Protocol感受态制作与转化
感受态细胞制备与转化
6.6 实验步骤
菌株活化
1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH 5α， 用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH 在 LB培养基平板表面划线，于 37℃培养16 LB培养基平板表面划线， 37℃培养 16 小时; 小时; 2．挑取一个单菌落，转到3－5 ml LB培养基 挑取一个单菌落，转到3 LB培养基 中，于37℃培养3－5小时; 37℃培养3 小时; 3．将培养液全部转到100 ml LB培养基中培养 将培养液全部转到100 LB培养基中培养 2－3小时，到OD600＝0.3－0.4; 小时，
实验七、连接产物的转化及蓝白斑 实验七、 筛选
7.1 实验目的
学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞 的方法； 的方法；
7.2 试验仪器
1. 无菌工作台 2. 9cm 玻璃平皿 3. 细菌涂布器等
7.3 细菌热激转化原理
1. 转化原理：感受态细菌与质粒冰浴后在较高温度下短时间 转化原理： 水浴（热激），之后再冰浴，由于细菌细胞经受温度骤变， ），之后再冰浴 水浴（热激），之后再冰浴，由于细菌细胞经受温度骤变， 磷脂双分子层状态发生改变，对外源DNA的通透性增加， 的通透性增加， 磷脂双分子层状态发生改变，对外源 的通透性增加 质粒可以高效地进入细菌细胞。 质粒可以高效地进入细菌细胞。 转化子筛选原理：因质粒携带有筛选标记（ 2. 转化子筛选原理：因质粒携带有筛选标记（如氨苄青霉素 抗性基因， ），因而使接受了该质粒的受体菌具有抗 抗性基因，Ampr），因而使接受了该质粒的受体菌具有抗 如果将转化菌液涂布于抗生素的平板上培养， 性。如果将转化菌液涂布于抗生素的平板上培养，只有转 化体才能存活。 化体才能存活。 重组子筛选原理：所用载体克隆位点位于LacZ基因（编码 基因（ 3. 重组子筛选原理：所用载体克隆位点位于 基因 半乳糖苷酶， 诱导表达， 成蓝色） β半乳糖苷酶，受IPTG诱导表达，能分解 诱导表达 能分解X-gal成蓝色） 成蓝色 编码区内，外源基因插入后（重组子）造成该基因失活， 编码区内，外源基因插入后（重组子）造成该基因失活， 因而菌落呈现白色。 因而菌落呈现白色。
感受态细胞的制备和质粒的转化
感受态细胞的制备
• 实验目的：学习感受态细胞的制备过程 • 实验材料：大肠杆菌菌株DH5或DH10B • 实验原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打
孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生 长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少 的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/µg DNA； • 对于热激法，是利用冰冷的CaCl2/TSS处理对数 生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受 态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～ 107转化子/µg DNA。
击；
• 立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞； • 将细胞转入合适的培养管中37ºC培养1小时； • 吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板； • 37ºC培养过夜，观察结果。
• 附注：
• 利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转 化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不 得超过105个菌落），同时37℃培养不应超 过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可 将－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活 菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉 素敏感的卫星菌落的出现。
打匀，使细胞重新悬浮； • 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）
后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实 验步骤
– 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇 床培养过夜；
– 取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养 至OD600＝0.6（约2.5-3小时）；
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
质粒的转化及转化子的鉴定
• 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建 的重组子导入细菌的过程。将连接产物转 化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖， 便于后续分子操作。可以采用多种方法筛 选和鉴定目的克隆。
分子生物学实验-感受态的制备和转化(精)
