流式细胞术的样品制备(1)
流式细胞仪的样本制备与数据分析指南
引言：
流式细胞仪（flow cytometer）是一种广泛应用于生物学、医学研究领域的仪器，能够对单个细胞进行快速、准确的分析和排序。为了获得可靠的实验结果，正确的样本制备和数据分析至关重要。本文将为您介绍流式细胞仪的样本制备和数据分析的基本指南。
一、样本制备
1.细胞准备
3.细胞染色
细胞染色是为了标记细胞内特定的分子或结构，以便在流式细胞仪中进行检测和分析。常见的细胞染色方法包括荧光染色、酶标记等。在选择染色方法时，需要考虑染色效果、染色稳定性以及对细胞活力的影响。
4.样本预处理
在进行流式细胞仪分析之前，有时需要对样本进行预处理，以消除背景噪音、增强信号等。常见的样本预处理方法包括细胞排序、细胞分选、细胞富集等。
结语：
流式细胞仪的样本制备和数据分析是流式细胞仪实验中至关重要的环节。正确的样本制备和数据分析方法能够提高实验结果的可靠性和准确性，为后续的研究工作提供有力支持。希望本文所提供的指南能够对您的流式细胞仪实验有所帮助。
二、数据分析
ห้องสมุดไป่ตู้1.数据获取
在流式细胞仪实验完成后，需要将得到的原始数据导出到计算机进行后续的数据分析。通常，流式细胞仪会输出FCS（Flow Cytometry Standard）格式的数据文件，其中包含了细胞的荧光强度、散射信号等信息。
2.数据清洗
在进行数据分析之前，需要对原始数据进行清洗，去除噪音、异常数据等。常见的数据清洗方法包括设置门控条件、排除双重tsne等。
3.数据解读
数据解读是流式细胞仪数据分析的核心环节。通过对数据的统计学分析、聚类分析、细胞子群分析等，可以获得关于细胞表型、细胞数量、细胞状态等信息。在数据解读过程中，需要结合实验设计和研究目的，从中提取有意义的结果。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞术样品制备技术(完整)
流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。
因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。
在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。
它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。
流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。
第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。
尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。
在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。
所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。
目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。
酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。
常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。
流式细胞术工作原理
流式细胞术工作原理流式细胞术又称为流式细胞分析（FACS），是一种用于快速测定和分析细胞及其组分的工具和技术。
它通过对单个细胞的多重参数进行单细胞测量和分析，可对不同种类和状态的细胞进行区分和识别，从而为细胞学、免疫学、实验室诊断和药物研发等领域提供了重要的实验手段和数据支持。
流式细胞术工作原理基于一定的光学原理和电子信号转换技术，其主要步骤包括样本准备、流式细胞仪检测和数据分析等三个部分。
下面将详细介绍各个部分的工作原理：1. 样本准备样本准备是流式细胞术的第一步，它主要是为了将待测细胞或细胞组分转化成能够被流式细胞仪检测和分析的样品，其中包括以下几个步骤：（1）细胞收集：这是流式细胞术的前提条件，它要求待测细胞必须单个存在，不能形成团块或粘连。
通常采用利用酶或化学试剂将细胞从组织、器官、培养基或体液中分离出来进行收集。
其中细胞来源各不相同，可以是血液、骨髓、组织癌变、分离免疫细胞等等。
细胞处理在流式细胞学中是个棘手的问题。
该过程既需要最大程度地维持细胞的原始形态和性质，又不影响流式细胞仪对细胞的检测和分析。
样本处理的方式包括细胞染色、标记、吸释样本预处理等方法，处理条件严格，样品要求高纯度，无污染。
细胞染色是为了能够让细胞在仪器中产生不同的光谱信号。
染色剂的种类有非常多，它们包括活细胞染色剂、细胞膜染色剂、DNA染色剂、标记抗体等。
一般情况下，染色前细胞都要进行适当的处理，如调节pH值、添加细胞破解液等，扩大染色剂与待测细胞的作用。
2. 流式细胞仪检测流式细胞仪是用于测量和分析单个细胞的主要工具和设备，它是由激光器、光学器件、检测单元和计算机组成的。
在具体工作中，样品通过采用压力推动等技术被强制通过一个光学器件中的微细通道，流式细胞仪则通过这个微细通道对其进行检测和分析。
具体步骤如下：（1）激光器发出激光：激光是流式细胞仪最核心的光源，它可以发射可见光、激光、紫外线等光谱范围内的单色光束。
光线经过反射器作用，形成光束。
流式细胞术样品制备技术(完整)
流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的剖析检测一定鉴于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。
