细胞工程 第三章 植物组织与细胞培养
第 3 章植物组织与细胞培养
3.1植物组织培养与细胞培养的区别
习惯上：
由于体外培养技术最初是从培养组织发展起来的，所以在习惯上，动物学和医学上又往往用组织培养这一术语泛指细胞、组织和器官在适当的培养条件下离体生长的技术。
单细胞培养与组织和器官培养在技术上具有较大的区别
严格意义上：
组织培养是指从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长形成组织。
细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。
植物组织培养（Plant tissue culture）：是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花未成熟的果实、种子）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、胚胎、原生质等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、或者长成完整的植株的技术。
离体培养（culture in vitro)
试管培养（test tube culture)
常用术语
外植体(explant)：植物组织培养中用来进行离体培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。
愈伤组织(callus)：是由外植体组织增生的细胞产生的一团不定的疏松的排列的薄壁细胞。继代培养或传代培养：愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，营养物枯竭，水分散失，并已积累一些代谢产物，此时需要将其转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。褐变（褐化）：是由于组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生的醌类物质，这类物质是棕褐色，对外植体产生毒害作用，严重时导致死亡。
玻璃化(vitrification)：表现为试管苗叶、嫩梢是水晶透明或半透明，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层、蜡质、没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。
不定芽（adventitious buds)：从现存的芽以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的芽。
不定根（adventitious roots)：从现存的根以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的根。
3.2 发展历史
植物细胞工程是在植物组织培养的基础上发展和完善起来的，因此，植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。
植物细胞发展工程发展历史就是植物组织培养技术的历史。
发展过程大致划分为三个阶段
3.2.1 探索阶段
细胞学说的产生和细胞全能性的提出为组织培养技术的产生奠定了理论基础。
细胞学说(cell theory)
19世纪30，Schleiden和Schwann创立的
组织培养研究的思想基础
细胞全能性
1902年德国植物学家哈泊兰德（Haberlanclt）在细胞学说的基础上提出的。
植物细胞具有全能性，即植物活细胞具有能够发育成为完整植株的潜在能力。
而且进行了相关实验，但失败了！！！
原因：一是取材不当
二是培养基中不含诱导激素
由此，被称为——植物组织培养之父
3.2.2培养技术建立阶段
20世纪30年代至50年代末期，植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要技术模式。培养基模式
激素调控模式
培养基模式
White 于1934年，使番茄根的离体培养实验首次成功。
White 于1937年，发现B族维生素在离体培养中的作用，产生了由无机盐与有机成分组成的White培养基。建立植物根的离体培养技术。
法国科学家高特里特（R.J.Gautheret）1939年在添加B族维生素和IAA的培养基上连续培养胡罗卜根的形成层获得成功。
诺比考特（Nobecourt)于1938年以培养胡萝卜根为外植体，在固体培养基上诱导形成了愈伤组织。
White、Gautheret和Nobecourt植物组织培养的奠基人
他们的贡献
建立了植物组织培养的综合培养基，它包括无机盐、有机物和生长激素。
发现了B族维生素在组织培养中的作用，基本建立了植物组织培养技术。
现在所用的培养基和培养方法原则上都是这三位科学家所建立的方法和培养基的演变。
激素调控模式
1957年，斯科克(Skoog)和米勒(Miller)提出了有关植物激素控制器官形成的概念，建立了细胞分裂素/生长素比率控制植物组织的形态发生和器官分化的激素调控模式。
激素调控模式——细胞分裂素/生长素
比植高时----------产生芽
比植低时----------产生根
比值平衡时----------维持愈伤组织生长而不分化
3.2.3 应用研究阶段
1952年法国G.Morel将感染病毒的大丽花茎尖切离培养，获得去病毒植株。
1960年G.Morel采用兰属(Cymbidium)的茎尖培养，实现了去病毒和快速繁殖两个目的。1974年Greshoff从葡萄花药培养中，得到单倍体愈伤组织。
1975年Rosati从草莓花药培养中，获得小孢子发育的植株。
3.2.4 我国植物细胞工程的研究进展
早在20世纪30年代，我国两位已故的科学家罗宋洛和李继侗就已成为远东植物培养的先驱者。罗宋洛主要研究离体根尖培养的适宜条件，李继侗发现了银杏胚乳提取物对离体胚发育的促进作用。
20世纪80年代，我国研究重点明显倾向无性系的快速繁殖，许多已进入不同规模的应用阶段，如甘蔗、草莓、葡萄、菠萝、香蕉、各色观赏植物等等。
3.3 细胞全能性与形态发生
植物组织培养不仅能使处于分生状态的细胞继续保持分生能力；同时也可以使永久分化的细胞恢复分裂能力，如同生殖细胞或合子胚一样，其原因何在？
概括地讲，植物细胞工程的核心就是在离体培养条件下细胞全能性表达的调控。细胞工程的所有方法都是围绕这一核心产生和发展起来的。
因此，可以说细胞全能性理论是细胞工程的基本理论基础，
而与之相关的细胞分化、再分化及其调控机理则使人们更深刻地认识了细胞全能性的本质，并将其发展成为现代生物技术的重要领域之一
3.3 细胞全能性与形态发生
3.3.1 细胞全能性及其表达
3.3.1.1 细胞全能性概述
概念
细胞全能性:一个生活细胞所具有的发育成为完整生物个体的潜在能力。（全套的基因组）动物：有限发育模式细胞核全能性
植物：无限发育模式细胞全能性
生活细胞要表达全能性必须首先恢复到分生状态或胚性细胞状态，这种恢复能力在不同类型细胞间具有相当大的差异。
3类植物细胞:
周期细胞：茎尖、根尖和形成层细胞
终端分化细胞：筛管、导管、保卫细胞
G0期细胞：表皮细胞、各种薄壁细胞
影响全能性表达的因素
细胞分化的程度:细胞分化程度越高，其向分生状态恢复的可能性越小，表现细胞全能性的能力降低或丧失。这种能力降低或丧失的程度与分化细胞的的类型和其所处的位置有关。
生理脱离效应:在生物个体中，细胞的全能性不能表达，而当细胞或组织脱离母体以后，在适宜的条件下将有利于进行一些特殊的发育方式，称之为生理脱离效应
显然组织或细胞从完整的有机体上脱离下来，以脱离母体的影响，对于细胞全能性的表达是十分重要的。
人工条件的调控（激素的调控）
调控过程简单地归纳起来就是细胞的脱分化和再分化。细胞或组织的离体培养技术就是脱分化和再分化的控制过程。
温度、光照、湿度、pH值和激素等
细胞和组织与母体分离和激素的调控是细胞全能性的表达的基本前提。
3.3.1.2 培养条件下的细胞脱分化
离体培养条件下，细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化而实现的。
在大多数的情况下
脱分化是细胞全能性表达的前提
再分化是细胞全能性表达的最终体现者
脱分化（dedifferentiation)
脱分化的概念:培养条件下，使一个已分化并且具有一定功能的植物细胞失去原有的状态和功能，恢复到无分化状态或分生细胞状态的过程。
脱分化的能力：在离体培养条件下，植物不同组织的细胞的脱分化能力是不同的。
脱分化的时间：
观点一是：在离体培养条件下，一个分化细胞转化为分生状态，进入细胞分裂即为脱分化。
观点二是：细胞脱分化发生在细胞分裂之前，细胞分裂只是细胞脱分化的结果，而不是脱分化的过程。
总之，静止细胞启动分裂都是分化细胞成功脱分化的重要标志。
脱分化的过程：
启动阶段：细胞质增生，并向中伸出细胞质丝液泡蛋白体出现
演变阶段：细胞核开始向中央移动，质体演变为原质体
脱分化终结期：恢复到分生状态，细胞分裂即将开始
脱分化调控机理：
期细胞回复到分裂周期的调控过程。
细胞脱分化调控的实质是G
植物激素是离体培养过程中所必须的条件，因此，与植物激素相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。
植物细胞感受生长素的信号是通过生长素受体和生长素分子相结合，使生长素受体被激活，进而引起一系列连锁信号的传导反应，最终导致生长素诱导的基因表达
细胞脱分化与愈伤组织的形成：
大多数情况下，细胞脱分化后进入细胞分裂，形成愈伤组织。
有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞，进而形成体细胞胚。
3.3.1.3 培养条件下的细胞再分化
再分化（redifferentiation)的概念
在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长才能再生为个体。因此，通常把离体培养下的这一过程称为再分化。
再分化的过程事实上是基因选择性表达与修饰的人工调控过程
激素在细胞分化中的调控作用
有实验证明：细胞分裂素可能增加了细胞对生长素的敏感性的或者能阻断生长素的反馈信息。即细胞分裂素在细胞分化中的作用是通过增强生长素的作用而实现的。
在离体培养条件下，由于外植体细胞所处的生理状态的不同，其内源激素水平也存在较大的差异，试图寻找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很困难的。
3.3.2 植物培养细胞的形态发生
生物个体的形成是通过形态发生（morphogenesis)实现的，建立在离体培养基础之上的形态发生称之为体细胞形态发生（somatic morphogenesis)。与个体水平上的形态发生不同，培养条件下的形态发生不是起源于合子，而是起源于培养细胞。
在培养条件下，植物细胞经过再分化形成完整个体可以通过两种途径：
3.3.2 植物培养细胞的形态发生
植物器官发生organogenesis
体细胞胚发生somatic embryogenesis
3.3.2.1 植物离体器官发生 (organogenesis)
（一）概念
是指在离体培养条件下，组织或细胞团（愈伤组织）经过诱导分化形成不定芽（adventitious shoots)、不定根（adventitious roots)等器官的过程
自然条件下：受植物繁殖体自身调节控制
离体条件下：人工辅助调节完成的
离体培养条件下，器官发生的难易取决于研究对象的培养技术成熟程度及其调控机制基础研究的深度。
（二）离体培养中器官发生的方式
直接器官发生
?典型的直接器官发生
?非典型的直接器官发生
间接器官发生
直接器官发生
在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织阶段即可形成器官原基而直接发育成器官的途径。
这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体快繁中具有重要的实践意义。
典型的直接器官发生
顶芽、腋芽、茎尖和根尖分生组织具有器官原基或者细胞分裂活跃，保持着强烈的分化能力、可以直接发育成无根苗，然后再诱导生根便完成了植株再生过程。
例如：千头菊
非典型的直接器官发生
外植体某些部位的细胞，在重新分裂后直接形成分生细胞团（几乎不形成愈伤组织），然后由分生细胞团形成器官原基，结果不定芽直接从外植体表面受伤的或未受伤的部位分化出来。例如：非洲紫罗兰、球根海棠、百合、贝母等