实验三感受态的制备及转化一、实验目的1．了解质粒DNA转化原理2．熟悉感受态细菌的制备和转化步骤二、实验原理1．感受态细胞与转化感受态指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/μg质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。
如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109～1010转化子/ug闭环DNA。
感受态制备-protocol
宬槮感受态制备感受态制备实验操作1．电击感受态制备（1）实验准备①玻璃制品泡酸：合适且体积相对较大的锥形瓶、装吸水纸的培养皿、装去离子水和15%甘油的锥形瓶。
②塑料制品：200ul黄色枪尖剪去枪尖，1000ml蓝色枪尖，50mL离心管。
③溶液：LB培养基（活化和扩培），去离子水，15%甘油的水。
④以上物品都需要灭菌处理（121℃20-30min），离心管、枪头、ep管都需要烘干后低温放置。
（制备感受态的试剂都需要提前预冷）（2）实验操作①将存放在-80℃的菌种取出，在超净台内用枪尖沾取一下，分别加入相对应1mL LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中220rpm过夜培养（根据菌种特性设定）；②次日以1:100的比例将上一步培养的菌液添加入LB液体扩培培养基中，37℃220rpm摇晃培养至OD600为0.4左右；③将培养得到的菌液至于冰上静置20-30min,然后在超净台内分装到事先灭菌预冷的50mL的离心管中，4℃，4000rpm，离心10min；④在超净台内去除上清，用吸水纸吸去多余的上清，加入事先预冷的ddH2O 10mL 左右，在冰上摩擦使菌体悬起，再加入适量的ddH2O混匀（根据实际情况）4℃，4000rpm，离心10min；（此步骤目的是洗去多余的杂质，此过程一定要轻柔，且保证离心管盖严，以免染菌。
）⑤从离心机里缓慢取出，防止震动使菌体悬起（菌体松散沉积）。
在超净台内去除上清，用吸水纸吸去多余的上清，加入事先预冷的15%甘油10mL，在冰上摩擦使菌体悬起，再加入适量的15%甘油混匀（根据实际情况）4℃，4000rpm，离心10min；1/ 3宬槮感受态制备⑥重复步骤（5）⑦从离心机里缓慢取出，在超净台内倒出上清，尽量避免倒出沉淀。
最后用1ml 左右15%甘油悬起，100uL每支分装到事先插冰上预冷的1.5mL EP管中。
（此过程一定要保证无菌和低温）⑧需要转化的感受态可以防冰上待用；多余的转移到液氮中快速冷冻，放入-80℃保存。
感受态细胞的制备和转化
四 实验结果
转化效率计算公式如下： 转化子总数 转化频率= DNA加入量 =转化子/µ g DNA 转化子总数=转化菌落数*稀释倍数*转化 反应液体积
五 思考题
1 试总结出实验成功的关键步骤。 2 用乳糖作为BL21（DE3）菌株目的的基因 表达的诱导剂的作用机制是什么？ 3 在用氨苄青霉素作为抗菌素筛选转化子是， 一般37℃培养时间不超过20小时，为什么？ 4 氯化钙转化与电转化相比有哪些优点和缺 点。
实验 三 感受态细胞的制备和转化
一 实验原理
转化作用是在一定条件下，一种特定的DNA 分子（供体或称转化因子）转入到一定的细 菌体内（受体菌），使其发生遗传形状改变 的过程。 在正常生长条件下，少数细菌可发生转化作 用，但大多数细菌并不发生转化，只有在一 定条件作用下（如用Ca++处理细菌细胞或电 刺激），细菌呈现感受状态后，外源DNA才 能转化进入受菌体内。因此，若想将外源 DNA分子转化进入一定的受菌体内，通常需 将受体菌先制备成易感受状态。
三 操作步骤
2 重组质粒pGEX-6p DNA的转化 取上述感受态细胞200µ 1，加重组质粒DNA2µ 1（约 10ngDNA），混匀后，冰上作用30分钟，然后转到 42℃水浴 进行热休克90秒，快速转移样品到冰浴， 预冷1-2分钟，加0.8mlLB液体培养基，37℃培养45 分钟后取原液各0.2ml涂布Amp平板，同时将0.2ml感 受态细胞涂布于Amp平板作为对照。倒置平板， 37℃恒温培养箱中培养12-16小时，观察对照转化的 平板，观察转化子出现的数目，计算转化效率。所 得的到的单菌落即为菌株BL21（DE3）pGEX-6p。
感受态制备和电转化,多种感受态
一、金黄色葡萄球菌感受态制备1、平板上挑单菌落于TSB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml 培养基培养2h，OD600=0.4-0.53、2个50ml管冰上预冷，4℃将培养的菌分装2个50ml管中，5000rpm离心6-8min，去上清。
4、加10ml 0.5M蔗糖，打散菌体，再加40ml 0.5M蔗糖混匀，5000rpm离心5min，去上清。
5、重复4 .6、再重复4，但加到50ml 0.5M蔗糖后要在冰上冰浴30min，再5000rpm离心5min，去上清。
7、用600ul 0.5M蔗糖垂悬。
8、分装菌液，每管100ul。
9、液氮冷冻10s，存于-80℃。
二、大肠杆菌感受态1、平板上挑单菌落于LB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml LB培养液体基培养2h（用50ml管），到OD600=0.4-0.6。
3、冰浴10min。
4、4℃5000rpm离心5min，去上清。
5、加30ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
6、2 ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
7、分装每管100ul，存于-80℃。
