微透析_高效液相色谱法测定大鼠脑脊液中4种氨基酸的含量测定

[关键词 ] 高效液相色谱法; 微透析; 脑脊髓液
[ KEY W ORDS] H igh- power liqu id chrom atography; M icrod ia lysis; Cerebrospina l flu id
[ 中图分类号 ] R 363
[文献标识码 ] A
脑脊液中一 些游 离氨 基酸 的含 量测 定对 于某 些疾 病的 诊断和治疗有重要的意义。 近年来, 用高 效液相 色谱 - 荧光 检测法分析脑 组织和 脑脊 液中 的氨基 酸已 有不 少报 道 [ 1, 2] 。 但利用微透析技 术直 接从 动物 脑组 织特 定区 域内 抽取 透析 液, 并用高效液相色谱仪同时测 定其中 4种神 经递质 的氨基 酸: 天冬氨酸 ( Asp)、谷氨酸 ( G lu) 、牛磺酸 ( Tau) 和 C- 氨基 丁酸 ( GABA)的方法报道不多。本实验采 用微透析和 高效液 相相结合对体内氨基 酸的变化进 行测定, 为临 床应用 提供一 种有效的分析方法。
取 5 Lm ol/L氨基酸标准品的 混合溶液, 按标准曲线制备 的方法处理, 每次进样 25 LL, 测定 峰面积, 结果 分别为 Asp: 5 822 497 ? 23 289 ( R SD = 0140 ); G lu: 8 808 545 ? 58 136 ( RSD= 0166) ; Tau: 4 994 518 ? 17 480( R SD= 01 35); GABA: 5 138 501 ? 36 483( R SD = 01 71); n= 5。 4 回收率试验
材料和方法
1 仪器与试剂 岛津 LC- 10ADVP 高效液相色谱仪, RF - 10AXL荧光检
测器, 岛津色谱 工作 站, 分 析柱: BDSC18柱 ( H ype rsi,l 41 6 mm @25010 mm, 5 Lm ); 微透析设备与系 统: Beekeeper啮 齿类动 物容器与旋转接头系统 ( BAS, MD- 1575, USA), 微量注射泵 ( BAS, MD- 0250) , 微透析探针 ( BAS, MD- 2200, 2 mm 膜 ) , 微透析探针套管 ( BAS, MD- 2251), 三维立体定位仪 ( 第二军 医大学, 江湾 Ò型 C) 。邻苯 二甲醛 ( OPA, S igma ), 氨基 酸标 准品 ( 天冬氨酸、谷氨 酸、牛磺 酸、C - 氨 基丁 酸, S igm a), B 巯基乙醇 ( S igm a), 磷酸 二 氢钾 ( F luka), 甲 醇 (一 级色 谱 纯, 天津四友生物 医学技 术有 限公 司 ), 其它 试剂 均为 国产 分析 纯, 10% 的水合氯醛 (由浙 江省 中医 院提供 ), 所有 溶液 均用 超纯水 (M illipore)配制。 2 实验动物
本实验采用微透析技术 将透析 探针埋 入动物 的脑中, 透 析探针可除去分子量大 于 30 000 的 分子 [ 4, 5] , 对周围 组织损 伤 很小, 取 样 量少, 并 且 多位 点 多时 点采 样 进行 动态 监 测。 样品不经预处理, 灌流速度稳定在 31 0 L L /m in可使回收率提 高。
图 2 微透析样品色谱
2 线性范围和相关系数 取不同浓度下的氨基酸 标准溶 液按 6 方法处 理, 立即进
样, 每次进样 25 LL, 室温下检测。其浓度 与峰面积呈 良好线 性关 系, 得 到的 回 归方 程 式: 天 门 冬氨 酸 Y= 1 058 363X + 159 879( r = 019991 ), 谷 氨 酸 Y= 1 694 940X + 256 189( r = 01 9991), 牛磺酸 Y= 1 000 472X + 36 203( r = 019995), C - 氨 基丁酸 Y= 1 051 753X - 159 153( r = 01 9993)。 3 精密度试验