间接器官发生
概念
首先诱导外植体形成愈伤组织（脱分化），然后再诱导愈伤组织分化出不定芽、不定根（再分化）的过程。
花药、花粉、单细胞及原生质体培养体系中；转基因过程中，愈伤组织的形成是必须的。
间接器官发生取决于愈伤组织再生不定芽的能力。
间接器官发生再生植株3种方式
先芽后根
先分化芽，然后在芽的基部诱导生根进而形成完整的植株。
较为普遍的一种方式
先根后芽
先分化根，然后在根上产生不定芽进而形成完整的植株。
研究证明：培养物中如果先形成根则往往抑制芽的形成，因此，在多数情况下通过分化培养基的调控首先来促进芽的分化；然后在促进根的分化。
芽与根同步发生
在愈伤组织的不同部位形成芽与根一般是同步发生的，芽中维管组织向下分化与根中的维管组织相互连接形成统一的轴状结构，进而形成完整的植株。
以上三种方式在同一个培养基中有时会同时出现，可以通过调整生长素和细胞分裂素的比值来调节器官分化的方式。
间接器官分化的过程
离体培养条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过三个阶段
第一阶段外植体经过诱导形成愈伤组织
外植体
脱分化
愈伤组织：
无序生长的薄壁细胞，处于非分化状态的愈伤组织细胞近圆形；处于表面的细胞体积较小，越往中间细胞越大。
第二阶段“生长中心”的形成
无序生长
有序生长
生长中心：拟分生组织
感受态细胞进行分裂，在愈伤组织中形成类似于形成层的排列有序的成束的致密细胞团。它们是愈伤组织中形成器官的部位。
第三阶段器官原基及器官形成
分化相应的组织器官
大多数固体培养条件下，表层细胞分裂形成茎或芽原基
不定根：内起源根原基则发生在愈伤组织深处
3.3.2.2 体细胞胚发生
（一）概念：
体细胞胚 (somatic embryo)：在离体条件下，没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。体细胞胚发生 (somatic embryogenesis)：在离体条件下，组织培养物中的体细胞经过类似于合子胚的发育形式，先形成胚的类似物，再生长发育成完整植株的过程。
（二）体细胞胚的结构与发育特点
合子胚在发育的初期具有明显的胚柄；体细胞胚无真正的胚柄，只有类似胚柄的结构。
合子胚的子叶是相当规范的；而体细胞的子叶常不规范，有时具有两片以上的子叶。
合子胚在胚胎发育完全进入子叶期以后进入休眠；而体细胞胚则直接形成植株。
与相同植物比较，体细胞胚的体积明显小于合子胚。
体细胞胚不能有明显的脱水干燥过程，含水量比合子胚要高的多。
体细胞胚结构与器官发生的不定芽的区别
体细胞胚具有明显的根端与苗端的两极性。后者只具有苗端的单性结构。
体细胞胚的维管束与周围的母体愈伤组织或外植体之间隔离。后者与原愈伤组织或外植体中的维管束相连接。
体细胞胚的微管组织分布呈独立的“Y”形。不定芽的维管组织则无此现象。
体细胞胚萌发即形成试管植株，通常不需要诱导生根阶段。器官发生的植株，需要转移到生根培养基上诱导生根，才能形成完整的再生植株。
（三）体细胞胚的形成途径
离体培养条件下，体细胞胚的发生可以归纳为两种途径，即：直接途径和间接途径
1、体细胞胚从外植体上直接发生
概念:从外植体的某些部位直接诱导分化出体细胞胚的过程。
叶片外植体体细胞胚的形成过程：
诱导期：伤口和叶片表层细胞分裂 2.4--D瘤状突起
胚胎发育期：瘤状物球形胚心形胚体细胞胚
2.体细胞胚间接发生途径
经过愈伤组织的体细胞胚发生
在固体培养中，外植体先形成愈伤组织，再分化发育产生体细胞胚。体细胞胚的形成过程需要三个阶段：? 诱导外植体的形成
? 诱导愈伤组织胚性化
? 体细胞胚形成
例如：大蒜叶片和根外植体2、4--D体细胞胚
细胞悬浮培养的体细胞胚发生
外植体胚性细胞团体细胞胚
例如：高丽参
（四）影响体细胞胚发生的因素
外源激素对体细胞胚发生的调控
培养基及培养条件对体细胞胚发生的影响
不同基因型间体细胞胚形成能力的差异
外源激素对体细胞胚发生的调控
?生长素对体细胞胚发生具有重要的调控作用
?2、4—D是应用最为广泛的生长素。以胡萝卜悬浮细胞系诱导体细胞胚产生的体系中，其使用有着以下的规律：
?首先较高的浓度下诱导胚性细胞的形成。
?然后在降低2、4—D的浓度下产生早期胚胎。
?一般在球形胚形成后，除去生长素则有利于体细胞胚的正常发育。
?对于具体的使用浓度，不同植物之间具有较大的差异。一般单子叶植物使用的浓度高于双子叶。
?细胞分裂素对体细胞胚发生的影响
?完成体细胞胚发育，细胞分裂是基本前提，而细胞分裂素具有促进细胞分裂、维持细胞活跃中具有重要的作用。因此，几乎所有的有关体细胞胚发生的培养基中均具有细胞分裂素的配合使用。
?当胚胎结构建立后，细胞分裂素对于维持茎和根分生组织的正常发育具有重要作用。
?体细胞胚诱导培养基中，细胞分裂素的使用浓度一般低于生长素的使用浓度。
?体细胞胚诱发生中，常用的细胞分裂素为BA
3.4 植物细胞工程的技术原理
实验室设置
细胞工程的基本技术
培养基组成及配制
外植体取材
离体培养条件的控制
培养物的继代培养及玻璃化
3.4.1实验室设置
实验室组成
基本设备配置
培养容器与用具
3.4.1.1 实验室组成
基本实验室：准备室、接种室、培养室；
是细胞工程实验所必须具备的基本条件。
3.4.1.1 实验室组成
辅助实验室：细胞学实验室、生化分析实验室
是根据研究或生产的需要而配置的专门实验室，主要用于细胞学观察和生理生化分析。
3.4.1.2基本设备配置
常规设备：天平、冰箱、酸度计、离心机、加热器、纯水器、分装设备
灭菌设备：高压灭菌锅
无菌操作设备：超净工作台、接种箱
培养设备：培养架、摇床、生物反应器、培养箱（光照培养箱、气候箱、CO2培养箱）
其它设备：时间程序控制器、空调等
3.4.1.3 培养容器与用具
培养容器：玻璃容器、塑料容器
金属用具：镊子、剪刀、解剖刀、接种铲、接种针
塑料用具：塑料封口膜、塑料盖
3.4.2 细胞工程的基本技术
洗涤技术
灭菌技术
3.4.2.1 洗涤技术
洗涤剂：合成洗涤剂、铬酸洗涤剂
洗涤方法：玻璃器皿洗涤、塑料用品洗涤、金属用品洗涤
3.4.2.2 灭菌技术
培养基灭菌：高压蒸汽灭菌、过滤灭菌
玻璃器皿灭菌
金属用具灭菌
操作环境灭菌
3.4.3 培养基组成及配制
培养基成分
培养基配方及培养基选择
培养基配置
3.4.3.1培养基成分
无机盐类、有机化合物、生长调节物质、水、琼脂、活性炭、硝酸银
无机盐类：
?大量元素：培养基中含量超过100mg/L的无机元素
C、H、O、N、P、K、Na、Ca、Mg、S
使用量一般为：每升几十至几千毫克
?微量元素：培养基中含量低于100mg/L的无机元素
铁、铜、锌、硼、钼、钴（Co）、氯
用量一般为：10-7~10-5 mmol/L
有机化合物：
维生素：在植物细胞里以各种辅酶的形式参与多项代谢活动对生长分化有很好的促进作用。盐酸硫胺素（VB1）：可以全面促进生长。
盐酸吡哆醇（VB6）：促进根的生长。
维生素C：具有抗氧化作用，防止褐化。
使用量通常为:0.1 ~1.0 mg/L
?糖类：提供碳源和能源，维持培养基的渗透压。
蔗糖: 2%~4%, 一般为3%（30g/L）
?肌醇：在糖类的相互转化、维生素和激素的利用等方面具有重要的促进作用，对胚状体和芽的形成具有良好的影响。
使用量一般为：50 ~100mg/L
?腺嘌呤:
?氨基酸:
甘氨酸
多种氨基酸混合物如：水解酪蛋白（在分化培养基中可促进胚胎发生）、水解乳蛋白
?其它复合成分：
一些天然提取物如：揶汁、番茄汁、酵母、牛肉膏等
植物生长调节物质：
天然植物激素：植物自身合成的
人工激素类似物（也称人工生长调节物质）：人工合成的
是培养基中不可缺少的关键物质，用量虽少，但对外植体愈伤组织的诱导和根、芽的器官的分化起着重要的调节作用。常用的有以下几种：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类
?生长素（auxin)
作用
促进细胞分裂和伸长生长，有利于外植体脱分化并启动细胞分裂，有利于形成愈伤组织。
在分化培养中，促进不定根的形成而抑制不定芽的发生。
在液体培养中，有利于体细胞胚的发生。
常用的生长素
吲哚乙酸（IAA）：天然的，不稳定（光、高压灭菌，细胞释放的酶）
吲哚丁酸（IBA）：人工合成的，较稳定
α-萘乙酸（NAA）：人工合成的，稳定。容易引起培养物褐化
2、4-二氯苯养乙酸（2、4—D）：人工合成的，稳定。高浓度的2、4-D抑制器官发生，因此在分化培养基中一般不使用。
强弱及选用次序：IAA< IBA < NAA < 24-D
通常使用量：0.1~10mg/L
?细胞分裂素类（cytokinin)
作用
促进细胞分裂、调节器官分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成。
还能显著改善其它激素的作用。
在离体培养中，细胞分裂素能够促进不定芽的发生。
常用的细胞分裂素
6--苄基腺嘌呤（6BA）：易褐化
激动素（KT）:抗褐化
玉米素（ZT）：
浓度低：易诱导愈伤组织
浓度高：易诱导愈伤组织分化
异戊烯氨基嘌呤（2ip）
苯基噻二唑基脲（TDZ）
强弱及选用次序：KT < 6BA< 2ip < ZT < TDZ
通常使用量：0.1~10mg/L
?赤霉素类
作用
离体培养条件下，赤霉素促进细胞的伸长生长，与生长素协调作用诱导形成层的分化，同时还能刺激体细胞胚发育成植株。
在某些情况下对于生长素和细胞分裂素具有一定的增效作用。
常用的赤霉素
植株体内的天然赤霉素有20多种。
目前，常用的赤霉素是人工生产的赤霉素多为赤霉酸CA3 。
在大多数情况下，培养物本身的内源赤霉素已能满足其生长发育的需要，只在特殊的情况下才需添加外援赤霉素，而且其使用浓度必须严加控制。
水
常用水的类型
双蒸水或超纯水：原生质、细胞培养
蒸馏水或纯净水：一般的快速繁殖
装水的容器
塑料制品
琼脂 (agar)
?来源：是一种从海藻中提取的多糖类物质，是组织培养中常用的培养基凝固剂。
?作用：培养基凝固剂
?一般的使用浓度：0.6% ~1.0 %，5 ~6g/L 。
?注意事项：浓度高：影响培养物对营养物质的吸收。
浓度低：凝固不好，起不到支撑作用。
?细胞悬浮培养和液体培养基不添加琼脂
活性炭（active carbon)
?常用的吸附剂。
?使用量为：0.5% ~ 3%。
?既可以吸附培养基中的有害物质，也可以吸附植株激素。
?在高压灭菌之前加入会降低pH值，使琼脂不易凝固。
?生根培养基中添加活性炭有利于根的诱导。（可能是模拟了土壤的黑暗环境）
硝酸银
?作用：
在培养基中加入硝酸银（AgNO3),能起到促进愈伤组织的器官发生或体细胞胚发生的作用。 可以使某些再生困难的物种分化再生植株。
增加外植体产生不定芽的数目及提高植株再生频率。
?使用的方法：
使用浓度一般为1~10mg/L,过高常会产生有害作用。
过滤灭菌，并且培养基的温度降至60℃以下时再加入。
培养物在形成原基以后（大概11天），即可去掉硝酸银，否则时间过长可导致再生植株畸形3.4.3.2 培养基配方及培养基选择
常用培养基配方
?富盐平衡培养基：MS、LS、BL、BM、ER
?高硝态氮培养基：B5、N6、SH
?中盐培养基：H、Nitsch、Miller、Blaydes
?低盐培养基：White、WS、HE、改良Nitsch、HB
培养基选择
?选择合适的基本培养基：参考前人的经验，是培养初期培养基配方选择的一条捷径
MS：广普型，适合于大多数双子叶植物，可首选作为基本培养基
N6：适合于单子叶植物，适合于禾本科小麦、水稻。
B5：适合于单子叶植物，豆科作物起始培养。
White:适合于根的培养。
?激素的种类、浓度和比例的确定
首先，参考已有的相关文献报道。
如果没有，在建立激素配比中，将每一种拟使用的激素选择3-5个水平，再按随机组合的方式建立如下的激素配比实验方案。
总体来讲，离体培养中细胞分裂素和生长素的配比原则是：
诱导愈伤组织时：细胞分裂素与生长素相对平衡。
诱导芽分化时：细胞分裂素水平高于生长素水平。
诱导根发生时：细胞分裂素水平低于生长水素平。
3.4.3.3 培养基的配制
MS培养基母液的配制与保存
大量元素（1L母液用量mg/L ）（1L培养基取用量ml）
KNO
3
38000
NH
4NO
3
33000
MgSO
427H
2
O 7400 50
KH
2PO
4
3400
CaCl
222H
2
O 8800
微量元素（1L母液用量mg/L ）（1L培养基取用量ml）
MnSO
424H
2
O4460