所以就一定把实体组织制备成单细胞悬液。
在应用FCM 技术中，制备出合格的单分别细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。
它要求这类分别细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特征。
流式细胞术样品制备大概可分为下边五个步骤：①取材：取手术或活检组织一定拥有代表性，如取手术肿瘤组织，一定取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本一定在取材后保持样本的新鲜；一般在室温 1 个小时以内办理好样本或实时用固定剂或低温对组织进行保留；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③依照厂家供给的软件程序对样本进行获取、检测和储存；④ 再依照软件供给的程序对检测结果进行定量剖析；⑤ 检测剖析结果在生物、医学上的意义进行剖析和评论。
第 1 节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM 对单细胞快速进行各样参数剖析一定鉴于单细胞基础上，依据各样组织成分的特点，可选择不一样的分别细胞方法，以期达到单细胞产额高、损害少的目的。
只管标本制备已形成了标准化的程序，但实质操作中总会出现这样或那样的问题。
在实体组织分别为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬时地或长久地影响细胞的性质、形态、构造、功能等。
所以，在对各样不一样组织进行分别选择方法时，应尽量减少对细胞的这类影响。
当前常用的分别组织细胞的方法有以下 3 种。
（一）酶消化法1作用原理：对实体组织分别的作用原理主要有3 方面：① 能够损坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；② 能够水解组织间的粘多糖等物质；③能够水解组织细胞间的密切联络装置的蛋白质物质。
酶消化法是实体瘤、培育细胞分别为单细胞的主要方法之一。
常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子种类的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连结组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。
流式细胞术样本制备.
样本制备实例:细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining原理:对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。
直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。
荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。
但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。
还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。
现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。
材料:∙被检测细胞∙FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用∙相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC步骤:1. 在 100 µL外周血加入抗体:a. 同型对照:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLb. 单阳管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLc. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+ Isotope APC 5 µLd. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+ Isotope PE 20 µL+CD3 APC 5 µLe. 样品管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+CD3 APC 5 µL2. 避光 15min3. 在每管中加入 2mL 裂解液,室温下避光孵育 10min4. 将裂解好的外周血离心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 2mL 鞘液,混匀6. 离心 1200rpm , 5min ,去上清液7. 加入 500 µL鞘液,混匀8. 3小时内上机(如果不能立刻上机, 2⁰ C -8⁰ C 避光保存样本对照:a. 同型对照(和使用的抗体同源、同亚型、同荧光标记:Isotope*3b. 单阳 CD4 加 Isotope PE & APCc. 单阳 CD8加 Isotope FITC & APCd. 单阳 CD3 加 Isotope FITC & PE细胞周期 (Cell Cycle原理:细胞在有丝分裂的过程中,核内的 DNA 会进行复制,造成 DNA 含量的波动。
流式细胞术样品制备(完整)