三、超级感受态（一）溶液1、TB （1L）终浓度MnCl2-4H20 10.88g 55mmol/lCaCl2 1.665g 15mmol/lKCl 18.65g 250mmol/lPIPES(0.5mol/l,ph 6.7) 20ml 10mmol/lH2O 补至1L0.45um 过滤除菌1、PIPES(0.5mol/l,ph 6.7),哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES),≥99.5% 英文名称：Piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid1.5g PIPES溶于80ml水，5mol/l，KOH调Ph=6.7，定容100ml。
实验一 感受态制备及转化
（二）转化及复苏：
1. 取 100 μL感受态细胞，加入重组DNA 20 μ L （50ng)； 取 100 μL感受态细胞，加入20 μL无菌水（阴性对照1）； 取 100 μL感受态细胞,加入对照DNA 20 μ L （阴性对照2） 用枪头混匀，冰上放置20min。 阴性对照的目的？ 2. 420C循环水浴热激90秒 3. 冰浴2分钟 4. 每管加800μ L LB液体培养基，370C慢摇40min（120～140rpm） 5. 40C，5000rpm离心2min，弃去600μ L，取20～50μ L菌液，加40μ L Xgal和4μ L IPTG，混匀后涂布在含Amp的培养皿中 6. 倒置培养过夜（ 370C）
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备 及质粒DNA的转化
一、实验目的 学习大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及转化子鉴定的 基本原理和操作技术。 二、实验原理
感受态细胞(Competent Cells)：受体细胞经过一些特殊方
法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许 外源DNA分子进入。 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细胞,使之 获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、
6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 1.0mL，轻吹并悬浮细胞，冰上10min； 7. 离心 5000rpm ，40C，5min，去上清； 8. 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 100μ L用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作； 9.此为感受态细胞，若储存则需加入15～30%甘油，可在-700C或-200C冻存。
四、实 验 流 程
（一）感受态细胞的制备： 1. 预培养：接一单菌落到3mL LB培养基中，370C、190rpm振荡培 养过夜； 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含40mL LB液体培养基的锥形瓶中，
超级感受态细胞(大肠杆菌)-原理和制备Protocol
大肠杆菌超级感受态细胞原理和制备
所谓感受态，是指受体（或宿主）细胞最容易接受外源DNA片段而不将其降解并实现其转化的一种生理状态。
一. 原理：
人工感受态的形成, 需要低温和Ca2+处理，细胞膨胀成球状，细胞表面正电荷增加，
通透性增加，这样可能破坏了细胞膜上的脂质阵列。
转化的质粒DNA 由于形成抗
DNase 的羟基-钙( Ⅱ) - 磷酸复合物而粘附于细胞表面。
Ca2+与膜上的多聚羟基丁
酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物利于外源DNA 的渗入。
cAMP可以使感受态水平提高10000倍，而Ca2+也可大大的提高转化的效率，在
Mg2+的辅助下Ca2+感受的细胞转化率比单用Ca2+处理的高1.84倍。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：
1）局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
2）酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：
二. 制备：
本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在无菌低温下进行。
〖医学〗感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
式”近代发展起来的西医，20世纪西 医又发 展到“ 社会-心 理-生 物医学 ”或综 合医学 模式， 后基因 组时代 系统生 物学的 兴起， 形成了 系统医 学在全 球的迅 速发展 ，成为 继传统 医学、 西医学 之后中 、西医 学汇通 的未来 医学。 当代中 国医学 类专业 比较优 秀的学 校有北 京大学 、华中 科技大 学、郑 州大学 等学校 。
中医即中国传统医药学，是形成于 数千年 前的中 国，是 建立在 人们与 疾病长 期斗争 的经验 总结。 习樟恕 ９食鱿 治饕蕉 灾瘟撇 涣说募 膊≈
至于循证医学、比较医学、后现代医 学、行 为医学 等所谓 “医学 ”，都 称不上 一门独 立的医 学科学 ，关于 这一点 在灵魂 医学有 关章节 中将有 相关点 评。
(一)CaCl2 转化法 核心:目标细胞在 CaCl2·H2O 溶液中浸泡一段时间, 转化效率 107-109 cell/ gD 。
NE.coli: DH5 , TG1, XL-1Blue, JM105
(1)冰上 30min (2)热激 42℃ 90“ (3)恢复 1～2min (4)复苏 37℃ 45-60 min (二)原生质体转化法(protoplast) 适用于 G+ 细菌,特别是芽胞杆菌、酶母。 过程: (1)等渗环境下,脱细胞壁(Lysozyme) (2)细胞壁再生 (三)电转化法(electroporation) 缓冲液:10﹪ 甘油或蔗糖,含(或不含) Mg2+ 离子。 转化条件:2.5 KV/0.2cm 25 F 200-400 。
