电生理研究方法

1944年获诺贝尔奖
Bernstein膜学说
1902年，Bernstein提出生物电发生的膜学说： “神经或肌肉的细胞膜只对钾离子有特殊的通透 性，而对较大的阳离子和阴离子则均无通透性， 因此由于细胞内外钾离子分布不均匀，在膜两侧 就形成一个电位差，此即静息电位，神经冲动到 来时，膜变为无选择通透的膜，静息电位消失， 动作电位因而产生。”
合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜存 在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可 揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的 发病机理，并提供治疗的新途径。 二人共获1991年诺贝尔奖。
内尔在实验室进行膜片箝研究工作
1983年10月第一版 《Single-Channel Recording》 封面
第二章
心肌电生理学研究方法
Methodology of Myocardium Electrophysiological Research
电生理学技术的发展
1825年 1922年 电流计发明与应用 电子管放大器和阴极射线示波器问世
20世纪40年代 微电极技术产生 动作电位的钠学说
20世纪50年代 电压钳技术产生
较Ri小。
2.横向电阻（redial resistance）
即细胞膜本身具有的膜电阻。细胞膜
由双层硷脂构成，厚度很薄，但具有很高 的电阻，即绝缘性。膜电阻表示离子通过 膜的有限能力。 膜电阻反映了离子是否 容易通透膜的情况。膜电阻（ Rm ）的大 小反映了膜结构电学方面的差异。
3.膜电容（capacity）
4 贮存和分析电生理实验结果的仪器
（1） 示波照相机 （2） 磁带记录仪 （3） 电子计算机 A/D转换- -把生物电（模拟 ）信号转换成 数字信号 D/A转换-- 把数字信号转换成模拟信号
二 细胞外记录（Extracellular recording）
细胞外记录是把电极安放在心肌表面或 附近引导心肌组织或细胞的电活动。 适应范围： （1）长时间的实验； （2）对清醒的、能自由活动的动物研究； （3）从不同组织部位作同时的多导记录； （4）研究非常小的细胞，数量多而难于 孤立起来，接触和穿刺都易于损伤等； （5）研究器官的总的活动。
表示膜的绝缘及储存电荷的性质。任何一
种装置使两个导体中间插入一个绝缘体并安排 在一起，称为电容器。细胞外液及细胞内液均 为含电解质的溶液，可看作为两个导体；细胞 膜是含脂质的膜，可视作为绝缘体。细胞外液 -细胞膜-细胞内液三者组成了电容。
4
膜电位 （membrane potential）
当膜上离子通道开放而引起带电离子跨
一、常用电生理仪器
刺激系统（刺激器等）
检测系统（电极、换能器）

放大系统（前置、后置放大器）
记录显示系统(示波器、记录仪、 计算机）
1.电子刺激器（Electronic stimulator）
电刺激不易损伤组织，又能定量而准确 地重复使用。方波（矩形波， square wave ） 的幅度、波宽和频率都可分别进行调节，所 以矩形波电子刺激器可作为理想的刺激源。
(一)
细胞膜的等效电路
从电学特点上分析，细胞膜可等效地模拟为 电阻－电容器。它具备细胞浆电阻（纵向电阻， ri），膜电阻（横向电阻，rm），膜电容（Cm） 和膜电位（Em）四方面的电学特性，根据这四 方面特性即可构成其等效电路 （ Equivalent Circuit）。
Ro Cm
outside
（4） 高的辨差比（共模抑制比）1000:1
（5） 高输入阻抗
（6）低频与高频滤波
低频滤波----用于变化速度快的生物电变化
高频滤波----用于减少噪声，提高信噪比
3 示波器（oscillograph）
要求： 高灵敏度
扫描速度快
频率高
类型：双线示波器
多线示波器 长余辉慢扫描示波器 记忆示波器
VC-11
7
四 离体心肌电活动的细胞内记录
（intracellular recording in vitro）
1 实验装置 2 微电极Hale Waihona Puke Baidu标准微电极、微推进器
3
4
浴槽与灌流装置 30—37度
刺激器
生理盐溶液、混合气体、摄氏
5
应用范围