一、单层培养细胞分散为单个细胞
㈠贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤： 1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。
2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观
察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有10%胎 牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液
洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液， 用振荡器使细胞分散。
实验证实，用化学试剂处理组织导致细胞 成活率降低，细胞产额较低，细胞碎片和细胞 丛结的量不稳定，因此，化学试剂处理方法不 单独使用，可与其他方法联合使用。 机械法常常造成严重的细胞损伤，较低的 细胞产量，为使细胞碎片不影响FCM检测结果， 需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片。 酶学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的， 但是会对所测化学成分造成不良影响，所以根 据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法， 才能获得理想的样品和更好的FCM结果。
3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤：
1、离心去除旧培养液，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉 上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。
2、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
注意事项： 一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡 脱净的方法是，弃去二甲苯，加入100%乙醇， 如无絮状物浮起，即视为石蜡已脱净，反之则 没有脱净。 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞 核被消化掉。 切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响 流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间 过长，一般以40-50μm为宜。
流式样本制备
流式样本制备
流式样本制备是一种通过流式细胞仪或流式细胞分选仪对细胞或颗粒物进行快速精确的分离和分类的技术。
它可以对样本中的细胞进行筛选、鉴定和排序，并根据细胞的特定性质进行直接分离和收集。
流式样本制备的步骤通常包括样本准备、样本染色、细胞排序和收集等过程。
下面是一个基本的流程：
1. 样本准备：首先需要将待分析的样本制备成单细胞悬浮液。
对于组织样本，可以通过机械或酶解法将组织细胞分离并制备成单细胞悬浮液。
对于细胞悬浮液，需要将其进行稀释，使得细胞以单个细胞的形式存在于悬浮液中。
2. 样本染色：将样本中的细胞或颗粒物经过染色，以便于流式细胞仪对其进行鉴定和分类。
常用的染色方法包括标记细胞表面标志物的流式抗体染色和使用细胞荧光探针的染色等。
3. 细胞排序：将染色后的样本通过流式细胞仪进行分析和鉴定。
流式细胞仪通过检测细胞的大小、形状、荧光染色强度等特性对细胞进行分类和区分。
4. 细胞收集：根据需要，流式细胞分选仪可根据细胞的特定性质（如荧光染色强度）对细胞进行分离和收集。
分选后的细胞可以进一步用于后续实验，如基因分析、细胞培养等。
注意事项：
- 在进行流式样本制备时，需要注意使用无菌的操作条件以避免细胞的污染。
- 样本准备和染色的步骤需要根据具体实验目的和方法进行优化和调整。
- 对于染色步骤，需要选择适当的流式抗体或荧光探针，并根据实验要求对样本进行处理和处理时间的控制。
流式细胞术的样品制备
流式细胞术的样品制备节概述待测标本的制备是流式细胞术分析的关键，本节分别直接免疫荧光标记、间接免疫荧光标记、微量全血法免疫荧光标记、双标记、培养细胞DNA荧光标记与细胞凋亡检测样品的制备。
知识点导航1.直接免疫荧光标记的样品制备用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色，然后用流式细胞仪检测，阳性者即表示有相应抗原存在。
实验步骤如下：(1)每份取100 μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。
(2)一份加入相应量的异硫氰酸荧光素或者藻红蛋白标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗，作为阴性参照样品。
(3)室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行)，通常在室温下反应15～30min 即可。
(4)加入500 μl磷酸缓冲液重悬成单细胞悬液即可上机检测。
2.间接免疫荧光标记的样品制备(1)取1×106个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30 min。