感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
一、实验原理
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分 子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)
感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
感受态细胞制备与转化
实验方法原理细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
实验步骤1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。
把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中，于37°C 下振荡培养过夜。
2. 转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中. 于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。
3. 室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞。
弃培养基，保留细胞沉淀。
5. 加入10毫升冰冷的CaCl2 溶液，并轻微打匀。
6. 4°C下，4000 rpm离心10分钟收集细胞。
7. 弃CaCl2 溶液，保留细胞沉淀。
8. 加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2 溶液，并轻微打匀。
冰浴放置若干小时为最好。
9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏。
10. 向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。
向每个转化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克)。
细心混匀管中成份。
于冰浴放置30到40分钟。
11. 把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。
（此时不能摇动转化管）12. 把试管迅速转移至冰浴2到3分钟。
感受态细胞的制备及转化
实验五感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。
通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。
细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。
将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。
通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。
三、试剂与仪器（一）试剂1．0.1mol/L CaCl2称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。
2．LB液体培养基（见实验一）3．LB固体培养基（见实验一）4．氨苄青霉素（100mg/ml）（二）仪器1．冷冻离心机2．平衡天平3．无菌操作台4．微量移液器5．高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。
2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。
3．取1ml菌液（接种）到50 ml LB中(37℃，预热), 扩大培养。
应准备两个培养物。
4．约2小时开始，用一个培养测OD600值（此培养只做测量OD600值用，OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。
OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。
所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。
5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。
6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。
7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。
感受态制备、转化
实验目的
1、掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的 原理
2、熟悉实验的操作具体步骤，掌握无菌 操作技术
3、掌握抗生素、蓝白斑筛选重组质粒转 化成功的克隆菌
一、感受态细胞的制备
感受态：指受体最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是 由受体菌的遗传性状决定的，同时也受菌龄，外界环境因子影响。处于感 受态的细胞称作感受态细胞。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜 幼嫩的细胞是制备感受态细胞和成功转化的关键。 正常状态下，细菌会分泌一种酶将外源DNA降解，只有某一生长阶段中 的细菌才能做为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。 感受态形成后，细胞的生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责 供体DNA的结合和加工等。细胞通透性增加，能接受外来的DNA分子进 入细
