的处理方案。
学习内容：
(1)外植体的取材方法； (2)掌握外植体的消毒及处理 (3)无菌接种的步骤 (4)外植体的培养方法和步骤； (5)试管苗驯化的基本程序； (6)外植体褐变和玻璃化的处理；
二、常用的消毒方法： 1、茎切段和叶片的消毒 2、果实和种子的消毒 3、根及地下贮藏器官的消毒 4、花药的消毒
一、外植体的接种
子情境二、外植体的接种与培 养
1、接种室的消毒 接种前应进行地面的 清洁工作，可用甲醛或高锰酸钾熏蒸。 2、外植体的分离、接种和培养 外植体 材料的分离通常在无菌滤纸上进行。较大 的材料肉眼观察即可分离，较小的则需在 解剖镜下放大操作；
酒精擦拭手
外植体消毒
浸泡5min
器械消毒
酒精擦拭
酒精擦拭培养皿
酒精灯灼烧
旋转灼烧
取外植体
修剪外植体
接种
盖好瓶塞
2、培养步骤 (1)初代培养 初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系 。 （2）顶芽和腋芽的发育 采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或 没有腋芽的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ眠侧芽启动生长，从而形成 一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构 。
园林植物快速繁衍技术知识要点
园艺植物离体培育学的大体含义1.植物离体培育指通过无菌操作，使植物体的各类结构材料（外植体）接种于人工配制的培育基上，在人工操纵的环境条件下，进行离体培育的一套技术与方式，通常称之为植物组织培育式植物的细胞与组织培育。
2.离体培育技术体系胚胎培育及以胚胎为基础的培育技术器官及器官原基培育组织培育细胞培育原生质培育及以原生质体为基础的培育技术3.离体培育的应用多种的繁育与脱毒种质资源的贮存细胞次生代谢物质的生产细胞工程和基因工程的生物技术育种遗传学和生物学基础的研究园艺植物离体培育学的形成与进展（一）、植物离体培育的渊源及其初期的实践1902年、haber landt提出了细胞全能性的观点，并第一次进行植物细胞培育实验。
（二）、植物离体培育大体技术体系的形成1934年white第一次成立了番茄的无性繁衍系1937年white发觉b族微生物素和吲保乙酸对离体培育的作用1934—1939年white等人初步成立起植物离体培育的大体方式1943年white发表了第一部植物离体培育专著《植物组织培育手册》又从头提出了细胞全能性。
1957年skaog成立了器官分化的激素配比模式。
1953年muir报导了细胞悬浮培育法。
（三）园林植物离体培育学科的成立一、完善离体培育技术、探讨理论基础1964—1966年诱杀未成熟花粉形成单位体植株。
1960年分离番茄动根原生质体取得成功，1978年第一取得了体细胞杂种——“potamato”.植物细胞全能性为基因转化提供方便。
二、开拓应用研究生产上应用最普遍，最成功的领域是离体快速繁衍。
植物离体培育学与园艺科学的关系（一）、离体培育与园艺植物良种繁育学（二）、离体培育与园艺植物育种学（三）、离体培育与园艺植物基础学科第一章离体培育的大体操作方式通过学习，明白得和把握离体培育的大体操作方式包括：一样的材料选取、无菌技术、培育基配置和环境条件调控为园林植物快繁技术打下基础。
外植体的选择与处置外植体植物离体培育中的各类接种材料，包括植物体各个器官、组织、细胞和原生质体等。
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第一节 外植体的选择 第二节 外植体的灭菌方法 第三节 污染原因和预防措施
第一节 外植体的选择
1 外植体部位
2 取材季节
3 器官的生理状态和发育年龄 4 选取适宜的大小
1 外植体部位
植物体的各个部位，如茎尖、茎段、皮层及维管组织、 髓细胞、表皮、块茎的贮藏薄壁细胞、花瓣、根、叶、 子叶、鳞茎、胚珠和花药等。 不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反 应不一致的。 大多数植物来说，茎尖是较好的部位，其形态已基本建 成，生长速度快，遗传性稳定，是获得无病毒苗的重要 途径。
材料太大易污染；材料太小，难于成活。 0.5cm--1.0cm。 如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小
第三章 外植体的选择和灭菌
第一节 外植体的选择 第二节 外植体的灭菌方法
第三节 污染原因和预防措施
1 外植体的灭菌方法
预处理：先对植物组织修整，去掉不需要的部分，流水 中冲洗干净。 预处理的植物材料的灭菌： 原则： 充分灭菌，但不伤外植体 不同的外植体，灭菌的要求也不一样
为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注
意防止污染的发生。
污染后的措施
发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环
境污染。
对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更严格
的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。 要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进 行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。
外植体选择的原则
培养材料的来源是否保证是否会引起不良变异。 叶片的来源最有保证，许多植物的组织培养以叶 片为外植体。 对一些培养较困难的植物，可以通过子叶或下胚 轴来建立其组织培养再生体系。
2 取材季节
在生长开始的季节取材，若在生长末期或已进 入休眠时取样，则外植体可能对诱导反应迟钝 或无反应。
1.2 细菌污染的特点：
菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～2天即可发现。
原因：材料带菌 培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%酒精擦净，镊子和 接种针在使用前必须在火焰上烧红。
1.3 真菌污染的特点：
污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3～10天才能 发现。 原因：周围环境不清洁 超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大等
然后放在火焰上燃烧灭菌。
这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。
干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，
盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。
2.5 布质制品的灭菌
湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布 质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的 的布质品，放入高压锅中，用1.1公斤/厘 米2 （即15磅/英寸2），121 ℃的温度，灭 菌20 min～30min。
？
？各其的
特点如何？
组培中污染的原因是什么？如何预防？
湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后臵入蒸汽 灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长 达25min—30min。
