纤维素降解菌株的筛选

分解纤维素的微生物的分离

栾旭东，张兴敏，周雪霞，闫超，何溢涛

（山东大学生命科学学院2005级生科基地班，济南250100）

摘要：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，它能被土壤中某些微生物分解利用，是因为它们能够产生纤维素酶。本实验通过从土壤中分离分解纤维素的微生物，初步鉴定了其形态特征和生理生化特性，为日后更进一步的研究打下基础。

关键词：纤维素土壤微生物纯培养刚果红染色法

Abstract: cellulose is the most abundant polysaccharide on the earth, which can be digested by some microorganisms in the earth because they produce cellulase. In our experiment, we isolated these microorganisms from the earth and checked up the cells’ and colonies’ morphology and the bioreactions they can act.

Key words:cellulose, microorganisms in the earth, pure culture, Congo red staining

资源和环境问题是人类在21世纪面临最主要的挑战。生物质资源是可再生资源，地球上每年光合作用的产物高达 1.5×1011—2.0×1011，是人类社会赖以生存的基本物质资源，其中90%以上为木质纤维素类物质[1]。目前这部分资源尚未得到充分的开发利用。随着世界人口迅速增长，矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重要的意义和光明的发展前景。

地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%~60%能被土壤中的某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。而要研究这些微生物，首先要将它们从土壤中种类乏多的微生物中分离出来。

1.土壤中纤维素分解菌的分离[2]

土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。

实验的具体操作步骤如下。

1.1土样的采集

土壤中的微生物，大约70%~90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层。因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。综合各种因素，本小组从图书馆后院的落叶堆积丛取土样。

1.2.选择培养

1.2.1富集培养

在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，先通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。

富集培养所需要的仪器有：250ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、玻璃珠、称量纸等。

选择培养基的制备比例见下：

按上表比例配制50ml选择培养基。在250ml锥形瓶中装入50ml培养基，放5~6颗玻璃珠，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层牛皮纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

称取土样20g，在无菌条件下加入装有50ml培养基的锥形瓶中。将瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养3~4d，至培养基变浑浊。

1.2.2梯度稀释

所需仪器：试管（7支）、移液器、枪头。

需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、枪头（黄色、蓝色）。

用量程为1000µL的移液管从富集培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。然后换枪头从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释度的土壤溶液。

1.2.3刚果红染色法分离（涂布平板）

所需仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液器、枪头、温箱等。

需要灭菌的仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液器、枪头。

(1)鉴别培养基的制备

培养基的制备比例如下：

按以上比例配制200ml鉴别培养基和10mg/ml的刚果红（CR）溶液，灭菌后，按照每200ml培养基加入1ml的比例往培养基中加入CR溶液，混匀后倒平板，凝固后待用。(2)涂布平板

将上述已倒培养基的十个平板底面分别用记号笔写上10-4,10-5,10-6三种稀释度（每个稀释度写3个）和一个空白平板（留作对照用）。然后用移液器分别由10-4,10-5,10-6三管土壤稀释液中各吸取0.1ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。30℃倒置培养，至菌落长出，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。

(3)菌落形态观察

1~2d后，平板上长出菌落，并在个别菌落周围出现明显的透明圈。

图表 1 空白

图表 2 10-4

图表 3 10-5

图表 4 10-6

(4)划线分离

将步骤(1)中的鉴别培养基加热熔化后倒入2个无菌平皿中，凝固后，用接种环挑取(3)中2种菌落在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养，至长出单菌落。

由此，即从土壤中分离纯化出纤维素分解菌。