WB灰度值测定

Image J测到了WB条带灰度值关于用Image J量化westernblot条带灰度值，在网上一直盛传着两种操作方法，然鹅～小伙伴们却一直不确定到底哪种才是正确的测量灰度方法，甚至将灰度与光密度弄混淆。

今天咱们一起就这个机会学习下，请先看看你是用以下那种方法测量灰度值？以下是两种方法的具体操作。

方法一:1、打开Image J软件→左上角file→Open 选择自己的条带图片(事先把条带摆正)2、把图片转化成灰度图片：Image→type→8-bit
3、第一个矩形工具→选上所有条带
4、analyze→Gels→select first lane→Gels→plot lanes（在这第四步也可以分开选取，如：框选第一个条带→analyze→Gels→select firstlane→将第一个框拖移到余下条带→Gels→select nextlane）
5、选中直线工具，将开口波峰关闭
6、选中魔棒工具（正数第七个），点击波峰，就得出所有area值。

方法二
1、打开Image J软件→左上角file→Open 选择自己的条带图片(事先条带弄正)
2、把图片转化成灰度图片：Image→type→8-bit
3、扣除背景：Process→Subtract Background→50pixels 并勾选Light Background
5、设定参数：Analyze→set measurement→勾选Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density
6、Analyze→set scale→unit of length选项里改为pixels，确定
6、图像分割。

Edit→Invert→选中椭圆圈（手残党首选）/不规则圆圈（心灵手巧党义无反顾），手动圈上单个条带
7、Analyze→Measurement即得到Intden,重复6、7步就得到所有Intden值
小伙伴们，你们是哪种方法呢？首先先把结论说出来，其实两者得出的area和Intden严格来说都不是灰度值，前者是面积而后者是光密度值，但用来量化WB条带都是OK的。

Image J这个软件在将western blot条带量化时存在两种参数：灰度与光密度（假，暂且这么称呼，原因下文再说），这两者在理解使用Image J量化WB条带十分重要，请务必仔细看以下几个概念。

1、灰度(gray)：是指图像中各种颜色的深浅程度, 它以整数值表示, 一般的图像分析软件将图像每个像素点的颜色分为0-255共256 级，每一像素点对应的数值即灰度，灰度值越小物体颜色越深。

有兴趣的小伙伴，可以随意用Image J打开一张图片，光标在图片上任意移动，得到的value值最小为0（纯黑），最大为255（纯白）。

2、光密度(OD，真)：也就是吸光度（A）, 光线通过溶液或某一物质前的入射光强度Io与该光线通过溶液或物质后的出射光强度Ib比值的对数OD=lg（Io/Ib），其实就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比尔定律。

明确这两个概念后，我们再来看为什么称Image J里的光密度是“假”，因为在图像分析中的光密度（假）是由灰度值再经计算得到的, 它是一个相对值, 但其算法与OD 值的算法类似。

只是它的入射光强度由Western blot胶片上最亮区域的平均灰度值代替, 而出射光强度则由待测目标平均灰度值代替。

即:图像分析系统的光密
度值=lg(WB胶片上最亮区域的平均灰度值/ 待测目标的平均灰度值)，再简单点来说，就是光密度（假）和正儿八经的灰度值有血缘关系。

总结起来说灰度与光密度（假）都能用来量化western blot条带，两种量化任君随意挑。

现在说回两种操作方法：
方法一：
是通过每个条带上众多像素点对应的灰度值勾画出一条曲线，最后魔棒点出算出的area值其实就是该条带所对应的面积大小。

条带越大，area值越大。

方法二：
是通过上文说到的光密度（假）计算方法得出来的，最后得出的Intden值是所圈面积下的总光密度值，再除以圈下面积area，得出的是平均光密度值（图像中阳性区域每一像素点的OD 值叠加后除以测量的面积）。

条带（颜色反转后）越白越亮则Intden/area越大。

所以严格意义上来说，方法一方法二最后得出的数据都不属于正儿八经的灰度值，但又与灰度值有着千丝万缕的联系。

如果只是量化WB条带，两种方法是都能选用的，记得标注你得到的结果是area还是Intden，但如果你想测出真正的灰度值，那么我们下节课再来好好谈谈，咦？我说话怎么越来越像老师的风格呢，哈哈，同学们，下课.
今天主要讲述如何用photoshop测量WB灰度值，在讲述操作方法之余，小石头先给大家理一理原理，以便大家更好的理解（文末附操作方法）。