ZnSO
427H
2
O1720
H
3BO
3
1240
KI 166 5
Na
2MoO
4
22H
2
O50
CuSO
425H
2
O5
CoCl26H
2
O5
铁盐（1L母液用量mg/L ）（1L培养基取用量ml）
Na
2
2EDTA 7460
FeSO
427H
2
O 5560 5
有机成分（1L母液用量mg/L ）（1L培养基取用量ml）
肌醇 20000
烟酸 100
甘氨酸 400 5
盐酸吡哆醇(VB6) 100
盐酸硫胺素（VB 20
?激素母液的配制与保存
生长素类（0.1~0.2mg/ml )
IAA：先用95 %乙醇使之溶解，加蒸馏水定容。
NAA：可溶于热水中，也可采用IAA方法。
2.4-D：先用少量1 mol/L的NaOH使之溶解，缓缓加入蒸馏水定容至所需要的体积
分裂素类（0.1~0.2mg/ml )
先用少量的1 mol/L的HCl溶解后，再用蒸馏水稀释至所需要的浓度。
赤霉素类
它的水溶液稳定性较差，一般用95 %乙醇配子成5-10mg/ml的母液低温保存，使用时再稀释。
加入所需数量的蔗糖（ 30g/L）。
如果是固体培养基，要加入所需数量的琼脂粉（ 5 ~6g/L ）或琼脂条（ 8 ~10g/L）。
加入终体积的3/4的蒸馏水，并加热使之充分溶解。
加入所需的植物生长调节物质。（IAA、 CA3等高温、高压易分解，高压灭菌后温度下降到40*C时，在无菌条件下通过装有孔径为0.25-0.45um的生物滤膜的微孔滤器加入）
加蒸馏水定容至最终体积。
用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCL调节pH值至5.8。
分装到培养容器中，1/4 ~1/3体积。
培养容器封口。
尽快高压蒸汽灭菌。
配置好的培养基两周内用完，如果不能立即使用，最好能在4?C条件下保存，避免物质的光解。
3.4.4 外植体（explant)是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料，它是植物离体培养的基础材料。
根、鳞茎、块茎、茎段、叶片、子叶、花瓣、花药、胚珠、幼胚、茎尖等。
3.4.4.1 外植体的母体植株来源
生长在自然环境下的植株。
?一般带有内生菌，严格灭菌处理。
有目的地培育在温室控制环境条件下的植株。
无菌环境下离体培养的植株。
?应尽量使用温室和人工控制培养的植株。这样以减少感染的概率，同时可以保持植株材料之间的一致性，从而提高实验的可重复性。
3.4.4.2 外植体的选取
选择适宜的外植体，首先要明确材料选择的目的，选择优良的或特殊的具有一定代表性的基
因型可以提高成功率。
植物的基因型不同，组织培养的难易程度不同：
草本植物比木本植物容易培养。
双子叶植物比单子叶植物容易培养。
植物基因型不同，组织培养的再生途径也不同：
十字花科的胡萝卜易于诱导胚状体。
茄科中的烟草易于诱导愈伤组织。
一般情况下，幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力。
外植体最好在植物生长开始的季节采样。
同一植株不同部位之间的再生能力差异较大。
例如：同一种百合鳞茎的外胚层比内胚层再生能力强，下段比中段和上段再生能力强
3.4.4.3 外植体的灭菌消毒
常用的消毒剂
?次氯酸钠：用于较软和较幼嫩组织消毒灭菌，使用浓度为2%，消毒时间5~30min，效果很好。
?氯化汞（升汞）：用于种子、块茎及较硬组织消毒灭菌，使用浓度为0.1% ~ 0.2%，灭菌时
间2~10min，效果最好。但其残留液去除最难，对植物组织的伤害也较大。
?乙醇：具有较强的杀菌力和穿透力，它能使材料表面湿润以利于其它消毒剂的渗入而增强杀菌能力。浓度为70% ~ 75%。灭菌时间0.5~1min，时间稍长常会引起材料损伤、坏死。
外植体的灭菌方法
外植体取材→自来水冲洗30min→70%酒精表面灭菌30s→无菌水冲洗→消毒剂处理→无菌水充分冲洗→备用
3.4.4.4 外植体的接种
概念：在超净工作台上根据外植体的类型和培养需要，将消过毒的外植体分割成适当的大小，并将其转移到培养基上的过程，即是外植体的接种。
无菌操作的程序
?接种室的灭菌：接种前，打开超净工作台并用70%的酒精擦拭灭菌，再用紫外灯照射灭菌30min。
?操作工具的灭菌：接种使用的镊子、解剖刀、培养皿、三角瓶等要事先经过高压蒸汽灭菌。操作过程中，使用过的镊子、解剖刀要经常在酒精灯上灼烧灭菌。
?操作人员的灭菌：工作服、帽子、口罩保持干净，定期消毒灭菌；双手双臂要用70%的酒精
擦拭灭菌。
接种时，动作要轻，身体不要进入工作台，以免带入细菌造成污染。
?材料的分割：外植体的分割在灭过菌的培养皿中进行，分割之前先用无菌吸水纸吸掉多余的水分，
切割外植体时刀片与外植体成直角，水平拉动保证刀口整齐。分割后的外植体立即接种，以防失水。
?材料的接种：将培养瓶靠近酒精灯火焰，瓶口倾斜，轻轻去掉封口膜，将瓶口在火焰上旋转灼烧数秒，用灼烧冷却后的镊子将外植体均匀分布在培养基上。再次灼烧瓶口数秒钟封住瓶口。
接种完毕后，在封口膜上注明植物名称、外植体类型、接种的日期等，以免混淆。
3.4.4.5 外植体褐化
褐化：是由于组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生醌类物质，这类物质是棕褐色，对外植体产生毒害作用，严重时导致外植体死亡。
影响褐变的因素：植物种类及基因型、外植体部位及生理状态、外植体受伤程度、培养基成分及培养条件、培养时间过长
褐变的防止措施：选取适宜的外植体、预处理外植体、筛选合适的培养基及培养条件、添加褐变抑制剂和吸附剂、连续转接
3.4.5 离体培养条件的控制
外植体接种完毕后，应尽快置于适宜的培养条件下进行培养。由于不同的植物种类对自然生态条件的要求差异很大，因此，其适宜的培养条件也不尽相同，需要根据不同的植物类型和离体培养类型来确定培养条件。
3.4.5.1 光照
3.4.5.2 温度
3.4.5.3 湿度
3.4.5.4 通气状况
3.4.5.5 培养基pH
3.4.5.1 光照
光照时间:12~16h/d
不同的培养物对光照有不同的要求
?一些植物组培过程中器官形成不需要光。如：荷兰芹
?有些植物光照条件下，可以提高幼苗的增植。如，黑穗醋栗。
?短日照的植物，需要短时间光照
?长日照的植物，需要长时间光照
光照强度: 1000~5000 lx(1000 lx = 18 μmol?m-2?s-1 )
?培养初期或愈伤组织的增殖黑暗培养或弱光照条件下培养：光照过强往往抑制培养初期外植体的增殖。一是因为，强光照抑制外植体周缘细胞分裂，使外植体启动时间推迟；另一方面，在光照条件下外植体伤口迅速褐化，影响增殖，甚至导致死亡。
?器官分化阶段，高强度的光照
愈伤组织只有在光照条件下，才能变绿进而分化器官。
光质
?不同的光质（不同波长的光）对器官的分化关系密切。光质对器官分化的影响大于对细胞分裂的影响。
例如由烟草实验证明：诱导愈伤组织形成芽，起关键作用的是蓝光，红光没有效应。
根的形成正好相反，是受红光刺激的，蓝光则没有效应。
?光质对器官发生的影响还可能与植物的种类、器官类型有关。
对于形态发生的光效应同一植物的不同器官是不相同的；不同植物之间的同一器官也是不完全相同的。
?光质对器官形成的影响可能受外植体所含光敏色素所调节。
总之，有关光质、光量对离体组织形态发生的影响，目前尚缺乏系统的研究。但它们的作用是一个值得重视的因素。
3.4.5.2 温度
常用的温度范围：大多在20~30°C，通常控制在25±1 °C
低于15高于35会抑制细胞、组织的增殖和分化。
在具体的培养中，温度的设定必须根据植物的类型来确定。
要考虑原植物的生态环境
温度过低，会导致生长停止，也会导致愈伤织褐化。
在可以忍受的范围内高温对培养物的影响比低温要严重的多
3.4.5.3湿度
培养容器内的湿度：100%
培养室的湿度：70%~80 %
3.4.5.4 通气状况
乙烯
氧气
二氧化碳
3.4.5.5 培养基pH
常用范围：一般为5.5￣6.0，通常调整为5.8低于4.0高于7.0培养物不能正常生长。
引起PH值变化的原因
培养基自身成分的变化
培养物的代谢产物释放
高温灭菌：一般要下降0.2个单位
3.4.6 培养物的继代培养及玻璃化
继代培养
玻璃化
3.4.6.1 继代培养
概念：培养物经过一段培养之后，为了防止细胞团的老化或培养基养分的耗尽而造成的营养不良以及代谢产物毒害等的影响，应及时将其转移到新鲜培养基中，继续培养，以使培养物顺利地增殖、生长及分化长成完整植株。
继代培养的时间
液体培养继代时间短：一周左右继代一次
固体培养继代时间长：2-4周继代一次
继代培养的培养基及条件
继代培养使用的培养基及培养条件要因培养阶段的不同加以选择。
例如：甘薯茎尖组培中，愈伤组织的增殖培养
在添加2.4-D2.0mg/L的MS液体培养基中震荡培养。
光照13h/d、光强500lx、温度(27±1)。C 。
甘薯体细胞胚诱导阶段
在添加ABA1.0mg/L的MS固体培养基中培养。
光照13h/d、光强3000lx、温度(27±1)。C 。
继代培养过程易出现的问题
?经过长期继代培养，外植体在培养初期具有的形态发生能力多会有所下降，甚至丧失。
?经过长期继代培养，容易造成试管苗玻璃化现象。
3.4.6.2 玻璃化( vitrification )
?定义及表现：表现为试管苗叶、嫩梢是水晶透明或半透明，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层、蜡质、没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。
?玻璃化现象发生的机理
首先由外界培养条件引起生理生化异常和功能上的障碍从而导致形态结构上的畸形
?防止玻璃化现象的措施
使用固体培养基，增加琼脂浓度，降低培养基的衬质势造成细胞吸水阻遏。
适当提高培养基中蔗糖的含量，降低培养基中的渗透势。
适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度。
增加自然光照，紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化，有助于玻璃化现象的消失。
控制温度，适当低温处理，避免培养温度过高。
改善培养容器的通风换气条件，降低培养容器内的相对湿度。采用棉塞或通气好的封口膜封口。适当增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Zn等元素的含量，降低N和Cl元素的比例。特别是降低铵态氮（NH4NO3）的浓度，提高硝态氮（KNO3）的浓度。
植物细胞工程的中心内容实质上就是植物细胞、组织和器官的培养。从技术上说它是一种从单细胞到植株的无性繁殖技术，从遗传的角度来讲这一技术具有双重性：一是遗传的保守性，二是遗传的变异性。
根据研究目的的不同，我们可以从技术上对二者进行选择和控制。
利用其保守性
可以进行植物脱毒和快速繁殖、保存种质资源、建立生物反应器生产具有经济价值的次生代谢产物。
利用其变异性
可以进行体细胞诱变以筛选符合育种目标的突变体、并进行体细胞杂交以克服远源有性杂交的障碍。
下面将分别介绍
愈伤组织培养
植物组织和器官培养
单细胞培养及次生代谢产物的生产
原生质体培养及体细胞杂交
人工种子
3.5 愈伤组织培养
3.6 植物组织与器官培养
3.6.1定义
植物组织与器官培养是指以植物细胞的全能性理论为指导，在组织及器官水平进行的培养及开展的研究。
3.6.2 植物组织与器官培养类型
茎尖培养:快速繁殖与植物脱毒技术
根的培养
叶的培养
胚的培养
胚乳培养
花药和花粉培养及单倍体育种
3.6.3 植物组织与器官培养的应用
离体快速繁殖、植物脱毒
3.6.3.1 离体快速繁殖
离体快速繁殖的概念
离体快繁的一般技术
离体快繁的使用范围
离体繁殖的遗传变异控制
3.6.3.1.1 离体快速繁殖的概念
许多的植物尤其是无性繁殖的植物，在自然条件下的繁殖系数低阻碍了推广应用的速度，离体快速繁殖就是利用细胞的再生特性，在组织培养条件下加速繁殖材料的个体生产，提高繁殖系数。以植物组织培养技术为基础，跟常规的繁殖方法相比，它是一种微型的操作过程，因此，也称之为微繁(micropropagation)。
3.6.3.1.2 离体快繁的一般技术
(1)无菌培养物的建立：其程序包括外植体的选择、外植体的灭菌、外植体的接种和培养等基本过程。外植体的选择主要应该考虑以下3个方面的问题。其一，植物在自然条件下的繁殖特点；其二，离体条件下茎芽的增殖方式；其三，外植体的取材部位、大小和生理状态。