2、将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90s （不要摇动Ep管），然后将Ep管迅速转移到冰浴，冷却 2min
3、立即向上述管中加入400µl 的LB液体培养夜，然后37℃振 荡培养约45min 。（此时间段可以去吃饭）
4、取100µl转化细胞转移到含有抗生素的LB固体平板上，用 灭菌的玻璃棒涂布均匀，（玻璃棒酒精灯烧过后稍微凉 一下再用，不要过烫），室温放置几分钟待菌液完全被 培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养 过夜。
DNA序列。 两者可以通过互补的机制形成有功能活性的β-
半乳糖苷酶分子，此为α互补法。
β-半乳糖苷酶分解显色底物X-gal显蓝色。
当外源片段插入， lacZ基因不能表达，菌株呈
白色。
异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 IPTG
培养皿内菌落生长状况及结果分析
感受态制备、转化
大肠杆菌感受态的制备：1)第一天下午，从平板中挑取一个单菌落（或者挑取保存菌种），接种到5ml LB培养基中，同时为确定所选菌株没有被污染，做阳性对照：Top 10、DH5α用氨苄、卡那抗性的培养基；BL21还应加上氯霉素抗性培养基，正常状态下，抗性培养基中不会有菌生长。
2)如果抗性培养基没有菌生长，将无抗性培养基中的菌液（1:100）接种到200ml LB培养基中，37℃剧烈震摇培养（旋转摇床，240rmp/min）。
为得到有效转化，活细胞数不应超过108个/ml，可每隔15-20min测量OD600值来监测培养物的生长情况，OD600=0.375时开始制备（超过或小于改值，影响感受态的效果）。
注：DH5α应该OD600=0.4～0.5。
（BL21 OD=0.3~0.5）3)在无菌条件下，将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon270）中，冰上放置10min，使菌液冷却到0℃。
4)4℃，1600g，7min。
5)倒出细胞液，将管倒置以使最后残留的痕量培养液流尽（可事先在超净台紫外照射滤纸，倒扣上面，没有过多液体即可）。
6)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴30min。
7)4℃，1100g，5min。
倒出细胞液，将管倒置。
8)重复步骤6、7（第二次重悬后即可离心，不用再等30min）。
9)每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀。
100µl/管分装，-80℃保存。
10)作阳性、阴性对照：①将制备的感受态接种到无抗生素的LB平板上，检查感受态的状态。
②将制备的感受态接种到有抗生素的LB平板上，检查有无染菌。
③将一空载体分别转化到新制备的感受态和一已知转化效率的感受态中，检查新制备的感受态的转化效率。
准备物品：①. 甘油-CaCl2：1.1g CaCl2 + 20ml甘油，加水至100ml（具体量根据实验来定）②. 无菌物品：Ep管、50ml离心筒、（1ml，200ul）枪头、两个5ml枪头，灭菌后-20℃预冷。
感受态细胞的制备及重组质粒的转化
思考题
影响CaCl2法转化率的因素有哪些？如何提 高转化率？ 如何利用抗性筛选出重组克隆？
感受态细胞的制备及 重组质粒的转化
experiments of molecular biology
演讲者：
分：分离外源基因目的基因。
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转：转化宿主细胞，使复制子可以扩增复制。
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切、接：利用酶学方法，将外源基因与载体连接，形成复制子。
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筛：筛选含有目的基因的细胞(转化子)并扩增以获得目的基因克隆。
实验原理
C
B
A
抗Amp
宿主细菌
含Amp培养基
实验仪器、材料
．超净工作台 ．高速离心机 ．恒温摇床 ．恒温培养箱 ．恒温水浴锅 ．制冰机 ．移液枪
实验材料、试剂
大肠杆菌JM109菌株 重组质粒 3．1.5mL 离心管，Tip头 试管、培养皿
LB液体培养基 含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50µg／mL） 氨苄青霉素贮存液（浓度50mg／mL） 4．0.1mol/L CaCl2溶液
受体菌的培养
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质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化
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感受态细胞的制备
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实验 安排
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实 验 安 排
一、受体菌的培养
从新活化的E.coli JM109平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。（已做） 将该菌悬液以1:50转接于50ml LB液体培养基中，37℃ 250rpm振荡扩大培养约1-2h，当OD600nm值为0.3～0.5时，取出置冰浴。
