第三章__质粒载体

.
25
4、影响质粒DNA产量的因素
寄主菌株的遗传背景 质粒的拷贝数及分子大小 寄主菌株的生长条件 培养基的类型等
.
26
1）寄主菌株的遗传背景
使用endA基因发生突变的(endAl)大肠杆菌寄主菌株， 例如DH5,JM109
endA基因突变，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有 功能活性的核酸内切酶I的能力，增进了质粒DNA分子 的稳定性。所以从这类寄主细胞制备的质粒DNA质量 有所改进，产量也得到了提高。
.
19
质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获 得批量的纯化的质粒DNA分子。因而寄主细胞的裂解作 用是分离质粒DNA的关键步骤。
通常的裂解是加入溶菌酶或SDS使大肠杆菌细胞裂解。
理想的状况是，使每个细胞都充分破裂到能使质粒DNA 顺利溢出，而又没有污染过多的染色体DNA。
.
20
1、氯化铯密度梯度离心法
.
23
分离纯化质粒DNA的程序
.
24
3、微量碱变性法提取质粒DNA步骤
离心收集细胞沉淀； 细胞悬浮液重新悬浮细胞； 裂解液使细胞裂解，释放出DNA，同时使DNA变性； 中和液使线性质粒和染色体DAN复性； 离心除去染色体DAN、蛋白质及RNA等复活物； 含有质粒超螺旋DNA的上清液用酚臭提除去蛋 白质； 乙醇沉淀收集质粒DNA。
.
15
.
16
.
17
6、质粒的其他特性
稳定性：维持一定的拷贝数 同源性：不同的质粒有相同的同源区 重组性：质粒间、质粒同染色体间重组 消除和恢复性等特性
.
18
第二节 质粒DNA的分离与纯化
➢ 氯化铯密度梯度离心法 ➢ 碱变性法 ➢ 微量碱变性法 ➢ 影响质粒DNA产量的因素
(1)寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大小
.
11
4、质粒DAN的复制类型
严紧型质粒：每个寄主细胞仅含有1－3份的拷贝，称 “严紧型”复制控制的质粒。
松驰型质粒：每个寄主细胞中可高达10－60份的拷贝， 称“松弛型”复制控制的质粒。
质粒拷贝数：每个细菌染色体平均具有的质粒DNA 分子的数目。 质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对，它不仅受 自身的制约，还受寄主的控制。
.
12
质粒DNA拷贝数的控制
高拷贝质粒DNA复制的启动，是由质粒编码基因合成的 功能蛋白质调节的，与寄主细胞周期开始时合成的不稳 定的复制起始蛋白质无关。
低拷贝质粒的复制是受寄主细胞不稳定的蛋白质控制的， 并与寄主细胞染色体同步进行。
用蛋白质合成抑止剂氯霉素或壮观霉素处理寄主细胞， 使染色体DNA复制受阻的情况下，松弛的质粒仍可继续 扩增。而严紧型质粒则不行。
素抗性基因。 3）Co1质粒 ：产生大肠杆菌素因子。编码有控制大肠
杆菌素合成的基因。
.
4
2、根据质粒的传递性 3、根据质粒的拷贝数 4、根据质粒和细菌的关系 5、质粒分布、大小和数目
.
5
二、质粒的基本特性
➢ 寄生性 ➢ 质粒DNA构型 ➢ 质粒DNA编码的表型 ➢ 质粒DNA的复制类型 ➢ 质粒的不亲和性 ➢ 其他特性
.
21
优点：可获得高纯度、高质量的质粒DNA。 缺点：操作复杂；
价格昂贵（氯化铯）； 设备要求高（超速离心机）； 易造成环境污染和人员伤害（溴化乙锭是一 种极强的诱变剂）
.
22
2、碱裂解法
原理：是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间， 在拓扑学上的差异发展出来的。
加热或PH介于12.0-12.5的范围内，线性DNA会被变性，两条链会完 全分开。而超螺旋DNA由于双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补 的两条链仍会紧密结合在一起，不会被变性。
第三章 质粒载体
第一节 质粒载体概况 第二节 质粒DNA的复制与拷贝数的控制 第三节 质粒载体的构建 第四节 重要的质粒载体 第五节 质粒载体的稳定性问题
.
1
第一节 质粒载体的概况
➢ 质粒的定义、命名、分类、分布 ➢ 质粒的基本生物学特性 ➢ 质粒的分离与纯化
.
2
一、质粒的定义、命名、分类、分布
定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立于染色体外 的自我复制并稳定遗传的环状双链DNA分子。
命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发 明者，后接实验编号，
分类： 分布：
.
3
质粒分类
1、根据质粒的性状特征分为：
1）F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。 2）R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数种抗菌
致冷或恢复中性PH值，变性处理的质粒和染色体DNA混合物便会迅 速复性。共价闭合环状的质粒DAN，由于两条链在形体上仍保持在 一起，复性迅速准确。随机断裂产生的线性的染色体DNA分子，互 补链彼此已分开，复性就不会那么迅速而准确，它们聚集形成网状 结构，通过离心会与变性的蛋白质及RNA沉淀下来。滞留在上清液 中的质粒DAN则可通过乙醇沉淀法收集。
.
6
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
.
7
2、质粒DNA分子的三种构型
SC构型: 是指两条多核苷酸链均保持着完整的环形 结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，即超螺 旋的 SC构型。 OC构型: 两条多核苷酸链中只有一天保持完整的环 形结构，另一条出现一至数个缺口时，称开环DNA
(ocDNA)，即OC构型； L构型: 质粒DNA经酶切，发生双链断裂而形成线 性分子(LDNA)，L构型。（见图）
.
8
环形双链DNA质粒分子的A分子量差异显著，最小的仅能编码2－3 种蛋白质，分子量约为106 ，最大的可达108。
基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括三种共同的 组成部分，即复制基因、选择性记号和克隆位点。
.
10
3、质粒DNA编码的表型
质粒DNA仅占细胞染色体的1－3％，但却编 码着一些重要的非染色体控制的遗传性状， 包括抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方 式的因子及其它方面的特征，其中对抗菌素 的抗性时质粒的最重要的编码特性之一。
.
13
.
14
5、质粒的不亲和性
质粒的不亲和性又称不相容性，是指在没有选择压力 的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同 一寄主细胞系中稳定共存的现象。
质粒彼此之间是互不相容的，这样的质粒属于同一个 不亲和群，如pMB1的派生质粒（或ColE1派生质粒）。 彼此能够共存的亲和的质粒则是属于不同的不亲和群。 属于同一不亲和群的质粒的亲缘关系上比较接近。