(2)用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液(离心转数通常为800～1000 r/min，5 min)。
(3)用100 μl PBS重悬细胞，再加入FITC或者PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀，室温下反应30 min。
(4)用PBS再洗涤细胞2次，加入500 μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。
注意：以上两种染色方法的抗体加入量与反应时间，没有非常具体的规定，通常应根据试剂使用说明书的要求进行。
若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。
制备好的样品，若不能及时上机检测，用1％～4％的多聚甲醛固定，4℃下可储存5d。
3.微量全血法免疫荧光标记的样品制备目前制备全血细胞样品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，然后进行特异性荧光染色，其染色方法与前面介绍的方法相同。
下面要紧介绍与流式细胞仪配套的Q PREP(免疫学样品处理器)进行快速制备微量全血样品的方法：(1)微量全血直接荧光染色法：具体方法为①取肝素或者EDTA抗凝全血100 μl置12 mm×75 mm 专用塑料试管中；②每份加入20 μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作阴性参照，室温下避光染色15 min；③置 Q PREP 仪上溶解红细胞、稳固与固定白细胞，静置5 min；④上流式细胞仪检测。
流式细胞术实验步骤
流式细胞术实验步骤流式细胞术（flow cytometry）是一项非常常用的细胞生物学研究技术，在许多领域都有着广泛的应用。
本文将为您介绍流式细胞术实验步骤，帮助您更好地掌握这一技术。
1. 细胞样品制备首先需要一个合适的细胞样品进行实验。
样品的选取要考虑细胞类型、细胞密度、细胞状态等因素，以保证实验结果的准确性和可靠性。
对于非粘附生长的细胞，先用PBS洗涤一次，离心沉淀，将上清液倒掉，然后用PBS冲洗沉淀细胞一次，离心沉淀，去掉上清液，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的PBS中消化脱落细胞。
之后用PBS洗涤脱落细胞，离心沉淀，去掉上清液，最后加入凝胶化培养基冻存备用。
2. 细胞计数在流式细胞术中，细胞计数非常重要。
可以使用hemocytometer或自动计数器进行计数。
计数完毕后，将细胞密度调整到准确的浓度，以免在后续实验中出现杂质和误差。
3. 细胞标记细胞标记可使用fluorescently-labeled antibodies或其他的探针，标记细胞表面分子或胞内分子。
标记的目的是识别和区分样品中的不同细胞类别。
处理方法：向细胞样品中加入适量标记抗体或荧光素等探针，使其与样品中的目标分子发生特异性结合。
4. 细胞过筛将经过标记的样品通过过滤网口，筛去大于0.22um的细胞碎片等杂质，以获得单个细胞进行后续实验。
5. 流式细胞术分析使用流式细胞仪进行分析，将样品喷入细胞术的流管中，在激光束之下，测量样品中标记细胞的荧光强度、散射度等参数。
通过比较样品与对照组，分析细胞类型、浓度和状态，建立起荧光相关表达式，以判定目标细胞类别。
6. 数据解析在流式细胞术分析的过程中采集了大量的数据，需要使用专业的软件进行数据解析、图形和表格生成。
数据解析的准确性和可靠性，对于实验结果和结论的推导有着至关重要的作用。
流式细胞术是一项详细的实验过程，需要严格遵守操作规范，才能获取可重复的实验结果。
本文简单介绍了流式细胞术实验步骤，希望能够提供实验操作指导，为广大科研工作者开展实验研究提供一定的帮助。
流式细胞术的样本制备方法
流式细胞术的样本制备方法流式细胞术的样本制备和染色方法是进行流式分析的基础，虽然是基础，但是样本制备可并没有那么容易，比如细胞数目的掌握很难，过于稀释浓度不够，过于稠又会在通过细胞仪时影响分析，做不出结果，这是我们做流式的一大通病，特别是从组织中分离样本时，这样的问题常常遇到。
今天，我们就看看如何从不同组织中分离出优质样本。
与贴壁或者悬浮细胞相比，组织样本的单细胞制备相对有一定的难度和复杂性，也是同学们最容易出现问题的地方，如细胞数量太少，细胞活性不好，细胞碎片太多等。
下面就具体看看组织中的细胞如何制备。
目前，最常用两种方法是物理法和酶解消化法。
一、物理方法：原理：是指利用物理方法(机械法)分散组织，经过滤网过滤获得单细胞悬液。
应用：常用于处理部分软组织例如骨髓、胸腺、脾脏、淋巴结等，或富含细胞的肿瘤组织----淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及一些软组织肉瘤等，用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞。
优势：操作方便，耗时短，且能获得大量的细胞。
缺点：易造成组织细胞机械损伤，如细胞碎片和细胞团块，所以常与其他方法配合使用;对硬组织或纤维组织效果不好。
操作步骤：1. 吹打：用移液枪或注射器反复吹打组织以获得单个细胞的方法。
应用于：骨髓、腹腔、肺等组织中相对比较游离的细胞(骨髓、巨噬细胞等)。
2. 剪碎研磨法：用锋利的剪刀将组织剪碎后，并研磨以获得单个细胞的方法。
应用于：脾脏、淋巴结、胰腺等新鲜组织。
3. 网搓法：用100-300目的尼龙滤网固定于烧杯口，组织在网上轻搓，可用此法获得单个细胞的方法。
常应用于：正常的组织、瘤组织、淋巴结等标本。
