实验方案细胞表型检测

细胞表型检测1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 供试品名称：人胎盘间充质干细胞、猴胎盘间充质干细胞的P4、P6、P8细胞1.1.2 主要试剂B液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司D液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司血清新西兰胎牛血清(特级) 上海依科赛生物制品有限公司 IgG-FITC BD公司货号：555748CD19-FITC BD公司货号：555412CD34-FITC BD公司货号：555821CD44- FITC BD公司货号：CD31- FITC BD公司货号：IgG-PE BD公司货号：555749CD11b-PE BD公司货号：555483CD45-PE BD公司货号：555388CD73-PE BD公司货号：550257CD90-PE BD公司货号：555596CD105-PE Serotec公司货号：MCA1557PEHLA-DR-PE BD公司货号：555812CD29-PE BD公司货号：1.1.3 主要仪器CO2培养箱离心机超净工作台显微镜1.1.4 主要耗材50ml离心管、5ml/10ml移液管、1.5ml EP管。

1.1.5 实验设计依据通过传代培养，我们可以得到相对纯的间充质干细胞，参考国际细胞治疗协会提出的间充质干细胞表型方面的标准，CD73、CD90和CD105阳性率不低于95％；CD45、CD34、CD11b、CD19 和HLA-DR阳性率不高于2％[1]。

检测在传代过程中的细胞的表型是否会发生变化。

我们设计检测P4代、P6和P8代细胞表型。

1.2 实验方法1.2.1细胞消化1、将原培养液倒净,用移液管取D液10ml冲洗细胞，倒净,此操作重复洗2 次；2、用移液管吸取加入B液2ml,盖上培养瓶盖子,摇晃使B液均匀覆盖瓶底,待细胞从培养壁脱落下来；3、用移液管吸取加入C液0.5ml, 终止消化，再加D液10ml，吹打细胞制成细胞悬液，将细胞悬液收集至离心管中；1.2.2 流式检测方法1、收集细胞，1000rpm离心5min，用D液洗一次，过滤；2、用适量D液将细胞重悬，100μl每管分装到1.5mlEP管中，每管细胞不少于用1×105，在每管中加入4μl要检测表型的抗体,室温避光放置30min；加入1mlD液混匀，离心弃上清，再用1mlD液混匀，离心弃上清，每管加入350-500μl D液重悬，移入流式管待测即可；3、用流式细胞仪检测荧光值,每管计数3000-10000个细胞；4、分析数据。

1.3 C6操作步骤（一）开机1、启动控制计算机，进入软件，此时信号灯为红灯，显示还没有与C6连接。

2、检查四个液体容器，如有需要，则先充满液体或清空废液。

3、启动C6前方的电源按钮，此时信号灯变为黄色，显示C6正在启动，等待3分钟左右直至信号灯变绿，显示C6已经连接并就绪。

4、在载物台上放置一个空管，点击控制Backflush按钮，可以看到少许液体流出来。

5、在96孔样品格中任选一孔，载物台换上去离子水，选择高速，10分钟，点击RUN。

（激光器预热）6、该孔因为收集了数据变成蓝色，点击Delete Sample Data删除。

至此启动步骤已完成，可以开始检测样品。

（二）检测样品1、将样品依次置于载物台上。

2、在96孔样品格中选择不同的位置，依次命名。

3、设定检测停止的条件：（1）无限制，手动点击停止；（2）收集了多少个点停止；（3）收集了多少时间停止；（4）收集了多少体积液体停止。

（2—4可复选，达到任一设定指标就会停止）。

4、设定进样速度：慢速，中速，快速或者自己设定。

5、设定阈值（一般不变，FCS-H>80000）。

6、点击RUN。

注意事项：1、样品之间无需用去离子水冲洗，但是当你完成所有样品检测后，必须运行清洗程序（Instrument菜单下cleaning fluid cycle）。

2、若发生堵塞（观察每秒钟细胞数），则运行Backflush，再用去离子水冲洗2min。

3、切记每测完一个样品必须保存（在开始检测时会提示你保存）。

（三）检测结果分析（四）关机1、在任意一个打开的文件下，在96孔样品格中任选一孔，载物台上放置洗液（0.1%次氯酸钠），选择高速，运行2分钟。

2、在96孔样品格中任选一孔，载物台换上去离子水，选择高速，运行2分钟。

3、将去离子水的检测管一直留在载物台上。

4、按一下C6前方的电源按钮关闭C6，此时信号灯为黄灯，显示C6正在关闭，关闭的过程大约需要10分钟左右。

5、退出控制软件，不用保存之前清洗步骤所收集的数据。

关闭电脑。

注意：与BD FACSAria不同，C6的关机程序所作的一系列相关步骤都是自动的，不需要与控制计算机相连接操作，C6与电脑控制软件相对独立，所以后面两个步骤（关闭C6和退出控制软件）无关先后。

细胞因子检测1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 供试品名称：人胎盘间充质干细胞、猴胎盘间充质干细胞的P4、P6、P8细胞培养上清1.1.2 主要试剂B液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司D液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司血清新西兰胎牛血清(特级) 上海依科赛生物制品有限公司无血清培养基 Loza人白细胞介素2酶联免疫分析上海泛柯人白细胞介素6酶联免疫分析上海泛柯人血小板生成素酶联免疫分析上海泛柯人α干扰素酶联免疫分析上海泛柯人肿瘤坏死因子α酶联免疫分析上海泛柯人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子酶联免疫分析上海泛柯人粒细胞集落刺激因子酶联免疫分析上海泛柯1.1.3 主要仪器CO2培养箱离心机超净工作台显微镜酶标仪洗板机1.1.4 主要耗材50ml离心管、5ml/10ml移液管、1.5ml EP管、移液枪。

1.1.5 实验设计空白孔1个，标准空2个，待测空3个。

1.2 实验方法1.2.1样品收集细胞融合达80%-90%时进行计数定量培养，细胞融合达70%时，用无血清培养基替换24h后收取细胞上清，-80℃冻存、待测。

操作方法如下：吸弃培养瓶中原有培养基，PBS轻加入培养瓶清洗，弃去洗液，共2次。

加入适量0.25%胰蛋白酶消化，显微镜下观察，细胞开始回缩变圆并漂浮时，立即加入含10%FBS的培养基终止消化，混匀制成细胞悬液。

1000rp离心10min，弃上清。

重悬细胞沉淀，台盼蓝染色计数。

5×104细胞/cm2接种于含有血清培养基1ml 的12孔板中。

37℃、5%CO2培养箱中培养。

每天显微镜观察细胞生长状况，待细胞铺满70%，更换无血清培养基；培养24h后收细胞上清于冻存管中，存放-80℃待测。

重复上述步骤，收取P4、P6、P8细胞上清留作待测样本。

1.2.2 操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

8. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

测定应在加终止液后15分钟以内进行。

操作程序总结：计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。

一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。