实验感受态细胞制备及转化
DNA转化过程
准备感受态细胞
通过不同方法制备感受态细胞，如CaCl2法、 电穿孔法等。
转化反应
将混合物在适宜温度下进行转化反应，使 DNA进入细胞内。
DNA与感受态细胞混合
将DNA与感受态细胞混合，加入适量的转化 缓冲液。
细菌培养
将转化后的细菌在选择性培养基上培养，筛 选阳性克隆。
04
转化后处理
鉴定方法
采用适当的鉴定方法，如免疫荧光染色、PCR扩 增等，对筛选出的细胞进行鉴定，以确定其性质 和特征。
结果分析
对筛选和鉴定结果进行分析，比较不同实验条件 下的细胞性质和特征，为后续实验和应用提供依 据。
05
实验总结与讨论
实验结果分析
转化效率
实验结果显示，经过制 备的感受态细胞在转化 过程中表现出较高的转 化效率，成功将外源 DNA导入细胞内。
实验设备
01
培养箱
用于细菌培养。
02
离心机
用于细菌收集和洗涤。
03
冰盒
保持低温环境。
04
转化仪或电击器
用于感受态细胞的转化。
实验试剂
无菌水
用于洗涤和稀释细菌。
抗生素
用于抑制细菌生长，如Ampicillin。
抗性培养基
适合筛选转化子的培养基，如X-Gal、IPTG等。
02
感受态细胞制备
细胞培养
细胞生长状态
观察细胞生长状态发现， 感受态细胞在转化后能 够迅速恢复生长，表明 外源DNA已成功整合到 细胞基因组中。
分子鉴定
通过分子生物学手段对 转化子进行鉴定，证实 外源DNA已成功导入细 胞并表达。
实验结论
01
本实验成功制备了用于DNA转化 的感受态细胞，并验证了其高效 的转化能力。
感受态细胞制备及转化步骤
一感受态细胞的制备（材料：DH5α菌）1.下午三点左右将大肠杆菌接种于培养管中（取冻存的大肠杆菌接种于5ml LB 培养基中或用牙签挑菌培养），以220rpm在摇床上震荡过夜培养。
2.第二天取已经摇好的的菌液50或100ul接种于盛有5mlLB培养基的培养管中，每隔20分钟观察一次（大肠杆菌大约20分钟繁殖一次），2到3个小时后培养基变浑浊，将培养管置于灯光下摇动会出现大肠杆菌的絮状条带，此时培养液的OD600nm≦0.5，细胞数小于10的8次方。
3.将培养好的大肠杆菌倒到1.5ml的eppendorf管中（将菌体混匀后再倒），以10000rpm，离心1min.倒掉上清液后将培养管中的液体混匀后继续倒到eppendorf管中并于冷冻离心机中离心，直至将培养管中的菌液全部离心完毕。
4.倒净上清液后将盛有菌体的eppendorf管置于冰上，加入100ul冰的氯化钙（0.1M）溶液，并将菌体与溶液混合均匀（用手指用力弹），置于冰上静置10min （此时勿忘将氯化钙同样至于冰上保持其冰冷）。
5.将eppendorf管置于冷冻离心机中以8000rpm，离心1min。
6.弃上清后加50ul的氯化钙溶液混合均匀，若有液体溅到eppendorf管壁上可以进行短时离心，此时已制成大肠杆菌的感受态细胞。
大肠杆菌至于冰上备用，或于-80︒C保存。
二转化（transformation）1.另取1.5ml的eppendorf管置于冰上（做好相应标记），将含有感受态细胞的菌液混匀后取10ul的感受态细胞加入到eppendorf管中，随后加入1ul的质粒混匀（用手指肚轻弹），至于冰上静置30min。
2.将离心管置于42摄氏度的水浴锅中1到2min，随后迅速置于冰上，并向离心管中加入500ul LB培养基混匀后置于摇床上震荡培养1小时（37摄氏度，220rpm，使菌体恢复正常生长状态）。
3.用移液枪从离心管中取已经摇好的菌液100ul均匀的加入到相应的选择培养基上，用刮刀将菌液均匀的涂布到培养皿上过夜培养。
质粒DNA转化感受态大肠杆菌 protocol
质粒DNA转化感受态大肠杆菌一、实验原理转化（transformation）是将一种生物（供体）的遗传物质（通常为DNA）转入另一种生物（受体）并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。
大肠杆菌不是天然感受菌，在低温（0~5℃）环境下经CaCl2处理，细胞壁变松变软后能摄入外源DNA，这种状态称为感受态细胞（competent cell）。
质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
二、实验材料准备1. 器材微量移液取样器，移液器吸头，恒温水浴锅，制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，1.5 ml Eppendorf管，50 ml离心管，乳胶手套，恒温培养箱2. 试剂LB液体培养基、LB固体培养基、100mg/ml 氨苄青霉素(或卡拉霉素) 、感受态细胞3. 材料处理转化之前超净台紫外照射15-20min；枪头、50ml离心管需提前灭菌，烘箱烘干；液体LB培养基灭菌后放到冷库，防止长菌；三、转化1．从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,置冰上解冻1-2 min。
2．加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟。
3．42℃水浴中热击90秒, 然后迅速置冰上2min，整个过程不要振荡菌液。
4．向管中加入200μl LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养（225 rpm）1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
5. 将上述菌液摇匀后涂布于含Amp（或kna）的LB琼脂平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后,37℃倒置培养12-16小时。