中国病理生理杂志 Chinese Jou rnal of Pa thophysiology 2007, 23( 9): 1871- 1872
# 1871#
[ 文章编号 ] 1000- 4718( 2007) 09- 1871- 02
微透析 - 高效液相色谱法测定大鼠脑脊液 中 4种氨基酸的含量测定
韩 进 1, 万海同 1v , 别晓东 2, 李金辉1, 张宇燕 1
取同 一浓 度的 标准 品溶 液, 每 2 h 进 样 1 次, 测定 峰面 积, 结果 天 门 冬氨 酸 R SD = 11 36% ( n = 6) 、谷 氨 酸 RSD = 01 94% ( n = 6)、牛 磺酸 R SD= 0198% ( n = 6 )、C - 氨 基 丁酸 R SD= 11 06% ( n = 6 ) 。表 明 供 试 品 至 少 在 8h内 测 定 结 果
采用梯度洗脱。 A相甲 醇: 磷 酸二氢钾 缓冲液 ( 011 mol/ L) = 35B65( pH = 616), B 相甲 醇: 磷 酸二 氢钾 缓 冲液 ( 0101 m ol/L) = 90B10, ( pH = 616 )。梯 度 洗 脱 时间 : 0 - 12 m in; B% : 0% - 40% ; 12101 - 20100 m in; B% : 100% - 100% ; 20101- 30 m in; B% 0- 0检测时, 激 发波长 ( Ex) = 357 nm, 发射波长 ( Em ) = 455 nm。
雄性 SD大鼠以水合氯醛 ( 400 m g/kg)腹 腔麻醉, 固定在 立体 定 位 仪 上, 将 透 析 套 管 定 位 于 右 侧 纹 状 体 (前 囟 前 01 2 mm, 旁开 315 mm, 皮层下 512 mm )并 用小螺钉 固定。开 启透析灌流系统, 调节恒 流泵控制液流速 310 LL# m in- 1, 透 析探针与人工脑脊液灌 流系统 直接相 接。灌流平 衡 120 m in 后, 每 15 m in收 集 1管, 每管 30 LL, 共收 集 8管透 析液。收 集的透析液立即放 入 - 20 e 冰箱保存。 6 OPA 柱前衍生
SD大鼠, 体重 300- 350 g, 雌雄不 拘, 购于浙江中 医药大 学动物实验 中心, 中 国 卫生 部认 证, Grade Ò, C ertificate No. 20 010 01 046。 3 人工脑脊液配制 [ 3]
取适量的标准品 配成约 10 Lmol/L的储备液, - 20 e 冰
的含量。结果: 该体系可在 30 m in内对脑脊液 中 4种氨 基酸实现良 好的分离, 4种 氨基酸在 01625- 10 Lmol/L浓
度范围内与色谱峰面积线性关系良好, 保留时间分别是天门冬氨酸 41392 m in、谷氨酸 51592 m in、牛磺酸 131 625 m in、
C - 氨基丁酸 141833 m in。结论: 本方法准确、灵敏、方便、重复性好, 可用于微透析样品中氨基酸的含量测定。
液相分析采 用梯 度洗 脱, 缩短 分析 时间, 改 善峰 形 和提 高样品的检测灵敏 度。选用 KH 2 PO4 缓 冲液 配制流 动相, 其 浓度为 01 1 m ol/L, 如果浓度 过高会 破坏键 合相的 稳定性, 对 色谱柱的损 害较 大。另外, 缓 冲液 一 定要 用低 浓度 的, 临用 前现 配, 并 用 01 22 Lm 滤 膜 过 滤。水 用 超 纯 水 系 统 去 除 杂质。
讨论
F ig 1 Standa rd chrom atogram. 1: A sp; 2: Glu; 3: Tau; 4: GA BA.
图 1 标准品色谱
F ig 2 M icrod ia lys is samp le chrom atogram. 1: Asp; 2: Glu; 3: Tau; 4: GABA.
