阵列比较基因组杂交技术

肾透明细胞癌遗传聚类的阵列比较基因组杂交技术：DNA甲基化与肾癌患者预后之间的关系（Genetic Clustering of Clear Cell Renal Cell Carcinoma Based on Array-Comparative Genomic Hybridization: Its Association with DNA Methylation Alteration and Patient Outcome）

Abstract

Purpose:The aim of this study was to clarify genetic and epigenetic alterations occurring during renal carcinogenesis.

Experimental Design: Copy number alterations were examined by array-based comparative genomic hybridization analysis using an array harboring 4,361bacterial artificial chromosome clones, and DNA methylation alterations on CpG islands of the p16, human MutL homologue 1,von Hippel-Lindau,and thrombospondin 1 genes and the methylated in tumor (MINT-1, MINT-2, MINT-12, MINT-25, and MINT-31) clones were examined in 51clear cell renal cell carcinomas(RCC).

Results: By unsupervised hierarchical clustering analysis based on copy number alterations,clear cell RCCs were clustered into the two subclasses, clusters A (n =34)andB(n =17).Copy number alterations were accumulated in cluster B. Loss of chromosome 3p and gain of 5q and 7 were frequent in both clusters A and B, whereas loss of1p, 4, 9,13q, and14q was frequent only in cluster B. The average number of methylated CpGislands in cluster B was significantly higher than those in clusterA. Clear cell RCCs showing higher histologic grades, vascular involvement, renal vein tumor thrombi, and higher pathologic stages were accumulated in cluster B.The recur-rence-free and overall survival rates of patients in cluster B were significantly lower than those of patients in cluster A. Multivariate analysis revealed that genetic clustering was a predictor of recurrence-free survival and was independent of histologic grade and pathologic stage.

Conclusions: This genetic clustering of clear cell RCC is significantly associated with regional DNA hypermethylation and may become a prognostic indicator for patients with RCC.

Key words:RCC Genetic Clustering Array-Comparative Genomic Hybridization DNA Methylation Alteration Patient Outcome

摘要

肾细胞癌（RCC）是最常见的恶性成人肾脏肿瘤，经常影响工作年龄成人的生活。在一般情况下，肾细胞癌在早期阶段由肾切除可以治愈的。然而，一些肾细胞癌的即使已完全切

除仍易复发和转移至远处器官。转移肾细胞癌抵抗传统的化疗和放疗和有一个很差的预后，最近，治疗肾癌已成立了免疫疗法和已开发了新型靶向制剂。然而，除非密切随访早期诊断的复发或转移肿瘤，任何有效性治疗是非常严格的限制。因此，协助密切跟进肾切除和仍处于复发和转移风险的患者，预后指标应建立在了解肾癌发生的分子机制基础上。

虽然肾细胞癌分类主要是根据组织学的分类，WHO分类已推出标志的遗传改变作为相应的肾细胞癌的组织学亚型。例如，透明细胞癌，最常见的的病理亚型，其遗传特点是染色体3p的损失和位于3p25的von Hippel-Lindau (VHL)基因失活。只有60％至70％偶发的肾透明细胞癌发生VHL基因失活，单独的VHL基因改变并不能全部解释神透明细胞癌的的发展。然而，最近只有少数基于阵列的技术和展示套数在透明细胞癌的临床组织样本的改动的研究被报道。如以前的基于阵列的分析，使用阵列的克隆技术得并检查明确肾透明细胞癌的数量很少，透明细胞癌显著预后因素基于阵列的比较基因组杂交（CGH）型材从未被建议。

曾有报道，DNA 甲基化是肾透明细胞癌的另一个重要的改变，非年龄相关的肾透明细胞癌的特定癌的DNA甲基化累积在C-type CpG 和肿瘤的恶性程度和患者预后有显著的关系，在肾透明细胞癌的癌旁检查到DNA甲基化改变正常肾组织内，被认为是癌前病变阶段。在非癌的肾组织学的C-type CpG上DNA甲基化累积的数量与相对应的透明细胞癌患者的进展等级显著相关，提示癌前阶段的局域性的超DNA甲基化更易发展为恶性的透明细胞癌。因此，目前所了解的遗传和表观遗传的改变发生在肾致癌作用还远未完成。

这项研究中，我们使用微阵列CGH分析了4361个人工染色体（BAC）克隆细菌的数组拷贝数改变，使高分辨率的全基因组的分析，在9 CpG岛的DNA甲基化改变被亚硫酸氢钠修饰在51个肾透明癌细胞中，拷贝数的改变和DNA的变化甲基化以及拷贝数的改变和临床意义与预后的影响之间的相关性进行了研究。

材料与方法

患者和组织样本。肿瘤组织取自手术切除材料51例（RCC01 RCC51）原发性透明细胞癌。这些患者来自1999年和2006年之间日本东京国立癌症中心的医院，未接受术前治疗和接受肾切除术。有34男子和17名妇女平均年龄59岁，主要集中在其上下10岁左右（即范围31-81岁之间）。病理诊断是根据与世界卫生组织

分类（1）。所有肿瘤在以前的基础上进行分级标准描述，并严格的根据肿瘤的病理分类淋巴结转移（TNM）分类。血管受累存在与否是通过观察镜下玻片H＆E和elastica van Gieson 染色是否褪色。肿瘤的存在与否通过肾静脉主干血栓的宏观研究。这项研究是由伦理委员会批准，日本东京国立癌症中心。

透明细胞癌通常是封闭的，由纤维包膜并界限清楚，几乎从未含纤维间质之间的癌症细胞。因此，我们能够获得高纯度的癌细胞手术标本，避免污染与两个非癌上皮细胞和基质细胞。高分子量DNA新鲜冷冻的肿瘤样本提取用酚- 氯仿，其次透析。

阵列CGH分析。拷贝数变化由阵列CGHusing分析----一个特制的阵列（MCG的全基因组阵列4500），整个染色体1至22X和Y包括4361的BAC克隆，提供f0.7 MB分辨率。简单地说，性别匹配的人类基因组DNA（Promega公司）被用来作为参考。DpnII限制测试和参考由Cy3和Cy5标记dCTP（GE Healthcare公司）DNA随机物基因组，分别使用一个BioPrime阵列CGH基因组标签制度（Invitrogen公司）和沉淀连接在前端带有乙醇的Cot-I DNA之上。混合物被加到阵列玻片上和在43jC孵育72小时后用GenePix个人4100A（Axon 仪器）扫描阵列和使用GenePix Pro的5.0成像软件（Axon仪器）和Acue2软件分析（三井知识产业）。