3第三章_外植体的选择和灭菌

3 器官的生理状态和发育年龄
植物上部器官的生长时间虽短，其生理年龄 却较老，更接近发育上的成熟，越容易形成 花器官。而越向基部，则生理年龄越小。 下部组织越易形成营养器官，上部组织易形 成花器官。 通常年幼组织比年老组织有较高的形态发生 能力，容易培养，有较大的再生能力。

4 选取适宜的大小
2 常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂
次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 氯化汞
使用浓度（%）
10-30 2 饱和浓度 0.01—1
清除的难易
易 易 易 较难
消毒时间 （min） 5—30 5—30 5—30 2—10
效果
很好 很好 很好 最好
酒 精 过氧化氢 溴 水 硝酸银 抗菌素
70—75 10—12 1—2 1 4—50mg/L
果 、外植体的灭菌方法。
第三节 污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防 措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器 械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、操 作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进
行）。
复习 思 考 题
在组培中如何做好外植体的选择工作 用于外植体灭菌的常用药剂有哪些
第三章 外植体的选择和灭菌
第一节 外植体的选择 第二节 外植体的灭菌方法 第三节 污染原因和预防措施
第一节 外植体的选择
1 外植体部位
2 取材季节
3 器官的生理状态和发育年龄 4 选取适宜的大小
1 外植体部位



植物体的各个部位，如茎尖、茎段、皮层及维管组织、 髓细胞、表皮、块茎的贮藏薄壁细胞、花瓣、根、叶、 子叶、鳞茎、胚珠和花药等。 不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反 应不一致的。 大多数植物来说，茎尖是较好的部位，其形态已基本建 成，生长速度快，遗传性稳定，是获得无病毒苗的重要 途径。

1.2 细菌污染的特点：
菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～2天即可发现。
原因：材料带菌 培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%酒精擦净，镊子和 接种针在使用前必须在火焰上烧红。
1.3 真菌污染的特点：
污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3～10天才能 发现。 原因：周围环境不清洁 超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大等
的接触。
⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）
或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。
消毒注意事项
1）表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和 处理时间，以减少组织的死亡。 2）与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为 消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。 3）若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得 到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。 4）HgCl2效果最好，但对实验材料的危害最大，要用水冲洗至少5
正
确
错
误
防止操作带来的污染
B、接种过程中尽可能达到悬空要求
正
确
错
误
防止操作带来的污染

C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口
正
确
错
误
小结：常用的灭菌方法
物理方法
干热灭菌(烘烧和灼烧) 湿热灭菌(常压或高压蒸煮)
化学方法
甲醛(福尔马林) 高锰酸钾 过氧化氢 来苏儿 漂白粉 次氯酸钠 升汞(氯化汞) 酒精
射线处理(紫外线、超声波、微波)
过滤除菌 大量无菌水冲洗
不耐热的物质的过滤灭(除)菌
一些生长调节剂(赤霉素、玉米素)、某些维 生素是不耐热的，常用过滤灭菌-细菌过滤器 方法。 防细菌滤膜网孔的直径为0.22-0.45μm以下， 可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。

小
时期、适宜的大小。
结
第一节 外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适的 第二节 外植体的灭菌方法：常用灭菌药剂的使用及其效
然后放在火焰上燃烧灭菌。
这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。
干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，
盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。
2.5 布质制品的灭菌

湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布 质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的 的布质品，放入高压锅中，用1.1公斤/厘 米2 （即15磅/英寸2），121 ℃的温度，灭 菌20 min～30min。
易 最易 易 较难 中
0.2—2 5—15 2—10 5—30 ห้องสมุดไป่ตู้0—60
好 好 很好 好 较好
常规的表面灭菌处理方法
①把材料放进70%的酒精中约30s。
②用0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡5-10min。
或用10%的漂白粉上清液中浸10min～ 15min。
③无菌蒸馏水冲洗3～5次。
④灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好

湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后臵入蒸汽 灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长 达25min—30min。
干热灭菌法——即将玻璃器皿臵入电热烘箱中 进行灭菌。 煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行 灭菌。


2.4 金属器械的灭菌
火焰灭菌法：即把金属器械放在 95% 的酒精中浸一下，
外植体选择的原则
培养材料的来源是否保证是否会引起不良变异。 叶片的来源最有保证，许多植物的组织培养以叶 片为外植体。 对一些培养较困难的植物，可以通过子叶或下胚 轴来建立其组织培养再生体系。

2 取材季节
在生长开始的季节取材，若在生长末期或已进 入休眠时取样，则外植体可能对诱导反应迟钝 或无反应。
材料太大易污染；材料太小，难于成活。 0.5cm--1.0cm。 如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小
第三章 外植体的选择和灭菌
第一节 外植体的选择 第二节 外植体的灭菌方法
第三节 污染原因和预防措施
1 外植体的灭菌方法
预处理：先对植物组织修整，去掉不需要的部分，流水 中冲洗干净。 预处理的植物材料的灭菌： 原则： 充分灭菌，但不伤外植体 不同的外植体，灭菌的要求也不一样
为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注
意防止污染的发生。
污染后的措施

发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环
境污染。

对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更严格
的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。 要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进 行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。
2.6 无菌操作室的灭菌
无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用
2%的新洁尔敏或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯
照射约20min。
使用前用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。 一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。
2.7
操作人员在接种时一定要严格
按照无菌操作的程序进行
防止操作带来的污染 A、整个接种操作应在近火焰处进行，且动 作要迅速
（2）选择合适的时间去田间采取外植体

避免阴雨天去田间采取外植体。 在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比
早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部
分细菌或真菌。

但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌 方法。

在菌类长入组织内部时，不要去年生的鳞片，
甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，
次。
第三章 外植体的选择和灭菌
第一节 外植体的选择 第二节 外植体的灭菌方法
第三节 污染原因和预防措施
第三节
1、污染的原因
污染原因和预防措施
污染——是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生
杂菌，导致培养失败的现象。
1.1 污染的原因：
从病源菌方面：主要有细菌及真菌两大类； 从污染的途径： 外植体带菌 培养基 器皿灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程等引起的。
可以收到一定的防污染效果。
2.2 外植体的灭菌
（1）多次灭菌法：如咖啡成熟叶片的灭菌。
除去主脉、叶的顶端、基部和边缘部分，这样可大大减 少污染；
消毒处理 次日再次消毒 对层积过的种子也可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都 要灭菌，
（2）多种药液交替浸泡法 对容易污染而难灭菌的材料：
2.3 玻璃器皿的灭菌

2 污染的防治措施
2.1 防止材料带菌的措施 2.2 外植体的灭菌 2.3 玻璃器皿的灭菌 2.4 金属器械的灭菌 2.5 布质制品的灭菌
2.6 无菌操作室的灭菌
2.7 操作
2.1 防止材料带菌的措施
（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对 枝条先进行预培养。 枝条插入无糖的营养液或自来水，以新抽嫩枝条作为外 植体； 或暗培养，待 抽出徒长的黄化枝条时采枝接种。
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特点如何？
组培中污染的原因是什么？如何预防？