箱 保 存, 人 工 脑 脊 液 ( mm ol) ( ASCF = NaC l 125, KC l 5, NaH 2 PO4 112, MgSO4 2, N aHCO3 2517, CaC l2 # H 2O 2, glucose 10, pH = 71 4)稀释成 5 Lmol/L的工作液。 4 标准溶液的配制
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在上述色谱 条件 下, 4 种 氨基 酸均 可 获得 很好 分 离 (图 1、2), 保留时间分别为: 天门冬 氨酸 41 392 m in、谷氨 酸 51 592 m in、牛磺酸 131625 m in、C - 氨基丁酸 141833 m in。
稳定。 6 大鼠脑脊液测定
取正常 SD大鼠 按透析 液制 备方 法制 备透 析液, 再 按上 述方法进行测定, 所得结果分 别为 A sp( 01920 ? 01 081) LmoL ( n= 5 ); G lu ( 21 386 ? 01420 ) Lm oL ( n = 5 ); Tau ( 51220 ? 01 685) Lm oL( n = 5); GABA ( 01688 ? 01073) LmoL( n= 5) 。
衍生反应 [ 6]是决 定氨 基酸 重现 性和 检测 效果 的重 要步
骤, 牛磺酸和 C- 氨基丁酸衍生的荧光产物极 其不稳定, 荧光 活性衰减很 快。因此, 从 衍生 剂加 入 的瞬 间开 始计 时, 轻轻 混匀 45 s, 静置 30 s时 进样, 即衍生 时间严 格控制 在 2 m in。 衍生剂的性质不稳 定, 应尽量避光、低 温 ( 0 - 4 e )保 存, 710 d后重新配制。由于 B - 巯基乙 醇容易 发生氧 化反应, 每 日使用前添加 10- 15 LL。
准确提取 20 L L氨基酸 标准溶 液或微 透析样 品液, 再加 入 10 LL 0105 m ol/L 的 碳 酸 钠 缓 冲 液 和 10 LL 衍 生 试 剂 ( 5 LL OPA + 60 L L甲醇 + 90 L L B - 巯 基乙醇 + 11 2 mL四 硼酸钠, 混匀 45 s后静置反应 30 s。 7 色谱条件
( 1浙江中医药大学脑血管病研究所, 浙江 杭州 310053; 2 浙江大 学第二附属医院, 浙江 杭州 310009)
[摘 要 ] 目的: 通过对大鼠脑透析液中氨基酸的含量测定, 为在体 氨基酸分 析建立方法。 方法: 利用微透
析技术抽取麻醉下大鼠 脑脊 液, 运用 OPA 柱前 衍生 法处 理样 品, 再用 高 效液 相二 元 梯度 洗脱 色 谱法, BDSC18柱 ( H ypersi,l 416 mm @2501 0 mm, 5 Lm ), 荧光检测脑脊液中 谷氨酸、天门冬氨酸、C- 氨基丁酸、牛磺酸等 4 种氨基酸
结果
1wk.baidu.com4种氨基酸的分离
[ 收稿日期 ] 2006- 10- 09
[修 回日期 ] 2007- 02- 13
* [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( No. 30371789; No. 30672652); 浙江省自然科学基金资助项目 ( No. Z204424)
v 通讯作者 T e:l 0571- 86613711; E- m a i:l wanhaitong@ zjtcm. net
精密量取已测 得天 门冬 氨酸、谷 氨酸、牛 磺酸、C - 氨基 丁酸含量的脑透 析液 1 mL 置于相 应的 离 心管 中, 精密 量取 15 LL, 分别精 密加 入上 述 4种 标准 品溶液, 按 方法 6处 理。 精密 量 取 25 LL, 注 入 液 相 色 谱 仪, 结 果 Asp 的 回 收 率: 9613% ( R SD = 11 18, n= 5) ; G lu的回收率为 9119% , ( RSD= 11 12, n= 5) ; Tau的 回收 率 为 9117% ( RSD = 1183, n = 5) ; GABA 的回收率为 961 4% ( RSD= 1134, n = 5)。 5 稳定性试验
精密量取天门 冬氨 酸、谷氨 酸、牛磺 酸、C - 氨 基丁 酸标 准品, 配成不 同浓 度的 氨 基酸 标准 品 (各 含 10 Lm ol# L- 1、 5 Lmol# L- 1, 215 Lmol# L- 1, 1125 Lmol# L- 1, 01625 Lmol# L- 1 ) 的混合溶液。 5 透析样品的制备