二、酶解消化法：原理：利用酶(主要是胶原酶和蛋白酶)破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等、水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质和粘多糖物质以将实体组织分散为单个细胞的方法。
应用：既可用于普通单层的传代细胞也适合致密的组织样本，如上皮、肝、肾等或含有大量结缔组织的肿瘤----食管癌、乳腺癌、皮肤癌等。
流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项
流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项(一)原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
(二)操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三)试剂和器材1.各种特异性单克隆抗体。
2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3.10％FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(四)注意事项1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaNO３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
附:1. DPBS (×10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNa２HPO４11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5％)4％NaNO３终浓度0.2％)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2％)甲醛10mlNaNO３0.2g (终浓度0.02％)流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
流式细胞仪标本的制备
流式细胞仪标本的制备流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
(一) 原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
(二) 操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min加适量固定液(如为FCM 制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)FCM 检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三) 试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
流式制样
流式细胞术检测细胞样品
一、培养细胞
二、经0.25%胰酶消化后，PBS缓冲液洗涤，制成细胞悬液，70%乙醇固定。
（1.自己做的时候，细胞多也可以先离心，去掉乙醇。
2.收获细胞时，自己先用计数板数一下细胞，以上样的时候可以根据细胞多少增加或减少上样量）
三、室温下，经PBS（1~2ml）缓冲液洗涤1~2次（加入PBS后注意混匀），用PBS配平（天平）1500r/min，离心5min，去上清夜，留100μl沉淀。
0.2% Triton X-100 100μl处理细胞10min，PBS缓冲液洗涤及离心同上，去上清液，留100μl沉淀。
RNA酶水解5~10min，加5mg/L PI染色剂100μl染色标记细胞内的DNA，20min后，PBS洗涤离心去上清夜同上，留100μl沉淀。
用PBS缓冲液制成1*106的细胞悬液（用100μl沉淀+400μl PBS），待用。
流式细胞术的样品制备
6.将细胞涂片,以丫啶橙染色,置荧光显微镜下观察 形态和纯度。
7.将细胞以70%乙醇固定,置0-4℃冰箱保存备检。
三、脱落细胞单细胞悬液的制备
在临床实际工作中，可收集到大量自然脱落 的细胞，这些细胞标本经过简单的处理，就可 得到较好的单分散细胞悬液，所以是流式细胞 术检测的天然样品，下面介绍几种常见的脱落 细胞样品制备方法。
一、单层培养细胞分散为单个细胞
㈠贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤： 1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。 2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观
察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有10%胎 牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液 洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液， 用振荡器使细胞分散。 3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
注意事项：
Ⅰ新鲜组织标本应及时进行保存，以免组织在室温下放 置时间过长，造成细胞自溶导致DNA降解，影响FCM 测定结果。
