组织培养技术

组织培养技术

一、组织培养的定义:

组织培养：细胞、组织或器官→离体→合适的培养液、温度、无菌→使之生存和生长

根据培养物的不同，组织培养又可分：细胞培养、组织培养和器官培养。

二、组织培养的应用：

优点：（1）研究对象是活细胞，可长时间动态观察细胞的形态结构和生命活动。

（2）研究对象广泛，包括各种组织细胞。

（3）可研究各种理化因素（温度、药物、毒素等）对细胞代谢、增殖、分化的影响。（4）研究方法多样，如倒置、荧光、电子显微镜、组织化学、同位素标记等，研究结果便于观察记录。

应用：病毒学：细胞培养是分离培养病毒的重要手段，用于病毒感染的诊断，生产病毒苗。

免疫学：杂交瘤-单克隆抗体技术。

遗传学：从子宫取得胎儿细胞做染色体分析，进行遗传学诊断，试管婴儿等。

肿瘤学：抗肿瘤药物筛选。

不足之处：

体外与体内培养条件不完全相同，失去神经内分泌系统的调节作用，培养的细胞存在一定的差异，故对结果的判断应慎重。

培养细胞的特性：

培养细胞的分型（按生长方式分）

（1）贴附型：大部分细胞附着于支持物表面生长，分化不明显，形态单一，常反映其

胚层起源。如上皮细胞型，成纤维细胞型，多形细胞型。

（2）悬浮型：不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，细胞呈圆形，单个或细胞团排

列；见于血、脾、骨髓细胞、部分肿瘤细胞

培养细胞的生长和增殖：

原代培养（Primary Culture）：从体内取出组织开始在体外培养，在其传代之前。

传代培养（Subculture）: 将细胞分离成两部分获更多至新的培养器皿中，并补充更新培养液。

细胞系（Cell line）：原代培养细胞一经传代后便称为细胞系。

细胞系的生长过程：

原代培养期：1-4周，与体内细胞相似，但分裂不旺盛，含细胞类型较多。 传代期：持续时间最长，细胞分裂增殖旺盛，保留原组织细胞的很多特征，一般传代30-50次后，细胞增殖逐渐缓慢。

衰退期：细胞增殖缓慢，并逐渐停止，细胞形态轮廓增强，最后衰退、死亡。 培养细胞的生长条件：

1、营养需要：碳水化合物、氨基酸、维生素、无机离子、促生长因子和激素

2

、生存环境：

1）、温度：35℃-37℃耐低温不耐高温

2)、PH值：7.2-7.4 宁酸勿碱

3)、气相：O2、CO2（5% ）NaHCO3-CO2

4)、渗透压：260-320 mmol/L

3. 无污染及无毒：

防止污染

要注意防止微生物（细菌、病毒、真菌、支原体等）的污染、不同细胞类型的交叉污染。出现以下情况时培养细胞可能有污染：

1) 培养液的酸碱度异常改变，如短期内颜色变黄；

2) 培养液出现混浊；

3) 光镜观察到大量颗粒或菌丝；

4) 细胞生长停止或出现死亡。

组织培养的常用设备

1. 仪器

包括各种无菌操作、消毒灭菌、细胞培养和保存的设备，如无菌室、超净工作台、CO2培养箱、高压蒸汽灭菌器、滤器、水纯化装置、倒置显微镜、离心机、液氮容器等

2. 器皿培养瓶培养皿培养板

3. 试剂

（1）天然培养基：动物血清（如胎牛血清、小牛血清）。

（2）合成培养基：如RPMI1640、DMEM、199等。

多采用合成培养基+天然培养基（5-20%）。

（3）平衡盐溶液：由无机盐和葡萄糖组成，用于洗涤、配

液、维持渗透压，调节PH值等，如PBS、Hank’s等。

（4）消化液：用于消化解离组织块，使贴壁细胞从附着物

脱离。如胰酶、EDTA、胶原酶等。

基本培养技术

1.）无菌操作

2. ）取材

3. ）组织分离

4.）原代培养

5. ）传代培养

6. ）细胞冻存与复苏

1. 无菌操作：

防止污染是决定组织培养成败的关键，必须无菌操作！

（1）培养前的消毒灭菌

待用物品：洗涤、消毒灭菌。

无菌室：紫外线照射30-50min，新洁尔灭拖地。

超净台：75%酒精擦洗，紫外线灭菌等照射30min。

（2）洗手和着装

彻底洗手，着清洁工作服，酒精消毒手。

（3）无菌培养操作

超净台内操作，点燃酒精灯，火焰附近操作，在安装吸头、打开或封闭瓶口时均应过火烧灼。

不直接用手触及器皿的无菌部分，如瓶口、瓶塞内侧，必要时借助镊子。

吸取培养液、平衡盐溶液、细胞悬液的吸管不能混用。

转移液体时，吸管口不能触及瓶口，以防交叉污染。

饭盒、瓶子不要过早打开，使用后及时盖好，瓶塞倒置在桌面。

面向操作台时勿大声讲话、咳嗽，以免喷出唾沫，污染工作台面。

操作完毕，整理台面，酒精擦拭。

2. 取材：

新鲜、无菌、避免有害因素损伤。

3. 组织分离

（1）离心分离：用于血液、羊水、胸水、腹水等悬液，500-1000 rpm低速离心5-10 min。（2）机械分离：用剪刀将组织剪切成小块，也可再挤压通过筛网，用于纤维成分少的组织，如脑、胚胎、一些肿瘤组织。

（3）消化分离：用消化液使组织松散、细胞分开，获得细胞悬液。常用消化液胰酶、EDTA、胶原酶。

4. 原代培养：

（1）组织块法：将组织剪切成小块后，接种于培养瓶底部，培养后细胞从组织块边沿移出生长。简便易行，适用于组织量少培养。

（2）消化法：将消化分离法获得的细胞悬液，接种培养瓶。在短时间内生长成片，适用于大量组织的培养，但步骤繁琐、易污染、成本高。

5. 传代培养：

贴附型细胞：加入消化液，镜下观察，见胞质回缩、细胞间隙增大，终止消化，吹打为单细胞悬液，计数后接种新的培养瓶。

悬浮型细胞：直接吹打或离心沉淀后再分离传代。

注意：1）贴壁细胞覆盖瓶底大部分（＞80%）方可传代，不要急于传代；

2）传代时不同细胞有不同的消化时间，要根据需要注意观察及时处理。

6. 细胞冻存和复苏（低温冰箱液氮罐冻存管）

目的：保存和利用细胞。

短期保存：-70℃低温冰箱，长期保存：-196 ℃液氮罐。