细胞组分的分离与鉴定
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实验六 细胞组分的分离与鉴定
一、实验目的
了解用细胞匀浆和差速离心的方法分级分离 细胞组分的原理及过程。 细胞组分的原理及过程。 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。
二、实验内容
㈠实验原理 细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在 细胞内各种结构的比重和大小都不相同， 同一离心场内的沉降速度也不相同， 同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原 理，常用不同介质和不同转速的离心法，将细胞 常用不同介质和不同转速的离心法， 内各种组分分级分离出来。 内各种组分分级分离出来。 此法是通过组织细胞匀浆、分级分离（ 此法是通过组织细胞匀浆、分级分离（密度 梯度离心或差速离心）和分析三个步骤完成的。 梯度离心或差速离心）和分析三个步骤完成的。
3.差速离心法分离细胞器 3.差速离心法分离细胞器 低速离心分离细胞核 每组取10ml滤液，3000r/min离心10min， 每组取10ml滤液，3000r/min离心10min，制备 10ml滤液 离心10min 一张上清液涂片，做好标记，自然干燥。 一张上清液涂片，做好标记，自然干燥。 吸去上清， 吸去上清，用10ml 0.25 mol/L 蔗糖液悬浮沉 淀物，用吸管混匀，配平后以3000r/min离心10 3000r/min离心 淀物，用吸管混匀，配平后以3000r/min离心10 min。吸去上清液，加入0.5ml蔗糖溶液， 0.5ml蔗糖溶液 min。吸去上清液，加入0.5ml蔗糖溶液，用吸管吹 打成悬液，制备一张涂片，做好标记，自然干燥。 打成悬液，制备一张涂片，做好标记，自然干燥。 高速离心分离线粒体
速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 速度逐渐提高，
2.密度梯度离心 2.密度梯度离心(density gradient centrifugation) 密度梯度离心 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的 密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部， 密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部， 通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。常 通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。 用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。
4. 分析 将干燥后的三张涂片浸入95%乙醇5 min， 将干燥后的三张涂片浸入95%乙醇5 min，晾 95%乙醇 干。在涂膜部分滴加数滴甲基绿-派洛宁染液染色 在涂膜部分滴加数滴甲基绿 甲基绿20 min，再以纯丙酮分化20s，蒸馏水漂洗，直立 min，再以纯丙酮分化20s，蒸馏水漂洗， 纯丙酮分化20s 于吸水纸上吸干水分。 于吸水纸上吸干水分。 在高倍显微镜下比较观察三张涂片。细胞核 在高倍显微镜下比较观察三张涂片。 被染成蓝绿色，核仁和细胞碎片染成淡红色。 被染成蓝绿色，核仁和细胞碎片染成淡红色。
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㈡实验方法 1. 处死家兔：耳缘静脉空气栓塞法 处死家兔： 2. 制备肝细胞匀浆: 制备肝细胞匀浆: 家兔处死后，立即剖腹取肝， 家兔处死后，立即剖腹取肝，迅速浸入预 冷的 生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。 生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。 按每克肝重加9ml冷的 按每克肝重加9ml冷的0.25mol/L蔗糖溶液 冷的0.25mol/L蔗糖溶液 匀浆 。（20g×9ml/g=180ml） 化。（20g×9ml/g=180ml） 用八层纱布（先用少量蔗糖液湿润）， ），过 用八层纱布（先用少量蔗糖液湿润），过 滤匀 浆液于烧杯中。制备一张滤液涂片，做好 浆液于烧杯中。制备一张滤液涂片， 标
1.差速离心（ 1.差速离心（differential centrifugation） 差速离心 ） 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心， 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心， 用于分离不同大小的细胞和细胞器。 用于分离不同大小的细胞和细胞器。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为： 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、 线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、 线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基 最后为核蛋白体。 体、最后为核蛋白体。
一、实验目的
了解用细胞匀浆和差速离心的方法分级分离 细胞组分的原理及过程。 细胞组分的原理及过程。 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。
二、实验内容
㈠实验原理 细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在 细胞内各种结构的比重和大小都不相同， 同一离心场内的沉降速度也不相同， 同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原 理，常用不同介质和不同转速的离心法，将细胞 常用不同介质和不同转速的离心法， 内各种组分分级分离出来。 内各种组分分级分离出来。 此法是通过组织细胞匀浆、分级分离（ 此法是通过组织细胞匀浆、分级分离（密度 梯度离心或差速离心）和分析三个步骤完成的。 梯度离心或差速离心）和分析三个步骤完成的。
3.差速离心法分离细胞器 3.差速离心法分离细胞器 低速离心分离细胞核 每组取10ml滤液，3000r/min离心10min， 每组取10ml滤液，3000r/min离心10min，制备 10ml滤液 离心10min 一张上清液涂片，做好标记，自然干燥。 一张上清液涂片，做好标记，自然干燥。 吸去上清， 吸去上清，用10ml 0.25 mol/L 蔗糖液悬浮沉 淀物，用吸管混匀，配平后以3000r/min离心10 3000r/min离心 淀物，用吸管混匀，配平后以3000r/min离心10 min。吸去上清液，加入0.5ml蔗糖溶液， 0.5ml蔗糖溶液 min。吸去上清液，加入0.5ml蔗糖溶液，用吸管吹 打成悬液，制备一张涂片，做好标记，自然干燥。 打成悬液，制备一张涂片，做好标记，自然干燥。 高速离心分离线粒体
速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 速度逐渐提高，
2.密度梯度离心 2.密度梯度离心(density gradient centrifugation) 密度梯度离心 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的 密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部， 密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部， 通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。常 通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。 用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。
4. 分析 将干燥后的三张涂片浸入95%乙醇5 min， 将干燥后的三张涂片浸入95%乙醇5 min，晾 95%乙醇 干。在涂膜部分滴加数滴甲基绿-派洛宁染液染色 在涂膜部分滴加数滴甲基绿 甲基绿20 min，再以纯丙酮分化20s，蒸馏水漂洗，直立 min，再以纯丙酮分化20s，蒸馏水漂洗， 纯丙酮分化20s 于吸水纸上吸干水分。 于吸水纸上吸干水分。 在高倍显微镜下比较观察三张涂片。细胞核 在高倍显微镜下比较观察三张涂片。 被染成蓝绿色，核仁和细胞碎片染成淡红色。 被染成蓝绿色，核仁和细胞碎片染成淡红色。
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㈡实验方法 1. 处死家兔：耳缘静脉空气栓塞法 处死家兔： 2. 制备肝细胞匀浆: 制备肝细胞匀浆: 家兔处死后，立即剖腹取肝， 家兔处死后，立即剖腹取肝，迅速浸入预 冷的 生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。 生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。 按每克肝重加9ml冷的 按每克肝重加9ml冷的0.25mol/L蔗糖溶液 冷的0.25mol/L蔗糖溶液 匀浆 。（20g×9ml/g=180ml） 化。（20g×9ml/g=180ml） 用八层纱布（先用少量蔗糖液湿润）， ），过 用八层纱布（先用少量蔗糖液湿润），过 滤匀 浆液于烧杯中。制备一张滤液涂片，做好 浆液于烧杯中。制备一张滤液涂片， 标
1.差速离心（ 1.差速离心（differential centrifugation） 差速离心 ） 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心， 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心， 用于分离不同大小的细胞和细胞器。 用于分离不同大小的细胞和细胞器。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为： 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、 线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、 线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基 最后为核蛋白体。 体、最后为核蛋白体。