Ⅱ根据实验目的选用最佳的细胞固定方法，以免由于固 定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳定。
Ⅲ酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶 剂，消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。
㈠ 淋巴细胞的制备
⒈取肝素抗凝血2.0ml，用生理盐水2ml将全血稀释至4ml。
⒉先将3ml人淋巴细胞分离液放入另一个离心管，然后将 稀释后的血沿试管内壁缓缓加入到分离液面之上，勿 用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的 分层状态。
流式细胞仪标本的制备
流式细胞仪标本的制备(一)原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
(二)操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三)试剂和器材1.各种特异性单克隆抗体。
2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3.10％FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(四)注意事项1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
附:1. DPBS (×10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNa２HPO４11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5％)4％NaN３50ml (终浓度0.2％)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2％)甲醛10mlNaN３0.2g (终浓度0.02％)间接抗体的对照问题：间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106 细胞／ml )，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原-抗体-抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
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第二节流式细胞术的样品制备
节概述
待测标本的制备是流式细胞术分析的关键，本节分别直接免疫荧光标记、间接免疫荧光标记、微量全血法免疫荧光标记、双标记、培养细胞DNA荧光标记以及细胞凋亡检测样品的制备。
知识点导航
1.直接免疫荧光标记的样品制备
用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色，然后用流式细胞仪检测，阳性者即表示有相应抗原存在。
实验步骤如下：
(1)每份取100 μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。
(2)一份加入相应量的异硫氰酸荧光素或藻红蛋白标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗，作为阴性对照样品。
(3)室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行)，一般在室温下反应15～30min 即可。
(4)加入500 μl磷酸缓冲液重悬成单细胞悬液即可上机检测。
2.间接免疫荧光标记的样品制备
(1)取1×106个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30 min。
(2)用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液(离心转数一般为800～1000 r/min，5 min)。
(3)用100 μl PBS重悬细胞，再加入FITC或PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀，室温下反应30 min。
(4)用PBS再洗涤细胞2次，加入500 μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。
注意：以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间，没有非常具体的规定，一般应根据试剂使用说明书的要求进行。
若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。
制备好的样品，若不能及时上机检测，用1％～4％的多聚甲醛固定，4℃下可保存
5d。
3.微量全血法免疫荧光标记的样品制备
目前制备全血细胞样品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，然后进行特异性荧光染色，其染色方法与前面介绍的方法相同。
下面主要介绍与流式细胞仪配套的Q PREP(免疫学样品处理器)进行快速制备微量全血样品的方法：
(1)微量全血直接荧光染色法：具体方法为①取肝素或EDTA抗凝全血100 μl置12 mm×75 mm专用塑料试管中；②每份加入20 μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作阴性对照，室温下避光染色15 min；③置Q PREP 仪上溶解红细胞、稳定和固定白细胞，静置5 min；
