细胞工程 第三章 植物组织与细胞培养

第 3 章植物组织与细胞培养3.1植物组织培养与细胞培养的区别习惯上：由于体外培养技术最初是从培养组织发展起来的，所以在习惯上，动物学和医学上又往往用组织培养这一术语泛指细胞、组织和器官在适当的培养条件下离体生长的技术。

单细胞培养与组织和器官培养在技术上具有较大的区别严格意义上：组织培养是指从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长形成组织。

细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。

植物组织培养（Plant tissue culture）：是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花未成熟的果实、种子）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、胚胎、原生质等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、或者长成完整的植株的技术。

离体培养（culture in vitro)试管培养（test tube culture)常用术语外植体(explant)：植物组织培养中用来进行离体培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。

愈伤组织(callus)：是由外植体组织增生的细胞产生的一团不定的疏松的排列的薄壁细胞。

继代培养或传代培养：愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，营养物枯竭，水分散失，并已积累一些代谢产物，此时需要将其转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。

褐变（褐化）：是由于组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生的醌类物质，这类物质是棕褐色，对外植体产生毒害作用，严重时导致死亡。

玻璃化(vitrification)：表现为试管苗叶、嫩梢是水晶透明或半透明，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层、蜡质、没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。

不定芽（adventitious buds)：从现存的芽以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的芽。

不定根（adventitious roots)：从现存的根以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的根。

3.2 发展历史植物细胞工程是在植物组织培养的基础上发展和完善起来的，因此，植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。

植物细胞发展工程发展历史就是植物组织培养技术的历史。

发展过程大致划分为三个阶段3.2.1 探索阶段细胞学说的产生和细胞全能性的提出为组织培养技术的产生奠定了理论基础。

细胞学说(cell theory)19世纪30，Schleiden和Schwann创立的组织培养研究的思想基础细胞全能性1902年德国植物学家哈泊兰德（Haberlanclt）在细胞学说的基础上提出的。

植物细胞具有全能性，即植物活细胞具有能够发育成为完整植株的潜在能力。

而且进行了相关实验，但失败了！！！原因：一是取材不当二是培养基中不含诱导激素由此，被称为——植物组织培养之父3.2.2培养技术建立阶段20世纪30年代至50年代末期，植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要技术模式。

培养基模式激素调控模式培养基模式White 于1934年，使番茄根的离体培养实验首次成功。

White 于1937年，发现B族维生素在离体培养中的作用，产生了由无机盐与有机成分组成的White培养基。

建立植物根的离体培养技术。

法国科学家高特里特（R.J.Gautheret）1939年在添加B族维生素和IAA的培养基上连续培养胡罗卜根的形成层获得成功。

诺比考特（Nobecourt)于1938年以培养胡萝卜根为外植体，在固体培养基上诱导形成了愈伤组织。

White、Gautheret和Nobecourt植物组织培养的奠基人他们的贡献建立了植物组织培养的综合培养基，它包括无机盐、有机物和生长激素。

发现了B族维生素在组织培养中的作用，基本建立了植物组织培养技术。

现在所用的培养基和培养方法原则上都是这三位科学家所建立的方法和培养基的演变。

激素调控模式1957年，斯科克(Skoog)和米勒(Miller)提出了有关植物激素控制器官形成的概念，建立了细胞分裂素/生长素比率控制植物组织的形态发生和器官分化的激素调控模式。

激素调控模式——细胞分裂素/生长素比植高时----------产生芽比植低时----------产生根比值平衡时----------维持愈伤组织生长而不分化3.2.3 应用研究阶段1952年法国G.Morel将感染病毒的大丽花茎尖切离培养，获得去病毒植株。

1960年G.Morel采用兰属(Cymbidium)的茎尖培养，实现了去病毒和快速繁殖两个目的。

1974年Greshoff从葡萄花药培养中，得到单倍体愈伤组织。

1975年Rosati从草莓花药培养中，获得小孢子发育的植株。

3.2.4 我国植物细胞工程的研究进展早在20世纪30年代，我国两位已故的科学家罗宋洛和李继侗就已成为远东植物培养的先驱者。

罗宋洛主要研究离体根尖培养的适宜条件，李继侗发现了银杏胚乳提取物对离体胚发育的促进作用。

20世纪80年代，我国研究重点明显倾向无性系的快速繁殖，许多已进入不同规模的应用阶段，如甘蔗、草莓、葡萄、菠萝、香蕉、各色观赏植物等等。

3.3 细胞全能性与形态发生植物组织培养不仅能使处于分生状态的细胞继续保持分生能力；同时也可以使永久分化的细胞恢复分裂能力，如同生殖细胞或合子胚一样，其原因何在？概括地讲，植物细胞工程的核心就是在离体培养条件下细胞全能性表达的调控。

细胞工程的所有方法都是围绕这一核心产生和发展起来的。

因此，可以说细胞全能性理论是细胞工程的基本理论基础，而与之相关的细胞分化、再分化及其调控机理则使人们更深刻地认识了细胞全能性的本质，并将其发展成为现代生物技术的重要领域之一3.3 细胞全能性与形态发生3.3.1 细胞全能性及其表达3.3.1.1 细胞全能性概述概念细胞全能性:一个生活细胞所具有的发育成为完整生物个体的潜在能力。