照例最先展示下最后的成果图（其实最后可以用Graphpad做图，在此不赘述）：
好了，开始今天的课程，现在手里有张这样的WB条带图，如何将各条带灰度值测量出来？
首先我们从基本原理聊起，图片大小的存储基本单位是字节，每个字节是有8个比特（bit，音译为比特，也称为“位”）组成。

一般的图片都是由众多像素点构成的，灰度模式下一个像素一个字节，也同时就是8bit。

在上一堂课中，我们曾用Image J将图片转化为灰度图，就是通过image→type→8-bit这一步。

如果把黑-灰-白连续变化的灰度值量化为256个灰度级，灰度值的范围也就为0-255，表示亮度由深到浅。

从上图我们可以得知纯黑为0，纯白为255，中间0-255代表各个不同亮度等级。

而通常我们所得到的WB图片是这样的：
前者A是没有转化为灰度模式的，后者B是灰度模式下的。

而在灰度模式下，如果按灰度值描述的话，显然有明显条带的的灰度数据基本都与0相近，数值很小，这样不利于互相比较。

所以通常的做法是进行“反相”，也就是将白的地方变为黑，黑的地方变为白，颜色颠倒。

也就是这样：
至此条带上的灰度值就成了越亮越白则灰度值越大（有没有小伙伴看过那种原始照片底片，记不记得底片上人物的头发都是白的发亮，这种就是灰度值255哦；还有做电泳凝胶的小伙伴，得到的凝胶图就不需要反相了，可以直接进行灰度值分析哦）。

我们目前要想测量条带的灰度值，就只需把那发光发亮的地方圈出来，读取灰度值就可以了，而这一部分就交给photoshop来计算吧。

在这里小石头想敲敲黑板，提醒大家注意下三点：
1、由于Photoshop得出的灰度值是平均灰度值，而在比较WB条带灰度值时，我们还应考虑面积的关系，以面积与平均灰度相乘得出的总灰度，我们才能更准确地得出条带之间的表达差异。

2、条带上得出的数据其实是相对于背景而言的，这个背景虽然反相之后非常黑了，但毕竟不是全黑的，我们还需要扣除背景的灰度值。

并且，背景尽量干净，这就要求我们在做WB时多努力了。

3、不同图片的背景是不一样的，不同图片的WB条带是不能进行相互比较的哦。

接下来附上Photoshop测量WB条带的灰度值的操作方法，其中每一步的意义
基本已在上文所介绍，对哪一步操作有不明白的小伙伴可以回过头再看看的。

步骤1：打开软件Photoshop→左上角打开图片
步骤2:将图片转为灰度模式（如果已经为灰度，此步跳过）：图像→模式→灰度→扔掉
步骤3:将条带摆正（两种方法）
通用步骤：最左侧选取标尺工具→在条带上画一条自认本应水平的线
方法一：直接点击正上方“拉直图层”（此操作简便，但有可能使边缘条带挪出界外）
方法二：图像→图像旋转→任意角度→确定
步骤4:得到的灰度图进行适当调整：图像→调整→色阶→调整下图中三个点，适当将自己的WB图片转成黑白对比稍明显的样子，如图（此步也可通过更改亮度/对比度实现:图像→调整→亮度/对比度）
步骤5：反相：图像→调整→反相
步骤6：最左侧多边形套索工具→延条带边缘圈选→图像→分析→记录测量（分析→选择数据点可以只显灰度值-平均值和面积），依此步依次测量各个条带，同样的方法选取任意一个背景测量背景灰度值。

步骤7：导出数据，进行处理
结语：也许有小伙伴会提出这样测出的灰度值存在差异，在此提出的解决方案是可以与内参进行比较取相对值，或者多次独立测量以及实验。

而对WB条带量化，可以参照上堂课用Image J软件，今天主要还是讲述Photoshop与灰度值。