实验方案细胞表型检测

细胞表型检测

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试品

名称：人胎盘间充质干细胞、猴胎盘间充质干细胞的P4、P6、P8细胞1.1.2 主要试剂

B液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司

D液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司

血清新西兰胎牛血清(特级) 上海依科赛生物制品有限公司 IgG-FITC BD公司货号：555748

CD19-FITC BD公司货号：555412

CD34-FITC BD公司货号：555821

CD44- FITC BD公司货号：

CD31- FITC BD公司货号：

IgG-PE BD公司货号：555749

CD11b-PE BD公司货号：555483

CD45-PE BD公司货号：555388

CD73-PE BD公司货号：550257

CD90-PE BD公司货号：555596

CD105-PE Serotec公司货号：MCA1557PE

HLA-DR-PE BD公司货号：555812

CD29-PE BD公司货号：

1.1.3 主要仪器

CO2培养箱

离心机

超净工作台

显微镜

1.1.4 主要耗材

50ml离心管、5ml/10ml移液管、1.5ml EP管。

1.1.5 实验设计依据

通过传代培养，我们可以得到相对纯的间充质干细胞，参考国际细胞治疗协会提出的间充质干细胞表型方面的标准，CD73、CD90和CD105阳性率不低于95％；CD45、CD34、CD11b、CD19 和HLA-DR阳性率不高于2％[1]。检测在传代过程中的细胞的表型是否会发生变化。我们设计检测P4代、P6和P8代细胞表型。1.2 实验方法

1.2.1细胞消化

1、将原培养液倒净,用移液管取D液10ml冲洗细胞，倒净,此操作重复洗2 次；

2、用移液管吸取加入B液2ml,盖上培养瓶盖子,摇晃使B液均匀覆盖瓶底,待细胞从培养壁脱落下来；

3、用移液管吸取加入C液0.5ml, 终止消化，再加D液10ml，吹打细胞制成细胞悬液，将细胞悬液收集至离心管中；

1.2.2 流式检测方法

1、收集细胞，1000rpm离心5min，用D液洗一次，过滤；

2、用适量D液将细胞重悬，100μl每管分装到1.5mlEP管中，每管细胞不少于用1×105，在每管中加入4μl要检测表型的抗体,室温避光放置30min；加入1mlD液混匀，离心弃上清，再用1mlD液混匀，离心弃上清，每管加入

350-500μl D液重悬，移入流式管待测即可；

3、用流式细胞仪检测荧光值,每管计数3000-10000个细胞；

4、分析数据。

1.3 C6操作步骤

（一）开机

1、启动控制计算机，进入软件，此时信号灯为红灯，显示还没有与C6连接。

2、检查四个液体容器，如有需要，则先充满液体或清空废液。

3、启动C6前方的电源按钮，此时信号灯变为黄色，显示C6正在启动，等待3分钟左右直至信号灯变绿，显示C6已经连接并就绪。

4、在载物台上放置一个空管，点击控制Backflush按钮，可以看到少许液体流出来。

5、在96孔样品格中任选一孔，载物台换上去离子水，选择高速，10分钟，点击RUN。（激光器预热）

6、该孔因为收集了数据变成蓝色，点击Delete Sample Data删除。至此启动步骤已完成，可以开始检测样品。

（二）检测样品

1、将样品依次置于载物台上。

2、在96孔样品格中选择不同的位置，依次命名。

3、设定检测停止的条件：

（1）无限制，手动点击停止；（2）收集了多少个点停止；（3）收集了多少时间停止；（4）收集了多少体积液体停止。（2—4可复选，达到任一设定指标就会停止）。

4、设定进样速度：慢速，中速，快速或者自己设定。

5、设定阈值（一般不变，FCS-H>80000）。

6、点击RUN。

注意事项：1、样品之间无需用去离子水冲洗，但是当你完成所有样品检测后，

必须运行清洗程序（Instrument菜单下cleaning fluid cycle）。

2、若发生堵塞（观察每秒钟细胞数），则运行Backflush，再用去

离子水冲洗2min。

3、切记每测完一个样品必须保存（在开始检测时会提示你保存）。

（三）检测结果分析

（四）关机

1、在任意一个打开的文件下，在96孔样品格中任选一孔，载物台上放置洗液（0.1%次氯酸钠），选择高速，运行2分钟。

2、在96孔样品格中任选一孔，载物台换上去离子水，选择高速，运行2分钟。

3、将去离子水的检测管一直留在载物台上。

4、按一下C6前方的电源按钮关闭C6，此时信号灯为黄灯，显示C6正在关闭，关闭的过程大约需要10分钟左右。

5、退出控制软件，不用保存之前清洗步骤所收集的数据。关闭电脑。

注意：与BD FACSAria不同，C6的关机程序所作的一系列相关步骤都是自动的，不需要与控制计算机相连接操作，C6与电脑控制软件相对独立，所以后面两个步骤（关闭C6和退出控制软件）无关先后。

细胞因子检测

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试品

名称：人胎盘间充质干细胞、猴胎盘间充质干细胞的P4、P6、P8细胞培养上清

1.1.2 主要试剂

B液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司

D液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司

血清新西兰胎牛血清(特级) 上海依科赛生物制品有限公司

无血清培养基 Loza

人白细胞介素2酶联免疫分析上海泛柯

人白细胞介素6酶联免疫分析上海泛柯

人血小板生成素酶联免疫分析上海泛柯

人α干扰素酶联免疫分析上海泛柯

人肿瘤坏死因子α酶联免疫分析上海泛柯

人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子酶联免疫分析上海泛柯

人粒细胞集落刺激因子酶联免疫分析上海泛柯

1.1.3 主要仪器

CO2培养箱

离心机

超净工作台

显微镜

酶标仪

洗板机

1.1.4 主要耗材

50ml离心管、5ml/10ml移液管、1.5ml EP管、移液枪。

1.1.5 实验设计