干热灭菌法——即将玻璃器皿臵入电热烘箱中 进行灭菌。 煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行 灭菌。
2.4 金属器械的灭菌
火焰灭菌法：即把金属器械放在 95% 的酒精中浸一下，
3 器官的生理状态和发育年龄
植物上部器官的生长时间虽短，其生理年龄 却较老，更接近发育上的成熟，越容易形成 花器官。而越向基部，则生理年龄越小。 下部组织越易形成营养器官，上部组织易形 成花器官。 通常年幼组织比年老组织有较高的形态发生 能力，容易培养，有较大的再生能力。
4 选取适宜的大小
2 污染的防治措施
2.1 防止材料带菌的措施 2.2 外植体的灭菌 2.3 玻璃器皿的灭菌 2.4 金属器械的灭菌 2.5 布质制品的灭菌
2.6 无菌操作室的灭菌
2.7 操作
2.1 防止材料带菌的措施
（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对 枝条先进行预培养。 枝条插入无糖的营养液或自来水，以新抽嫩枝条作为外 植体； 或暗培养，待 抽出徒长的黄化枝条时采枝接种。
次。
第三章 外植体的选择和灭菌
第一节 外植体的选择 第二节 外植体的灭菌方法
第三节 污染原因和预防措施
第三节
1、污染的原因
污染原因和预防措施
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
污染——是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生
杂菌，导致培养失败的现象。
1.1 污染的原因：
从病源菌方面：主要有细菌及真菌两大类； 从污染的途径： 外植体带菌 培养基 器皿灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程等引起的。
果 、外植体的灭菌方法。
第三节 污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防 措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器 械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、操 作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进
行）。
复习 思 考 题
在组培中如何做好外植体的选择工作 用于外植体灭菌的常用药剂有哪些
易 最易 易 较难 中
0.2—2 5—15 2—10 5—30 30—60
好 好 很好 好 较好
常规的表面灭菌处理方法
①把材料放进70%的酒精中约30s。
②用0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡5-10min。
或用10%的漂白粉上清液中浸10min～ 15min。
③无菌蒸馏水冲洗3～5次。
④灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好
2 常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂
次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 氯化汞
使用浓度（%）
10-30 2 饱和浓度 0.01—1
清除的难易
易 易 易 较难
消毒时间 （min） 5—30 5—30 5—30 2—10
效果
很好 很好 很好 最好
酒 精 过氧化氢 溴 水 硝酸银 抗菌素
70—75 10—12 1—2 1 4—50mg/L
2.6 无菌操作室的灭菌
无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用
2%的新洁尔敏或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯
照射约20min。
使用前用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。 一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。
2.7
操作人员在接种时一定要严格
按照无菌操作的程序进行
防止操作带来的污染 A、整个接种操作应在近火焰处进行，且动 作要迅速
可以收到一定的防污染效果。
2.2 外植体的灭菌
（1）多次灭菌法：如咖啡成熟叶片的灭菌。
除去主脉、叶的顶端、基部和边缘部分，这样可大大减 少污染；
消毒处理 次日再次消毒 对层积过的种子也可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都 要灭菌，
（2）多种药液交替浸泡法 对容易污染而难灭菌的材料：
2.3 玻璃器皿的灭菌
射线处理(紫外线、超声波、微波)
过滤除菌 大量无菌水冲洗
不耐热的物质的过滤灭(除)菌
一些生长调节剂(赤霉素、玉米素)、某些维 生素是不耐热的，常用过滤灭菌-细菌过滤器 方法。 防细菌滤膜网孔的直径为0.22-0.45μm以下， 可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。
小
时期、适宜的大小。
结
第一节 外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适的 第二节 外植体的灭菌方法：常用灭菌药剂的使用及其效
（2）选择合适的时间去田间采取外植体
避免阴雨天去田间采取外植体。 在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比
早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部
分细菌或真菌。
但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌 方法。
在菌类长入组织内部时，不要去年生的鳞片，
甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，
的接触。
⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）
或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。
消毒注意事项
1）表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和 处理时间，以减少组织的死亡。 2）与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为 消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。 3）若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得 到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。 4）HgCl2效果最好，但对实验材料的危害最大，要用水冲洗至少5
正
确
错
误
防止操作带来的污染
B、接种过程中尽可能达到悬空要求
正
确
错
误
防止操作带来的污染
C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口
正
确
错
误
小结：常用的灭菌方法
物理方法
干热灭菌(烘烧和灼烧) 湿热灭菌(常压或高压蒸煮)
化学方法
甲醛(福尔马林) 高锰酸钾 过氧化氢 来苏儿 漂白粉 次氯酸钠 升汞(氯化汞) 酒精