（全套的基因组）动物：有限发育模式细胞核全能性植物：无限发育模式细胞全能性生活细胞要表达全能性必须首先恢复到分生状态或胚性细胞状态，这种恢复能力在不同类型细胞间具有相当大的差异。

3类植物细胞:周期细胞：茎尖、根尖和形成层细胞终端分化细胞：筛管、导管、保卫细胞G0期细胞：表皮细胞、各种薄壁细胞影响全能性表达的因素细胞分化的程度:细胞分化程度越高，其向分生状态恢复的可能性越小，表现细胞全能性的能力降低或丧失。

这种能力降低或丧失的程度与分化细胞的的类型和其所处的位置有关。

生理脱离效应:在生物个体中，细胞的全能性不能表达，而当细胞或组织脱离母体以后，在适宜的条件下将有利于进行一些特殊的发育方式，称之为生理脱离效应显然组织或细胞从完整的有机体上脱离下来，以脱离母体的影响，对于细胞全能性的表达是十分重要的。

人工条件的调控（激素的调控）调控过程简单地归纳起来就是细胞的脱分化和再分化。

细胞或组织的离体培养技术就是脱分化和再分化的控制过程。

温度、光照、湿度、pH值和激素等细胞和组织与母体分离和激素的调控是细胞全能性的表达的基本前提。

3.3.1.2 培养条件下的细胞脱分化离体培养条件下，细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化而实现的。

在大多数的情况下脱分化是细胞全能性表达的前提再分化是细胞全能性表达的最终体现者脱分化（dedifferentiation)脱分化的概念:培养条件下，使一个已分化并且具有一定功能的植物细胞失去原有的状态和功能，恢复到无分化状态或分生细胞状态的过程。

脱分化的能力：在离体培养条件下，植物不同组织的细胞的脱分化能力是不同的。

脱分化的时间：观点一是：在离体培养条件下，一个分化细胞转化为分生状态，进入细胞分裂即为脱分化。

观点二是：细胞脱分化发生在细胞分裂之前，细胞分裂只是细胞脱分化的结果，而不是脱分化的过程。

总之，静止细胞启动分裂都是分化细胞成功脱分化的重要标志。

脱分化的过程：启动阶段：细胞质增生，并向中伸出细胞质丝液泡蛋白体出现演变阶段：细胞核开始向中央移动，质体演变为原质体脱分化终结期：恢复到分生状态，细胞分裂即将开始脱分化调控机理：期细胞回复到分裂周期的调控过程。

细胞脱分化调控的实质是G植物激素是离体培养过程中所必须的条件，因此，与植物激素相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。

植物细胞感受生长素的信号是通过生长素受体和生长素分子相结合，使生长素受体被激活，进而引起一系列连锁信号的传导反应，最终导致生长素诱导的基因表达细胞脱分化与愈伤组织的形成：大多数情况下，细胞脱分化后进入细胞分裂，形成愈伤组织。

有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞，进而形成体细胞胚。

3.3.1.3 培养条件下的细胞再分化再分化（redifferentiation)的概念在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长才能再生为个体。

因此，通常把离体培养下的这一过程称为再分化。

再分化的过程事实上是基因选择性表达与修饰的人工调控过程激素在细胞分化中的调控作用有实验证明：细胞分裂素可能增加了细胞对生长素的敏感性的或者能阻断生长素的反馈信息。

即细胞分裂素在细胞分化中的作用是通过增强生长素的作用而实现的。

在离体培养条件下，由于外植体细胞所处的生理状态的不同，其内源激素水平也存在较大的差异，试图寻找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很困难的。

3.3.2 植物培养细胞的形态发生生物个体的形成是通过形态发生（morphogenesis)实现的，建立在离体培养基础之上的形态发生称之为体细胞形态发生（somatic morphogenesis)。

与个体水平上的形态发生不同，培养条件下的形态发生不是起源于合子，而是起源于培养细胞。

在培养条件下，植物细胞经过再分化形成完整个体可以通过两种途径：3.3.2 植物培养细胞的形态发生植物器官发生organogenesis体细胞胚发生somatic embryogenesis3.3.2.1 植物离体器官发生 (organogenesis)（一）概念是指在离体培养条件下，组织或细胞团（愈伤组织）经过诱导分化形成不定芽（adventitious shoots)、不定根（adventitious roots)等器官的过程自然条件下：受植物繁殖体自身调节控制离体条件下：人工辅助调节完成的离体培养条件下，器官发生的难易取决于研究对象的培养技术成熟程度及其调控机制基础研究的深度。

（二）离体培养中器官发生的方式直接器官发生©典型的直接器官发生©非典型的直接器官发生间接器官发生直接器官发生在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织阶段即可形成器官原基而直接发育成器官的途径。

这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体快繁中具有重要的实践意义。