(2)培养物的增殖: 腋芽增殖；不定芽增殖；胚状体增殖；愈伤组织增殖，愈伤组织增殖的特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。对要求遗传稳定性高的作物品种一般不采用这一途径快繁，但有些植物例如花卉往往要求有丰富的变异，适于采用这条途径进行快繁。
(3)生根培养。
(4)生产用苗的培植
3.6.3.1.3离体快繁的使用范围
用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物，或某些需要需要加速繁殖的特殊基因型，如名贵花卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等等。
用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等等。
用于有性繁殖变异范围过大而自然条件下又不易无性繁殖的植物，如非洲菊、花竹、紫罗兰等。
3.6.3.1.4 离体繁殖的遗传变异控制
外源生长调节剂对品种典型性的影响
继代次数与变异
增殖方式的合理选择
3.6.3.1植物脱毒
植物脱毒的概念
植物脱毒的基本原理
植物脱毒的技术规程
影响脱毒效果的因素
植物脱毒概念
生长在自然状态下植物受到病毒的侵染，可以通过繁殖材料尤其是无性繁殖材料进行积累和世代间的传播，造成品种的退化（degeneration）。
植物脱毒（virus elimination）就是利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中侵染的病毒生产健康的繁殖材料。
茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径：药物防治病毒病效率低，(2)抗病毒育种步履艰难，(3)组织培养的高效隔离防治了病毒的再侵染。
植物脱毒的基本原理
病毒在植物体内的分布具有不均匀性，越靠近根尖和茎尖区域病毒含量越低。病毒在植物体内分布不均匀性的机理目前还不十分清楚，但根据病毒及分生组织的特性，学者们提出一些假说，主要有以下几种理论假说：(1)能量竞争：病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。
(2)传导抑制：病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。
(3)激素抑制：在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。
(4)酶缺乏：1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。
(5)抑制因子：1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中自然地存在有某种抑制因子。这种抑制因子也可能是有性繁殖种子通常不带病毒的原因。
尽管上述假设还需要进一步研究证实，但在植物分生组织中不带或很少带有病毒的发现，为植物脱毒和利用组织培养技术快速繁殖健康种苗开创了新途径。
植物脱毒的技术规程
（1）被脱毒植物携带病毒的诊断
（2）母体植株的选择和预处理
母体的选择：欲脱毒材料的品种典型性；外植体健康程度选择。
预处理：是提高脱毒效率的辅助措施。一般采用热处理，分为干热和湿热两种。
（3）茎尖分生组织培养再生植株
茎尖分生组织培养有两个概念：
shoot tip－shoot apex；apical meristem－apical dome.
（4）脱毒效果检测
指示植物鉴定(indicator plants test)：所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。
血清学鉴定(serologic test)：试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(ELISA)。（5）脱毒苗的保存与繁殖
脱毒苗的离体保存与繁殖
建立脱毒种苗生产繁殖网络体系
木本植物建立隔离的脱毒苗母本园
影响脱毒效果的因素
(1)母体材料病毒侵染的程度
(2)起始培养的茎尖大小
(3)外植体的生理状态
3.7 植物细胞培养与次生代谢产物的生产
植物细胞的培养技术
次生代谢产物的生产
3.7.1 植物细胞的培养技术
植物细胞培养定义
植物细胞培养的培养基
植物细胞培养的类型
植物细胞培养的意义
植物细胞培养存在的问题与发展趋势
3.7.1.1 植物细胞培养的定义
?植物细胞培养（plant cell culture) 是指在离体条件下将植物的单个细胞或小的细胞团在培养基中进行培养使其增殖的一种技术。
?植物细胞培养是在植物组织培养技术基础之上发展起来的。植物细胞的全能性
3.7.1.2 植物细胞培养的培养基
目前，细胞培养中广泛使的培养基主要是：MS、B5、N6
3.7.1.3 植物细胞培养的类型
植物细胞悬浮培养
植物单细胞小规模培养
植物细胞的大规模培养
植物细胞两项培养技术
植物细胞的固定化培养
3.7.1.3.1 植物细胞悬浮培养
（一）定义：细胞悬浮培养（cell suspension culture)是指将单个的游离细胞或细胞团在液体培养基中进行培养的技术。
（二）悬浮培养的技术流程
愈伤组织诱导与继代培养
悬浮系的建立与继代培养
悬浮细胞生长动态与增殖
悬浮培养细胞同步化方法
愈伤组织诱导与继代培养
愈伤组织的要求：用于建立悬浮系的愈伤组织必须有较好的松散性，使之在悬浮培养的起始阶段细胞容易打散。同时，愈伤组织还必须具备较强的增殖和再生能力。
选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。特别是幼胚，
因为以胚为外植体建立的愈伤组织，细胞生活力强，增殖速度快，组织分化与再生能力强
培养基成分的影响
在大多数情况下，24-D常作为起始培养基的生长素，且使用的浓度较高。配合一定浓度的细胞分裂素，常用的是6BA。有时，为了使愈伤组织具有良好的生理状态，需要附加一定浓度的水解酪蛋白、脯氨酸、谷氨酰胺等有机物。
愈伤组织的选择和继代培养
因为直接由外植体诱导的愈伤组织，很难获得均匀一致的疏松性。只有在继代培养中不断选择那些疏松性好、细胞状态好的细胞连续继代培养，才能获得大量的均匀一致、疏松易碎，适合于建立悬浮细胞系的愈伤组织
悬浮系的建立与继代培养
悬浮系的建立
选取生长旺盛而疏松的愈伤组织，用镊子夹取放入培养瓶中，一般采用100ml（或250ml）三角瓶，装25ml（或50ml）液体培养基，按照每克愈伤组织鲜重10ml液体培养基的比例接种。若愈伤组织不易分散可用镊子轻轻夹碎。必要时加入0.1℅的果胶酶使组织块分散成单个细胞，培养一天后在转入不含果胶酶的培养基。
将已经接种的三角瓶置于摇床上，在100-120r/min，25±1。C和黑暗条件下进行振荡培养。
悬浮系的继代培养
悬浮系建立以后，经过一段时间的培养细胞开始进行生长和分裂，培养体系中的细胞数量、体积和状态均发生连续的变化，为了保持悬浮细胞一直处于一个相对稳定的良好状态，一般每隔1-2周要继代一次。具体可视细胞生长速度而定。
如果继代时间为1周，按原悬浮液与新鲜培养基1：4混合。如果时间为2周，按原悬浮液与新鲜培养基1：10混合。具体接种量要根据继代时的细胞密度确定。悬浮系稳定后，继代培养中振荡频率适当降低，一般为80r/min
悬浮细胞生长动态与增殖
悬浮细胞的生长曲线与微生物细胞生长基本相同，也经历延迟期（适应）期、指数生长期、直线生长期、减缓期、静止期和衰亡期等阶段，长期处于停止期的细胞会出现死亡和生活力下降。因此，一般在细胞生长进入减缓期时就要及时进行继代培养。
悬浮培养细胞的同步化方法：是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
目前细胞同步化方法大约有以下几种。
?物理方法：分选法、体积选择法、低温处理法
?化学方法：饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法
（三）细胞悬浮培养法类型
浅层静止培养法：使培养材料的一部分露于液体培养基表面，一般采用静止培养的方式。
深层振荡培养法：使培养材浸入液体培养基，采用振荡培养的方式。
3.7.1.3.2 植物单细胞小规模培养（ single cell culture )
3.7.1.3.2 植物单细胞小规模培养
植物单细胞分离制备方法
植物单细胞小规模培养方法
细胞株的筛选
细胞株的保存
3.7.1.3.2.1 植物单细胞分离制备方法
由完整的植物器官分离单细胞：机械法、酶解法
由愈伤组织分离单细胞：
愈伤组织诱导法
3.7.1.3.2.2 植物单细胞小规模培养方法
微室培养法(micro-chamber culture)
平板培养法(plating culture)
看护培养法 (nursing culture)
饲养层培养法(feed layer culture)
双层滤纸植板培养法
纸桥培养法
平板培养法（plating culture)
看护培养法 ( nurse culture)
微室培养法(micro-chamber culture)
?概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。
?优点和缺点：在培养过程中，可以对单细胞分裂增殖的过程连续的活体观察。但培养基量少，养分和水难以保持，仅能短期培养。
?方法：
饲养层培养法
双层滤纸植板培养法
纸桥培养法
3.7.1.3.3 植物细胞的大规模培养
植物细胞大规模培养体系的建立
植物细胞大规模培养生物反应器
植物细胞大规模培养的生物反应器
机械搅拌式生物反应器
气升式生物反应器
鼓泡式生物反应器
植物细胞大规模培养方式
分批培养
流加式培养
半连续式培养
连续式培养
3.7.1.3.4 植物细胞两项培养技术
定义：在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长、合成次生代谢物质，分泌出来后转移至有机相中。
优点：这样不仅减少了产物的反馈抑制作用，从而提高产物含量，而且可以通过有机相的不断回收及循环使用，实现培养的连续化。
紫杉醇细胞两相培养举例
（一）实验材料：细胞株系为东北红豆杉细胞系，培养基采用某些成分加倍后的B
培养基，附
5
加蔗糖、水解酪蛋白等成分。有机溶剂采用与细胞相容、对产物有大的分配系数的十六烷、油酸等。
（二）生产过程
将红豆杉细胞两相培养在25℃，100r/min的摇床上，无光照。培养10天后补加营养盐，再继续培养6天。
（三）紫杉醇含量分析
离心分离获得细胞、胞外培养液、有机相溶液，用高效液相色谱进行测定。对于收获的细胞经冻溶、加入环已烷研磨破壁，再加入甲醇超声处理，合并甲醇液用于测定。
（四）结果
两相培养结果好于一般悬浮培养，胞内紫杉醇含量为0.893mg/l，胞外培养液中含量为0.75 mg/l，有机相中含量为10.65 mg/l，总产量为12.39 mg/l。
3.7.1.3.5 植物细胞的固定化培养
细胞固定化培养的定义：是指将游离的细胞包埋在（多糖或多聚化合物制备成的网状）支持物内部或表面，培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术。
3.7.1.3.5 植物细胞的固定化培养
细胞固定化培养的优势
细胞生长较为缓慢，利于次生代谢产物的积累。
易于控制化学环境，收获次生代谢产物。
细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小。
有利于进行连续培养和生物转化。
3.7.1.3.5 植物细胞的固定化培养
植物细胞固定化方法
物细胞经常采用的固定化方法有：凝胶包埋、表面吸附、网格或泡沫材料固定、膜固定（包括中空纤维）。经常采用的固定剂主要是一些多糖和多聚化合物等。
3.7.1.3.5 植物细胞的固定化培养
支持物类型
由带电多聚物的离子交联形成胶体。
如海藻酸盐、角叉藻聚糖。
有热的多聚物冷却形成的胶体。
如琼脂、琼脂糖、角叉藻聚糖。
由发生化学反应形成的胶体。
如聚丙酰胺。
3.7.1.3.5 植物细胞的固定化培养
植物细胞固定化方法
海藻酸盐固定化
卡拉胶等固定化。
琼脂糖固定化
琼脂固定化
3.7.1.3.5 植物细胞的固定化培养
植物细胞固定化生物反应器
流化床生物反应器
填充床生物反应器
膜生物反应器
植物细胞大规模培养体系的建立
