茚三酮法植物体内游离脯氨酸含量的测定

茚三酮法植物体内游离脯氨酸含量的测定

游离脯氨酸在植物体内的积累指数与植物的抗逆性有关。因此作为衡量植物抗逆性的一项生化指标。

一、【目的】

在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力，可作为植物抗逆性的一项生化指标。

二、【原理】

采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm 处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比，可以用分光光度法测定。（有的用80%酒精）

紫色

三、【仪器与用具】

分光光度计：水浴锅；漏斗；20ml大试管数支；20ml具塞刻度试管9支；5～10ml注射器或滴管。

【试剂】

1．3％磺基水杨酸水溶液；甲苯；冰乙酸

2．5%酸性茚三酮显色液：称取2.5g茚三酮，加入60ml 冰乙酸和40 ml 2mol／L磷酸(以3∶2混合)，在70度下加热溶解，冷却后贮于棕色瓶中，此液在4℃下2～3d有效。

3．脯氨酸标准溶液：准确称取25Mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg／ml。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg／ml的脯氨酸标准液。再用蒸馏水释释成1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL 的系列溶液。

四、【方法与步骤】

样品脯氨酸提取：取不同处理(干旱处理与对照)的剪碎混匀小麦叶片各0.3g(干样根据水分含量酌减)，分别置于20ml 具塞试管中，加入5ml 3％硝基水杨酸溶液，管口加盖玻璃塞，于沸水浴中浸提15Min。取出试管，待冷却至室温后，过滤，滤液待测。

显色取9支具塞刻度试管,编号。分别向各管加入按下表加入脯氨酸标准液（每ml 10μg）样品液和试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热30Min，冷却。向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。避光静置20min以上. 待分层后，用吸管吸取甲苯层，以1号管为对照在波长520nM下比色。

标准曲线制作

以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程或绘制标准曲线。

五、结果计算

从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。

脯氨酸[%(干或鲜样)]c×V

A

w

×106

式中C:提取液中脯氨酸浓度(μg)，由标准曲线求得；

V:提取液总体积(Ml),5ml；

A:测定时所吸取的体积(ml)0.5ml；

W:样品重(g)。

注意事项

1.比色液为比色杯高度四分之三左右

2.静置分层清晰后才可比色

【思考题】

1.植物体内游离脯氨酸测定有何意义

2.脯氨酸提取除本实验方法外，还有何方法？测定时应作哪些改变？

思考题参考答案

1．在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量明显增加。测定植物体内游离脯氨酸的含量，可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。

2．脯氨酸提取除本实验方法外，还可以用磺基水杨酸处理样品，待酸性茚三酮反应之后，再用甲苯萃取，520nm 比色。当脯氨酸提取试剂或萃取剂改变时，测定光密度的波长应当改变，具体采用多少波长，还应根据实验而定。