四、注意事项1.加液体LB培养基之前观察其是否长菌2.玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂3.提前打开水浴锅，将温度调到42度4.实验目的是表达蛋白，可热击完直接涂平板；目的是质粒扩增或后续要PCR，需在热击后37℃振荡培养复苏1小时5.实验室常用的用于质粒扩增的感受态菌是Top10，用于质粒表达的感受态菌是BL21 Star(DE3)。
感受态的制备及其转化
实验仪器、材料与试剂
（一）仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 低温离心机 4. 微量取液器
（二）材料
大肠杆菌DH 5α。
（三）试剂
1. LB液体培养基 2. 0.1mol/L CaCl2溶液
实验步骤
1. 挑取大肠杆菌DH 5α的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养14h。 2. 取2mL菌液加入100ml LB液体培养基中，扩 大培养约2-3h；测OD600值，当OD600约0.4-0.5 时，停止培养。 3. 无菌条件下移入10ml 离心管中10ml菌液， 菌液冰上放置10min，4℃，3,500rpm，离心 5min。
实验注意事项
感受态细胞长时间处在常温状态，会严 重影响到其转化率，因此应尽量减少常 温操作，动作要迅速。 为减少对细胞的机械损伤，操作时动作 不能剧烈。 尽量在无菌状态下操作，减少污染的可 能。
实验八 大肠杆菌感受态的制备 （CaCl2法）及重组质粒的转化
生物工程教研室 岳续朋
1. 实验目的
2. 实验原理
3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果与讨论
实验目的
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 掌握质粒转化受体菌的方法
实验原理
用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是 限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法， CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通 透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的 载体分子进入的感受态细胞。
来自4. 弃上清，在冰浴上加入1ml预冷的无菌CaCl2 (0.1 mol/L)，轻摇使细胞悬浮。冰上放置5min。 5. 4℃，3,500rpm离心5min。 6. 弃上清，用1ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)重新 悬浮细胞，200μL/份分装到预冷的无菌Ep 管中， 4℃保存备用。 （如加入15%的甘油，-80℃保存， 可保存一年）。 7. 加入连接产物，冰上放置20分钟 min。 8. 42℃热击90秒，迅速放在冰上冷却5min。 9. 涂布到含抗生素的筛选平板，37℃倒置过夜。
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感受态细胞的制备：
1.以1:100的比例吸取过夜菌液（250ul）加入25ml LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养2-3h至OD600达到0.5左右（OD600范围0.4-0.6）。
2.将25ml菌液移至预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置30min，使培养物冷却到0℃。
3.于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。
4.倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。
5.每50ml菌液用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2，重悬每份沉淀，放置于冰浴上30min。
6.于4℃，以4000rpm 离心10min，回收细胞。
7.倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。
8.每50ml初始培养物用2ml 用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2（含15%甘油）重悬每份细胞沉淀。
9.在冰上将细胞分装成小份，100ul/份，防御-70℃冻存。
10.如果当天要用，最好将制好的感受态细胞在4℃放置4h后再用，效果较好。
制备好的感受态细胞在4℃放置24-48h内使用，不影响效果。
感受态细胞制备流程图：
过夜菌250ul加入25ml LB液体培养基37℃，200r/min 振荡培养2-3h OD600测
达0.5左右转移至50ml聚丙烯离心管冰上放置30min 培养物到0℃
4℃，4000rpm ，离心10min 回收细胞弃培养液倒置放置1min 加入
5ml 0.1mol/LCaCl2悬浮细胞沉淀，冰上放30min 4℃，4000rpm ，离心10min 回收细胞
弃培养液倒置放置1min 加入1ml预冷0.1mol/LCaCl2（含15%甘油）悬浮细
胞沉淀冰上分装，10ul/份70℃冻存（当天实验4℃放置4h，最多可放置48h）
转化
1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
2、加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。
但它们的转化效率并不一定一样。
有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。