（一）种子细胞株的筛选
细胞系：是以一种细胞为主，能在体外长期生存的不均一（异质性）的细胞群体。细胞间在次生产物积累能力上有很大差异。
细胞株：是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。
研究表明，单细胞克隆结合诱变和压力筛选，是获得高产目的化合物的有效途径，也是种子细
胞筛选常用的方法。
种子细胞株筛选的方法
1、一般步骤
（1）愈伤组织诱导与培养
（2）单细胞分离
（3）细胞无性系的分离
植物组织培养复习资料.doc
1.植物组织培养按培养对象分为______ 、 _______ 、________ 、 ________ 、________ 等几种类型。 2.一个己停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成耒分化的愈伤组织的现象称为 n tv 3.不同的灭菌剂其灭菌的机理一般不一样，次氯酸钙和次氯酸钠都是利用分解产生 _________ 来杀菌的；升汞是靠 ________ 来达到灭菌日的。 4.去除植物病毒的主耍方法是 _____ 和_______ 两种方法，当把二者结合起來脱毒效 果最好 5.在通过微茎尖培养脱毒时，外植体的大小应以成苗率和脱毒率综合确定，一般以 __________ mm、带 ________ 个叶原基为好。 6.White培养基________ 浓度低，适合生根培养。 7.一个已停止分裂的成熟细胞转变为_________ 状态，并形成_________ 的现象称为“ 脱分化”。 8.BA/NAA的高低决定了外植体的发育方向，比值低时促进 ________ 的生长，这时 _________ 占主导地位；比值高促进_________ 的生长，这时 _________ 占主导地位。 9.进行植物组织培养最基本的前提条件是 _____ 。 1、植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。 2、组织培养实验室必要的设备有超净工作台、高压灭菌器、空调机、夭平、显微镜、蒸饱水发生器等。 3、糖在植物组织培养中是不可缺少的，它不但作为离体组织赖以生长的碳源，而且还能维持培养菇渗透压 4、培养基灭菌一般在-108 kPa的压力下,锅内温度达121 °C ,维持20-30 min o 5、在离体叶培养中，6?BA和KT利于芽的形成:24D利于愈伤纟FI织的形成 6、在离体叶组织脱分化和再分化培养屮，茎和芽的分化主要有4个途径：方?接产生不泄芽、由愈伤组织产工不定芽、胚状体形成、形成球状体或小鳞茎等途径。 7、目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径是茎尖培养脱毒。 8、花药培养前的预处理:低温冷藏是最常用的方法。 1、植物组织培养的发展分为三个阶段：萌芽阶段、奠基阶段和快速发展和丿、'、/「用阶段。 2、培养基最常用的碳源是蔗糖,使用浓度在1%?5%常用 _3_%o 3、培养基的种类按其态相不同分为固体培养基与液体培养基，其火菌方法一般采用壷热消毒灭菌方法。 4、 pll的大小会影响琼脂的凝固能力，一般当pll大于6.0时，，培养基将会 ___________ ,低于5.0时，琼脂不能很好地凝同。 5、一般情况下，生长索/细胞分裂素的比值高，有利于根的形成和愈伤组织的形成:比值低有利于芽的形成。
1plant实验1 植物细胞组织培养
实验1 植物细胞组织培养 1.1 相关基础知识 细胞分化(cell diferentiation)指细胞后代在形态、结构和功能等发生变化的过程，归根结底是某些功能基因的开启或者关闭。一般说来，终端分化细胞已经失去分化潜能，只具有单能性；而大部分细胞只保留了部分分化潜能，称为多能性。对于动物而言，只有部分干细胞仍保留了分化的全能性。而植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力，称为植物细胞的全能性(totipotency)。 植物组织培养就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。植物组织培养最原始的意义是指愈伤组织培养，但发展至今，其范围已经扩展至植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体的离体无菌培养： 1)植株培养。指以具备完整植株形态的材料（如幼苗和较大的植株）作为外植体的无菌培养。 2)胚胎培养。指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。 3)器官培养。指以植物的根，茎，叶，花，果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段， 茎的茎尖，茎节和切段，叶的叶原基，叶片，叶柄，叶鞘和子叶，花器的花瓣，雄蕊（花药，花丝），胚珠，子房，果实等的离体无菌培养。 4)组织培养。指以分离出植物各部位的组织（如分生组织，形成层，木质部，韧皮部，表皮，皮层， 胚乳组织，薄壁组织，髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的组织 ．．．．． 培养 ．．。 5)细胞培养。指以单个的游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为 接种体的离体无菌培养。 6)原生质体培养。指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。 植物组织培养的成功与否取决于外植体的制备、无菌操作和人工培养环境。外植体的制备是能否建成离体繁殖系要过的第一关。所谓的外植体是指将外界生长的植物的细胞和组织经过一系列的无菌处理形成的有活性的无菌组织和细胞。习惯上我们经常使用化学药剂处理，例如氯化汞、次氯酸盐或者抗生素等。将从母株上取下的组织进行一定的剥离和分割，经过流水冲洗数分钟，再浸入适宜浓度的化学药剂中一段时间，最后经无菌水冲洗并适当分割即成外植体。制备外植体的原则是无菌和有活
植物组织培养名词解释
主要概念名词解释 细胞全能性：指细胞经分裂和分化后仍具有形成完整有机体的潜能或特性。 分化：指做工作使之瓦解；非特化的早期胚胎细胞获得特化细胞（如心脏、肝脏或肌肉细胞）特性的过程。 脱分化：已分化的细胞在一定因素作用下恢复细胞分裂能力,失去原有分化状态的过程。 再分化：已经脱分化的愈伤组织在一定条件下，再分化出胚状体，形成完整植株。 外植体：植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。 组织培养：植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。器官或细胞，原生质体等，通过无菌 操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或 生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养概念 （狭义）指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉 组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从 各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成 再生植物。 愈伤组织：指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。 它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组 织的活细胞。 定芽：生长在枝上有一定位置的芽称为定芽。象顶芽、腋芽、副芽
等均在一定部位生出的芽，称为定芽． 不定芽：从叶、根、或茎节间或是离体培养的愈伤组织上等通常不形成芽的部位生出的芽，则统称为不定芽。 继代培养：指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织 转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。消毒：指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。 人工种子：将组织培养产生的体细胞胚和性细胞胚包裹在能提供养分的胶囊里，再在胶囊外包上一层具有保护功能和防止机械损 伤的外膜，形成一种类似于种子的结构。 褐变：饲料在加工过程中或长期贮存于湿热环境下，其所含的氨基化合物如蛋白质、氨基酸及醛、酮等与还原糖相遇，经过一系列 反应生成褐色聚合物的现象称为褐变反应，简称褐变。 污染：指自然环境中混入了对人类或其他生物有害的物质，其数量或程度达到或超出环境承载力，从而改变环境正常状态的现象。玻璃化：将某种物质转变成玻璃样无定形体（玻璃态）的过程，是一种介于液态与固态之间的状态，在此形态中没有任何的晶体结 构存在。 体胚：由体细胞发育成的胚。又称体细胞胚。 茎尖培养：把茎尖的分生组织或包括有此分生组织的茎尖分离进行无菌培养的方法。
植物细胞培养
植物细胞培养 一、定义 ●在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振 荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。 ●植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然 产物的主要来源。 ●植物细胞培养具有以下优点： 1、提高产率 2、缩短周期 3、提高产品质量 4、易于管理，减轻劳动强度 因此主要用于生产色素、药物、食品、酶、精细化工产品等次生代谢物。 二、培养基 常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基 三、单细胞培养 1、制备方法 （1）机械法（机械磨碎、切割） （2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法） （3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织） 2、培养方法 （1）平板法（似微生物平板培养） （2）看护培养与饲养层培养法 看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。 饲养层培养：用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。 （3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。
（4）细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。 ①低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。 ②分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。 ③饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。 ④抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 3、保存 （1）继代培养（高等植物、海藻等） （2）低温（ 5℃～10℃） （3）冷冻（ -20℃或液氮） 植物细胞冷冻保存方法： 在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40℃停留2h后投入-196℃液氮罐中保存。 植物细胞冷冻保护剂组成： 7.5%二甲基亚砜（DMSO）＋0.5mol／L山梨醇＋5%甘油＋5%蔗糖 四、植物细胞培养的应用 1、生产药用植物代谢产物（紫杉醇、苷类等） 2、生产天然食品、食品添加剂（可可碱等） 3、生产杀虫剂、杀菌剂（鱼藤酮、除虫菊脂） 4、生产饲料、精细化工产品（桑叶、橡胶等） 五、植物细胞的生物反应器大规模培养 1、培养特性 （1）细胞本身特性（生长慢、易结团、易损伤、易污染） （2）培养液流变特性（黏度增高） （3）气体传递与影响（O2与CO2需平衡）
植物细胞组织培养的基本技术(总结版).