④上流式细胞仪检测。
(2)微量全血间接荧光染色法：具体方法为①取肝素或EDTA抗凝全血100 μl置12×75 mm专
用塑料试管中；②加入50 μl特异的第一单克隆抗体，室温下孵育30 min；③置Q PREP仪上溶解红细胞，稳定和固定白细胞；④离心(800～1000 rpm，5 min)弃上清液，用PBS洗涤细胞2次；⑤加入50 μl荧光(FITC或PE)标记的第二抗体，室温下避光染色30 min；⑥上流式细胞仪检测。
(3)注意事项：①新鲜全血保存时间：一般室温下放置8 h以内可以使用，时间过长会使活性降低，影响测定结果；②抗凝血应保证无血块凝集；③全血加入试管中时，应尽量避免加到试管壁上，如沾到了管壁上必须用棉签擦干净，否则会影响细胞二维点图的细胞群的分离效果。
4.双标记(双染色)直接免疫荧光的样品制备
在流式细胞术分析中，由于双参数分析的光谱重叠现象和干扰因素相对增多，一般不采用间接荧光法制备细胞样品而是用直接法进行双标记染色。
目前双标记的荧光探针较多，但一般采用FITC与PE标记的单抗组合，在进行双标记荧光染色的样品制备中，由于前面已述及到荧光补偿等问题，因此，不仅要制备阴性对照样品，而且必须制备阳性对照样品，以此先调整好流式细胞仪的工作参数，使测量得到的数据准确可靠。
全血的样品制备实验步骤如下：
(1)取肝素或EDTA抗凝人外周血样品100 μl(2份)。
(2)1份加入CD4FITC/CD8PE的双标荧光抗体；另一份加入MsIgG1FITC/MsIgG1
PE鼠抗人无关单抗(作阴性对照)混匀。
在室温下避光染色15 min。
(3)置Q PREP样品制备仪上，快速自动溶解红细胞，稳定和固定白细胞。
(4)阳性对照样品的制备，取100 μl肝素抗凝正常人全血，加入CD4FITC/CD8PE双标荧光单抗，染色法与2、3步骤相同。
(5)将制备好的样品上流式细胞仪检测。
5.培养细胞DNA荧光染色的样品制备
(1)培养细胞用0.25％的胰酶消化。
(2)PBS或生理盐水洗涤细胞2次，再用PBS或生理盐水悬浮细胞，加入预冷的无水乙醇，终浓度为(60％～70％)，快速混匀，并用封口膜封口，置4℃下可保存15 d左右。
(3)将固定过的细胞离心(800～1000 r，5 min)弃上清液，再用PBS洗涤2次。
(4)用PBS调整细胞浓度，每份为1×106个细胞/100 μl。
(5)加入500 μl DNA 荧光染料(通常用Coulter公司提供的DNA染色试剂盒)室温下避光染色15
min。
(6)上流式细胞仪检测。
以上样品的制备可分析细胞周期各时相的百分比，同时可粗略观察有无细胞凋亡现象，如果用对照液(鸡红细胞)作参照标准，可进行细胞DNA倍体分析。
染色后的细胞在4℃可保存2 d，荧光强度保持不变。
6.细胞凋亡检测样品的制备
(1)悬浮细胞凋亡样品的制备：使用ANNEXIN V FITC 细胞凋亡检测试剂盒，根据Annexin V与磷脂酰丝氨酸(含有碘化丙啶)的结合特性来检测细胞凋亡发生的情况。
具体方法为：①将10×的结合缓冲液用蒸馏水稀释成为1倍稀释，冰育；②悬浮细胞在低温环境中，用PBS洗涤细胞2次(800～1000 r离心，5 min)；③弃上清，加入预冷的结合缓冲液重悬细胞(细胞浓度为105～106／ml)；④加入5 μl Annexin V FITC和5 μl PI(碘化丙啶)于细胞悬浮液中，轻轻混匀；⑤将试管置于冰上，避光孵育10 min；⑥上FCM检测。
(2)贴壁细胞凋亡样品的制备如下：①24孔板每孔500 μl培养液培养细胞。
根据实验方案诱导细胞凋亡。
②加入5 μl Annexin V FITC于含1.5 mmol/L CaCl2的细胞培养液中，0℃～37℃孵育10 min。
③收集细胞前用含1.5 mmol/L CaCl2的培养液洗涤2次。
④用Rubber policeman 收集细胞。
⑤用含1.5 mmol/L CaCl2培养液或1倍稀释的结合缓冲液重悬细胞。
⑥加入终浓度为2.5 μg／ml的PI(碘化丙啶)，轻轻混匀，置冰上孵育15 min。
⑦上流式细胞仪检测。
7.样品制备应注意的问题和影响因素
(1)样品制备应注意的问题:①单细胞悬液的制备是流式细胞术分析的关键，一般每份样品要求的细胞数为5×105～1×106。
如遇有细胞团块应先用300～500目的细胞筛网过滤后，再上机检测。
②用消化酶液消化细胞应注意掌握酶的适当浓度、温度及pH值。
③免疫荧光标本应注意死细胞和碎片的去除，尤其是稀少细胞或细胞亚群的测定时，否则这些细胞的非特异性荧光增加，会干扰免疫荧光测定。
④对脱落细胞制备单细胞悬液，要慎重分析和解释结果的生物学意义，因为这些结果常出现阴性或假阳性结果，这是由于其中的白细胞常有变性。
因此，要求每份样品中杂质、碎片、团块重叠细胞应在20％以下，对肿瘤细胞DNA异倍体的样品分析，至少应有20％的肿瘤细胞存在(占主峰1/5
以上的异倍体才可确认为异倍体峰)。
(2)影响样品制备的因素:①温度对荧光强度的影响：一般认为，温度升高时荧光减弱，所以在荧光测量时要保持染色后的样品在适当低温环境下进行，并尽可能减少样品的光照射时间。
有条件时，应使样品观察室达到恒温，使温度对荧光染色的影响减少到最小，会得到更好的荧光定量测定的结果。
②pH值对荧光强度的影响：每一种荧光染料分子发光的最高量子产额，都有自己最适合的pH值，以保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡，如果pH值发生改变，可能造成荧光光谱的改变，如FITC 在酸性溶剂中呈蓝色荧光，为阳离子发光，而在碱性溶剂中呈黄绿色荧光，为阴离子发光。