本章主要内容 ●商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 ●培养基及其配制 ●外植体的选择与培养 ●试管苗的驯化与移载 第一节商业性组织培养实验室和小工厂 的设计与主要设备 ●培养皿的清洗； ●培养基的配制、分装和高压灭菌； ●无菌操作——材料的表面灭菌和接种； ●将培养物放到培养室培养； ●试管苗的驯化、移栽和初期管理。 (一)、洗涤室(cleaning room) ●洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。 ●室内配备： ●大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。 ●备有塑料筐，用于运输培养器皿。 ●备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。 (二)、准备室(repairing room) ●完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。准备室要求明亮、通风。 ●如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与 培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。 (三)、缓冲室 ●进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。 ●应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配电板等。 (四)、无菌操作室(transfering room) ●接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏 对组织培养成功与否起重要作用。 ●配置：
●在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁 尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。 ●接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射 灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对 流。 (五)、培养室(culturing room) ●培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、 数目、及其他附属设备而定。 ●设计原则： ●充分利用空间和节省 ●能源 ●高度比培养架略高为 ●宜 ●周围墙壁要求有绝热 防火的性能。 (五)、培养室(culturing room) ●培养架大多由金属制成。 ●规格： ●一般设5层，最低一层离地高约10 cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左 右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3 m，30 W 的长1m，宽度一般为60cm。 ●培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或 立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70％-80％为好，可安装加湿器。 ●控制日光照时间可安装定时开 关钟，一般需要每天光照10-16h。也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。 (六)、驯化室 ●驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、 通风口以及必要的杀菌剂。 (七)、温室 ●应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必 要的杀菌杀虫装置及相应药剂。 二、仪器设备和器皿用具 ●常见仪器设备 ●1、超净台 ●2、无菌箱 ●3、空调机
细胞工程 第三章 植物组织与细胞培养
第 3 章植物组织与细胞培养 3.1植物组织培养与细胞培养的区别 习惯上： 由于体外培养技术最初是从培养组织发展起来的，所以在习惯上，动物学和医学上又往往用组织培养这一术语泛指细胞、组织和器官在适当的培养条件下离体生长的技术。 单细胞培养与组织和器官培养在技术上具有较大的区别 严格意义上： 组织培养是指从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长形成组织。 细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。 植物组织培养（Plant tissue culture）：是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花未成熟的果实、种子）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、胚胎、原生质等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、或者长成完整的植株的技术。 离体培养（culture in vitro) 试管培养（test tube culture) 常用术语 外植体(explant)：植物组织培养中用来进行离体培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。 愈伤组织(callus)：是由外植体组织增生的细胞产生的一团不定的疏松的排列的薄壁细胞。继代培养或传代培养：愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，营养物枯竭，水分散失，并已积累一些代谢产物，此时需要将其转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。褐变（褐化）：是由于组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生的醌类物质，这类物质是棕褐色，对外植体产生毒害作用，严重时导致死亡。 玻璃化(vitrification)：表现为试管苗叶、嫩梢是水晶透明或半透明，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层、蜡质、没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。 不定芽（adventitious buds)：从现存的芽以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的芽。 不定根（adventitious roots)：从现存的根以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的根。 3.2 发展历史 植物细胞工程是在植物组织培养的基础上发展和完善起来的，因此，植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。 植物细胞发展工程发展历史就是植物组织培养技术的历史。 发展过程大致划分为三个阶段
植物组织培养 (2)
植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用人工培养基，对离体的植物胚胎、器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养 离体生态学：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件 外植体：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞 愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织 植物组织培养的特点 1.组培技术是无菌操作技术。 2.组培材料处于完全的异养状态。 3.组培材料可以是离体状态的器官、组织、细胞或原生质体。 4.组织培养物可以形成克隆（clone，无性繁殖系），也可以进行茎芽增殖或生根 5.组培容器内的气体和环境气体可通过封口材料进行交换，相对湿度通常是几乎100％，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。 6.组培的环境温度、光照强度和时间都是人为设定的，其参数可调 植物组织培养的研究类型 组织培养 器官培养 胚胎培养 细胞培养 原生质体培养 植物组织培养的研究任务 研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁植物的大量快速繁殖方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗传和变异，种质资源的离体保存机理和方法等 德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann于1838-1839年提出的细胞学说 德国植物学家Haberlandt于1902年提出了植物细胞具有全能性 李继侗和沈同1933年成功培养了银杏的胚。 1952年，Morel和Martin提出了植物脱毒（virus free）技术 Guha和Maheshwari等——花药培养 Cocking等-原生质体培养
《植物组织培养》试题及答案教学教材
试卷编号NO： 高等函授教育《植物组织培养》试题 学号：姓名： 一名词解释：（10*2分=20分） 1、植物细胞组织培养 2、细胞全能性 3、脱分化 4、外植体 5、试管苗驯化 6、间接不定芽发生 7、双极性 8、微体嫁接 9、人工种子 10、体细胞无性系变异 二填空：（30*1分=30分） 1、目前植物组织培养应用最广泛的方面是 和。 2、由脱分化的细胞再分化出完整植株有两种途径，一种叫做，另一种叫做。 3、培养用具的常用灭菌方法有、、 。 4、某些生长调节物质及抗生素、酶类物质遇热不稳定，对其灭菌时不能进行，而要进行。 5、一般来说，黑暗条件下有利于的增殖，而往往需要一定的光照。 6、植物离体授粉技术通常包括、、 三个方面。 7、一般液体培养的继代时间较短，继代一次；而固体培
养继代时间可以长些，继代一次。 8、外植体器官发生的三种途径包括、、。 9、从再生植株倍性来看，小孢子培养通常产生植株，胚 培养通常产生植株，通常产生三倍体植株。 10、脱毒苗鉴定与检测的主要方法有、、 、。 11、在生长素中，对于许多作物花粉的启动、分裂、形成愈伤组织和胚状体起着决定性作用，但是对却有抑制作用。 12、用平板培养法培养单细胞或原生质体时，常用 来衡量细胞培养效果。 13、用药剂处理是诱导染色体加倍的传统方法。 三计算题（1*10分=10分） 某培养基的配方是MS＋BA 2.0mg/L＋NAA 0.5mg/L＋2.5%蔗糖＋0.7％琼脂粉。MS母液的浓度分别是：大量元素２０倍，微量元素500倍，铁盐100倍，有机物５０倍；BA母液浓度1.0 mg/ml ，NAA母液浓度0.1mg/ml。要配制400ml 该培养基，需要吸取各种母液各多少ml？分别称取蔗糖、琼脂粉各多少克？（要求写出计算步骤）四简答题（5*5分=25分） 1、造成组织培养过程中发生污染的原因有哪些？如何有效控制污染？ 2、简述外植体消毒的一般步骤。
植物组织培养实验报告
如对你有帮助，请购买下载打赏，谢谢！ 院(系、部) 化学与生物工程学院专业生物技术（师范）年级13级学号姓名组别第二组课程名称植物细胞工程学实验日期2016.3-6 指导老师实验名称植物组织培养综合实验 一、实验目的 1.熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法 2.学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法； 3.掌握超净工作台上的接种方法与注意事项，了解接种室的灭菌方法； 4.了解组织培养的基本程序； 5.掌握接种的方法和材料的培养过程； 6.掌握无菌操作技术，包括外植体除菌和接种技术； 7.观察外植体的生长状况、染菌状况，剔除染菌外植体； 8.了解MS培养基和1/2MS培养基的区别 二、实验原理 1.植物细胞的全能性 一切植物都由细胞构成，细胞是构成植物体的基本结构与功能单位。植物细胞含有全套遗传信息，具有形成完整植物的潜能。 2.植物细胞表现出全能性的条件 1.离体状态； 2.有一定的营养物质，激素和其他外界条件（无菌、温度、pH）； 3.选择性能优良、细胞全能性表达充分的基因型 3.无菌条件 把植物的组织、器官等，使其在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖。用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组培中外植体都死带菌的，在接种前必须进行表面消毒，这时取得培养成功的最基本和重要的前体。组织培养的主要过程都是在无菌条件下进行的，所以所有的器材、植物体、接种室都应是无菌的。 4.脱分化与愈伤组织 已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化形态，转变为具有分生能力的胚细胞的过程称为脱分化。脱分化所用的化学物质与MS培养基的区别是需要激素诱导。所以脱分化培养需在MS培养基上添加激素进行愈伤组织诱导。 5.培养基 植物组织培养常用的培养基为MS培养基。常用的凝固剂是琼脂,它的主要作用是使液体培养基凝固，琼脂本身并不提供任何营养，它只是一种高分予的碳水物从海藻中提取出来，仅溶解于热水，成为溶胶，冷却后(40℃以下)即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量一般在4—10克／升之间。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力，存放时间过久，琼脂变褐，也会逐失去凝固能力。MS培养基属于富盐平衡培养基，特点是：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，因而在培养的过程中可维持较好的稳定性；营养丰富，在一般培养中无须额外加入复杂的有机成分；微量元素种类全，浓度高。这类培养基是目前使用最广泛的培养基。 6.生长调节物质 包括天然植物激素额人工激素类似物。植物激素是一类植物自身合成、同时对其生长发育具有重要调节作用的有机化合物。生长调节物质对于离题培养中的细胞分裂分
植物组织培养
第一章植物的快速繁殖技术 一、快速繁殖的概念 植物一般通过有性繁殖和无性繁殖两种方式繁衍后代。很多花卉、果树林木和一部分粮食作物，由于它们的高度杂合性，常通过扦插、埋条、压条、嫁接或种植特殊的营养器官等方法进行营养繁殖，从而得到和亲本遗传性一致的后代；有些种子休眠期特别长的作物，用营养繁殖可以加快繁殖的速度；某些多年生作物用种子繁殖时要经过一个很长的幼年期，如用成年植物材料进行营养繁殖，常可大大缩短生长期。这些都是无性的营养繁殖。用组织培养繁殖植物的技术是一种特殊的营养繁殖方式，现在一般称之为“快速繁殖技术”（rapid propagation）或“微繁殖技术”（mic-ropropagation）。它是在无菌条件下，利用植物体的一部分，包括细胞、组织或器官，在人工控制的营养和环境条件下繁殖植物的方法。这可以看作是常规营养繁殖方式的一种扩展和延伸，它不但保持了常规方法的特点，而且还具有以下几个明显的优点：（1）使用的植物材料极少，往往只要少量的茎尖、叶片、剪切段或其他器官就能在试管中建立起反复增殖的系统。这样就可以节省常规营养繁殖时所需要的大量母本植株和因栽培和保持这些母株所需的土地和人力，对于珍贵稀有的植物材料还可能做到不毁坏原有的植株。(2)由于每个外植体产生的芽或胚状体常多于常规繁殖方法，每一个繁殖周期又比常规繁殖短得多，一般只要1一2个月，加上可以不受季节和气候条件的影响进行周年生产，所以繁殖速度往往比常规方法要高得多，繁殖的数量在一年中常可达几万、几十万甚至上百万倍。另外，由于试管中芽、植株或胚状体的小型化和利用多层的集约化培养架，可以在有限的空间生产大量的植株。在实际应用中，某些技术较完善的作物，每平方米培养面积一年约可生产一万到几万株，一个熟练工人一年约可生产数试管苗。如萱草，从30个外植体开始，在1.8平方米的培养面积上，8个月可以生产二万棵试管苗。（3）由于快速繁殖是在无菌的容器中进行的，在繁殖过程中不受病虫的侵害。如果和去病源技术相结合，可以大量生产高质、均一的无病苗木，而这一点用常规方法是很难做到的。这样的无菌无病的试管苗在远距离的运输中和国际交流中都是极安全和方便的，既可以防止病害的传播又可以免去复杂的检疫手续。（4）对于某些植物，组织培养产生的植株的表现型和从种子或常规营养繁殖方法得到的植株会有所不同，其性状要优于原植株。如波士顿蕨的试管植株由于不表现强烈的顶端优势而能形成更多的分枝，使植株形态更美观。非洲紫罗兰的试管植株呈莲座状，而用常规叶插方法得到的植株，叶柄长，整个植株更为直立，园艺性状也较差。 快速繁殖技术除了有上述明显的优点之外，和常规的营养繁殖方法相比也有其固有的一些特点，这方面常常容易被人们忽视而造成工作的失败或资金的浪费。首先，和常规方法相比较，要建立一个比较完整的组织培养实验室，需要相当的投资。在发达国家目前约要几万美元，在我国如建立一个包括实验室、培养室和有一定温室面积的系统也要投资几万、十几万以至几十万元，而且如完全使用电能调控光照和温度的话，运转费用也是相当可观的（我国大部分地区夏天需要降温，冬天需要升温，潮湿地区又需去温，以及培养的光照，都要消耗大量的电）。其次，此项工作对人员的要求比较高，除了要求能熟练和严格地进行无菌操作之外，对培养物的生长、分化和它的控制方法要有所了解。在探索一种新的植物的快速繁殖时需要进行大量的系统研究，这就要求有一定的理论知识和实践经验。另外，由于这种方法有可能在短时期内从极少量的外植体产生大量的新植株，所以在材料的选择、工艺流程稳定性的控制、周年生产中的各个环节的安排和衔接上要作精心的组织，否则常可能由于某一环节的失误而导致整个工作的失败。如由于选择了不良的原始材料（不良的基因型、未发现的变异体等），或在培养过程中由于培养方法不当，或因其他原因产生的遗传变异未能及早发现等，而导致最后产生大量的具有严重缺陷的植株。这一点在多年生木本植物中的后果 些性状要经过几年以至几十年的时间才表现出来。在某些培养系统中还会出现对于生产不利的遗传变异，如试管苗中残留的细胞分裂素效应常使分枝过多而影响某些作物的经济性状。 二、快速繁殖技术发展史简略
细胞工程知识点填空(附答案)
专题2 细胞工程 （一）植物细胞工程 1.理论基础（原理）： 全能性表达的难易程度： 2.植物组织培养技术 （1）过程：离体的植物器官、组织或细胞―→愈伤组织―→试管苗―→植物体 （2）用途：。（3）地位：是培育、培育植物新品种的最后一道工序。 3.植物体细胞杂交技术 （1）过程： （2）诱导融合的方法：物理法包括等。化学法一般是用 作为诱导剂。（3）意义： （二）动物细胞工程 1. 动物细胞培养 （1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的，将它分散成，然后放在适宜的中，让这些细胞。 （2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用 处理分散成→制成→转入培养瓶中进行培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就，称为。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面时，细胞就会，这种现象称为。 （4）动物细胞培养需要满足以下条件 ①：培养液应进行处理。通常还要在培养液中添加一 定量的，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防 止。 ②：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入 等天然成分。 ③：适宜温度：哺乳动物多是；pH：。 ④：95%＋5%。O2是所必需的，CO2的主要作用 是。 （5）动物细胞培养技术的应用： 2.动物体细胞核移植技术和克隆动物 （1）哺乳动物核移植可以分为核移植（比较容易）和核移植（比较难）。
（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞； 卵(母)细胞。 （3）体细胞核移植的大致过程是：（下图） （4）体细胞核移植技术的应用： ①② ③④ ⑤ （5）体细胞核移植技术存在的问题： 克隆动物存在着问题、表现出缺陷等。 3.动物细胞融合 （1）动物细胞融合也称，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来细胞遗传信息的单核细胞，称为。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有等。 （3）动物细胞融合的意义：克服了，成为研究 的重要手段。 （4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较： 比较项目细胞融合的原理细胞融合的方法诱导手段用法 植物体细 胞杂交 细胞膜的流动性去除细胞壁后诱 导原生质体融合 离心、电刺激、 振动，聚乙二醇 等试剂诱导 克服了远缘杂交 的不亲和性，获得 杂种植株 动物细胞 融合 细胞膜的流动性使细胞分散后诱 导细胞融合 除应用植物细胞 杂交手段外，再加 灭活的病毒诱导 制备单克隆抗体 的技术之一 4.单克隆抗体 （1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种。从血清中分离出的抗体 。 （2）单克隆抗体的制备过程： 注入小鼠 细胞融合 分离 抗原注入小鼠体内 B淋巴细胞骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 细胞培养 选择培养细胞 培养基 体内培养体外培养 从腹水提取从培养液提取 单克隆抗体 核移植 胚胎移植
植物组织培养习题及答案
0．填空 1.根据培养的材料,植物组织培养分:愈伤组织培养、(器官培养、细胞格养、原生质体培养(悬浮培养 2.植物组织培养的发展分为三个阶段:萌芽阶段、奠基阶段，快速发展和快速发展和应用阶段 3，1902年,Haberlandt提出了植物细胞“全能性”学说,1934年, White出版了《植物组织培养手册》培养等类型从而使植物组织培养为一门新兴学科。 一．填空、 1，组织培养实验室必要的设备有超净工作台、高压灭菌器、调机、_天平、显微镜、_蒸馏水，发生器，酸度计 养基成分主要包括①无机营养成分、②有机营养成分)、_③植物生长调节物质、_④碳水化合物、⑤其它物质 3、培养基最常用的碳源是_蔗糖,使用浓度在1%-5%常用3% 4、糖在植物组织培养中是不可缺少的,它不但作为离体组织棱以生长的碳源而且还能维持培养基渗透压 5、在固体培养时琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物般用量6-10g/L之间 6.驯化的目的:在于于提高试管苗对外界环境条件的适应性,提高其光合作用的能力,促使试健壮,提高苗的移裁成活 7、生长素/细胞分裂素的高低决定着外植体的发育方向,其比值高:有利于根的形成和愈伤组织的形成:低:有利于芽的形成 8、培养基灭菌一般在108kPa的压力下,锅内温度达_121℃C,维持_20-30min、 9.选择外植体时应选择①选择优良的种质、②选健壮的植株、③选最适的时期和④选取适宜的大小。 10、诱导胚状体比诱导芽的优点:(1)数量多、(2)速度快、_(3)结构完整 11、试管苗的生态环境:高温且恒温、高湿、弱光、无菌 12、培养基中加入活性炭的目的:利用其吸附能力,减少一些有害物质的影响大 13、筛选培养基的方法:单因子试验法、多因子试验法、广谱实验法 14、植物培养技术:灭菌、接种种、培养、驯化四个环节 15、试管苗的驯化注意:基质、温、光、水、肥、气的综合管理 二．填空 1.绝大多数培养植物再生植株时都先经过愈伤组织阶段 2.愈伤伤组织形成大致经历诱导期、分裂期一和分化期三个时期 3、愈用植物生长调节物质时要注意:种类和浓度生长素和细胞分裂素的比值4.愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式 5.组织培养细胞再分化包括四个水平:细胞水平的再分化、组织水平的再分化、器官水平的再分化(器宣发生)和植株水平的分化 三．填空: 1.植物器官培养主要是指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。 2、茎尖培养根据培养目的和取材大小分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。前者主要是对茎尖长度不超过,最小只有几十微米的茎尖进行培养,目的是获得无病毒植株:后者是对几毫米乃至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养,目的是离体快繁 3.不定芽产生的途径一是从外植体上直接产生二是从由外植体诱导产生的愈伤组织上产生 4.离体叶培养是指包括叶原基、叶栖、叶鞘、叶片、子吐等叶组织的无菌培养 5.在离体叶培养中,6-BA和KT利于芽的形成;24D利于愈伤组织的形成 四．填空 1、胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养 2、离体胚的培养分为二种类型:。成熟胚培养和_幼胚培养六
高中生物技术与生物工程第二章细胞工程第2节植物组织培养学案
第二节植物组织培养 1．理解植物细胞全能性的含义。 2．简述植物组织培养的过程。(重点) 3．说出植物组织培养技术的应用。(难点) 1．植物细胞的全能性 (1)含义 植物体的每一个活细胞都具有形成完整植物体的遗传潜能。 (2)物质基础 植物体的全部体细胞都具有发育为完整个体所必需的全套遗传物质。 (3)现实表现 ①在植物体内，细胞分化成为不同的组织和器官。 ②原因：基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。 (4)体现全能性的必需条件 ①脱离原来组织器官的束缚，成为游离状态。 ②一定的营养条件和植物激素的诱导。 2．植物组织培养技术 (1)植物组织培养的概念 ①培养对象：外植体(即离体的植物器官、组织或细胞)。 ②条件：a.无菌，b.含有营养物质的培养基，c.适宜的光照、温度、湿度等环境条件。 ③结果：形成完整植株。 ④核心：诱导脱分化和再分化。 (2)原理 植物细胞的全能性。 (3)过程
探讨1：植物的种子能发育成完整的植株，是否体现了细胞的全能性？为什么？ 提示：没有，因为种子中的胚已完成了早期发育，相当于新植物体的幼体，发育成完整植株的过程，相当于植物的长大。 探讨2：美国科学家将分离得到的成熟胡萝卜根的韧皮部细胞进行培养，由单个细胞发 育成了完整植株，培养过程如下图所示。 此实验说明了什么问题？ 提示：分化的植物细胞仍具有全能性。 探讨3：在菊花的组织培养操作完成了3～4天后，观察同一温室中的外植体，发现有的 瓶内外植体正常生长，有的瓶内外植体死亡，你认为外植体死亡的原因可能有哪些？ 提示：接种时培养基灭菌不彻底；接种工具灼烧后未待冷却就接种外植体；培养过程中 保持温度、pH的适宜，但没有及时调整各种营养物质和激素的比例。 [思维升华] 1．植物细胞全能性表达所需条件
植物组织培养全过程
蝴蝶兰植物组织培养全过程 一实验目的： 1 掌握植物细胞组织培养的原理和方法； 2了解植物组织培养的方法； 3 学习植物组织培养的原理； 4 了解不同浓度BA对蝴蝶兰生根的影响； 5了解炼苗的作用； 6掌握训化的方法步骤； 7观察蝴蝶兰组织培养到种植的全过程，并注意其中出现的问题。 二实验原理： 蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属植物,因花型奇特、色彩艳丽、花期长久而享有“洋兰皇后”的美誉。蝴蝶兰原产于缅甸、菲律宾、台湾、马来西亚、印度尼西亚等热带亚洲地区,具有极高的观赏和经济价值,是国际上最具商业价值的四大观赏热带兰之一。蝴蝶兰属单茎性气生兰,再生能力弱,很难进行分株繁殖,且种子无胚乳,自然条件下难以萌发,增殖系数低,难以满足日益增长的市场需求。应用植物组织培养技术进行蝴蝶兰快速繁殖可以缩短繁育周期,获得大量成株,并可以保持优良性状,维护种质资源,是蝴蝶兰快速繁殖的有效途径。在以蝴蝶兰根尖、茎尖、叶片和花梗芽为外植体诱导原球茎时,由于根尖的诱导率低,摘取茎尖会损失母株等原因,因此在蝴蝶兰组织培养中根和茎都不是诱导原球茎的理想材料。而蝴蝶兰叶片和花梗芽作为外植体诱导圆球茎时,其诱导率较高、对母株伤害不大,是较为理想的外植体材料。 三材料与用具： 蝴蝶兰的茎尖、1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L花梗腋芽诱导培养基、1/ 2 MS + BA3. 5 mg/L + KT1. 0 mg/L + NAA0. 5 mg/L + 椰乳10 %增殖培养基、母液、量筒、烧杯、玻璃棒、移液管、无菌水、高压灭菌器、容量瓶、pH试纸、75%酒精、2%次氯酸钠、镊子、解剖刀、超净工作台、95%酒精、穴盘等。 四方法与步骤 （1）母液的配制 根据需要的母液量配制母液，配好后要贴好标签，以防弄错。标签上要注明是什么母液和母液的稀释倍数。将配好的母液进行储藏，要用的时候可以方便使用。 配制培养液时应注意：
植物组织培养技术所有名词解释
植物组织培养复习材料 一、名词解释。 1、植物组织培养(plant tissue culture)：植物的离体器官、组织或细胞在人工制备的培养基上进行无菌培养，并在人工控制的环境条件下，使其发育成完整植株的科学技术 2、脱分化（dedifferentiation）：指失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞即愈伤组织的现象。 3、再分化（redifferentiation）：愈伤组织形成不定芽或不定根或胚状体。 4、外植体(explant)：植物组织培养过程中从活体植株上切去下来的用于离体培养的一切材料。（如器官、组织、细胞、原生质体、种子等） 5、愈伤组织(callus)：原本指植物在受伤后于其伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组培中，则指人工培养基上由外植体形成的一团无序生长的薄壁细胞。 6、器官发生：胚胎时期由胚层器官原基发育成器官的过程。包括细胞分化和器官形成。 7、胚状体发生：在植物细胞、组织或器官体外培养过程中，由一个或一些体细胞经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。可进一步发育成植株。 8、细胞全能性（cell totipotency）：指植物的每一个细胞都携带有一完整的基因组，并具有发育成完整植株的潜在能力。 9、细胞分化：一个尚未特化的细胞发育出特征性结构和功能的过程。 10、极性：细胞（也可指器官或植株）内的一端与另一端在形态结构和生理生化上的差异。 11、试管苗：通过组织培养产生的植株。 12、看护培养：是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。这块愈伤组织被称为看护组织。 13、固相化培养：将细胞或原生质体固着在琼脂糖、藻（月元）酸盐或多聚赖氨酸中，然后将他们放入液体培养基中震荡培养。这种培养方法既利用了振荡培养室营养物质和气体易于交换的优点，有利用了固相化使细胞免受振荡时剪切力的作用。 14、悬浮细胞培养：将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增值的技术。适用于大规模的培养，使细胞工程的基本平台。 15、植板效率=（每个平板中新形成的细胞团数/每个平板中接种的细胞数）*100 16、实验室的组成及功能：1.基本实验室（1）准备室（2）接种室（3）培养室 2.辅助实验室（1）细胞学实验室（2）摄影室及暗室（3）生化分析室（无菌操作室、化学实验室、培养室、细胞学观察室、暗室）。 17、植物种质：物亲代通过生殖细胞或体细胞传递给后代的遗传物质，植物种质资源即为携带各种不同遗传物质的植物总称。 18、玻璃化现象：指试管苗的一种生长失调症状，当植物材料进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会出现半透明状和水渍状，这种现象称为玻璃化。其苗称为玻璃化苗。 19、基本培养基：包括大量元素和微量元素（无机盐类）、维生素和氨基酸，还有糖和水等。 20、完全培养基：在基本培养基基础上，根据各种不同试验要求，添加各种植物生长调节物质以及其他复杂有机附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物。21、外植体褐变：在组织培养过程中，外植体向培养基中释放褐色的物质（醌类）致使培养 １
细胞工程知识点
细胞工程知识点 植物细胞工程 1.理论基础（原理）： 全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞 2.植物组织培养技术 （1）过程：离体的植物器官、组织或细胞 ―→愈伤组织 ―→胚状体 ―→植物体 （2）用途：微型繁殖、作物脱毒（材料： ）、制造人工种子（培养至 ）、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产（培养至 ）。 （3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。 3.植物体细胞杂交技术 （1）过程： 注：杂种细胞的染色体数等于两个杂交细胞的 。 （2）原理： （3）诱导融合的方法：物理法包括 等。 化学法一般是用 作为诱导剂。 （4）意义： 。 动物细胞工程
1. 动物细胞培养 （1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的，将它分散成，然后放在适宜的中，让这些细胞。 （2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（的器官或组织）→剪碎→用处理分散成单个细胞→制成→转入培养瓶中进行 →贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续。原代培养（10代以内）：遗传物质 传代培养（10代以后）：遗传物质 （3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就，称为（只有一层细胞）。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面时，细胞就 会，这种现象称为。 （4）动物细胞培养需要满足以下条件 ①无菌、无毒的环境：培养液应进行处理。通常还要在培养液中添加一定量 的，以防培养过程中的污染。此外，应， 防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。 ②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、、无机盐、等。通常 需加入等天然成分。 ③温度：适宜温度：哺乳动物多是；pH：。 ④气体环境：95% ＋5% 。O2是所必需的，CO2的主要作用 是。 （5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、、、培养 医学研究的各种细胞。 （
《植物组织培养》试题及答案
试卷编号NO: 高等函授教育《植物组织培养》试题 学号: 姓名: 一名词解释:(10*2分=20分) 1、植物细胞组织培养 2、细胞全能性 3、脱分化 4、外植体 5、试管苗驯化 6、间接不定芽发生 7、双极性 8、微体嫁接 9、人工种子 10、体细胞无性系变异 二填空:(30*1分=30分) 1、目前植物组织培养应用最广泛的方面就是 与。 2、由脱分化的细胞再分化出完整植株有两种途径,一种叫做 ,另一种叫做。 3、培养用具的常用灭菌方法有、、 。 4、某些生长调节物质及抗生素、酶类物质遇热不稳定,对其灭菌时不能进行 ,而要进行。 5、一般来说,黑暗条件下有利于的增殖,而往往需要一定的光照。 6、植物离体授粉技术通常包括、、 三个方面。 7、一般液体培养的继代时间较短, 继代一次;而固体培养继代时间可以长些, 继代一次。 8、外植体器官发生的三种途径包括、、。 9、从再生植株倍性来瞧,小孢子培养通常产生植株,胚培养通常产生植株, 通常产生三倍体植株。 10、脱毒苗鉴定与检测的主要方法有、、 、。 11、在生长素中, 对于许多作物花粉的启动、分裂、形成愈伤组织与胚状体起着决定性作用,但就是对却有抑制作用。 12、用平板培养法培养单细胞或原生质体时,常用 来衡量细胞培养效果。 13、用药剂处理就是诱导染色体加倍的传统方法。 三计算题(1*10分=10分) 某培养基的配方就是MS＋BA 2、0mg/L＋NAA 0、5mg/L＋2、5%蔗糖＋0、7％琼脂粉。MS母液的浓度分别就是:大量元素２０倍,微量元素500倍,铁盐100倍,有机物５０倍;BA母液浓度1、0 mg/ml ,NAA母液浓度0、1mg/ml。要配制400ml该培养基,需要吸取各种母液各多少ml？分别称取蔗糖、琼脂粉各多少克？(要求写出计算步骤) 四简答题(5*5分=25分) 1、造成组织培养过程中发生污染的原因有哪些？如何有效控制污染？ 2、简述外植体消毒的一般步骤。 3、胚培养在科学研究及生产实践中有哪些应用？ 4、结合花粉培养,简述瞧护培养法。