稳定、长时间记录，可任意改变溶液成分 RP , APA, APD10, APD50, APD90, Vmax
20世纪70年代 膜片钳技术
谢灵顿 ( Sherrington) （1857-1952） 英国神经生物学家。 发现中枢神经反射活动规律
艾德里安 (Adrian ) （1889-1977） 英国生理学家。 阐明动作电位及其传导规律
1932年获诺贝尔奖
加塞 (Gasser ) 厄兰格 (Erlanger) （1888-1963） （1874-1965） （美） （美） 两人合作发明了阴极示波器，并研究了神经纤维的功能
SEN-7203
方波刺激脉冲的参数要求：
（1） 幅度（强度，amplitude） 矩形脉冲电压的最大瞬时值 （2） 波宽（刺激持续时间 time）
（3）频率（frequency）
一个脉冲循环所需的时间为周期，周 期 的倒数（即1S内所含的周期数目） 称为频率
（4）延迟（Delay） 从触发脉冲到刺激方波的出现，这 一段时间称为延迟。 （5）刺激方式（Pattern of stimulation） 单刺激、连续刺激、双脉冲刺激 （6）同步输出（Synchronized output） 同步脉冲表示一次刺激的时间起点
（7）刺激隔离器（Isolator）
当对实验动物同时进行刺激和记录生物电时， 刺激器输出和放大器输入具有公共接地线，使得 一部分刺激电流流入放大器的输入端，使记录器 记录到一个刺激电流产生的波形，即刺激伪迹。 隔离器切断了刺激电流从公共地线返回的可能， 减小伪迹并与电位分开。同时，消除50周交流电 感应造成的干扰。
Rm
+
Cm 膜电容
Rm 膜电阻
Em 离子平衡电位 Ro 细胞外液的纵向电阻（Ω /cm）
-
Em
Ri 轴浆的纵向电阻（Ω /cm）
inside 膜电位等效电路的简化图
细胞膜的等效电路是一个并联的阻容 路，膜活动时既有电压的改变，同时又有 电流的改变。电位的改变可引起电容器的 通过电容器的电流为 Ic ，通过电阻的电
离子学说（动作电位的钠学说） 1940年前后，由于Hodgkin和Huxley在枪 乌贼巨轴突上发现动作电位大于静息电 位的事实，Bernstein膜学说受到了有力 的打击。以后的研究证实， Bernstein膜 学说对于离子通透性的假设是不正确的。 其被后来的离子学说（钠学说）所代替。
Eccles
一、细胞膜的生物物理特性
(Biophysical properties of cell membrane)
细胞膜主要由脂质和蛋白质构成。以脂质 双分子层为支架，镶嵌着不同特性的蛋白质颗 粒。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的极化 状态及其形成过程中等都是细胞膜电缆性质 (cable properties)的反映。(轴浆电阻与膜 电阻、膜电容的组合，使电流对膜电位的影响 起着依距离而衰减以及在时间上的延缓作用 ――神经的“电缆”性质)。细胞膜的电缆特 性从定的等效电路及其时间常数和空间常数及 例证实。
电生理获医学诺贝尔奖名单（截止到2002年）
获奖时 间 1924 1932 获奖者 埃因托芬 (Einthoven) (1860-1927) 艾德里安 (Adrian) (1889-1977) 谢灵顿 (Sherrington) (1857-1952) 加塞 (Gasser) (1888-1963) 厄兰格 (Erlanger) (1874-1965) 埃克尔斯 (Eccles ) （1903-1997） 霍奇金 (Hodgkin) （1914-1998） 赫克斯利 (Huxley) （1917-） 哈特兰 (Hartline) (1902-1983) 格兰尼特 (Granit) (1900-1991) 卡茨 (Katz) (1911- ) 休伯尔 (Hubel) (1926-) 威塞尔 (Wiesel) (1924-) 内尔 (Neher) (1944-) 萨克曼 (Sakmann) (1942-) 国别 荷兰 英国 英国 美国 美国 澳大利亚 英国 英国 美 瑞典 英国 美国 瑞典 德国 德国 两人合作对视觉皮层的结构和 功能进行了重要研究 发明膜片箝技术，首次证实细 胞膜上存在离子通道 视觉神经生理（视觉神经元间 的抑制） 视觉神经生理（视网膜电图） 提出神经递质释放的量子学说 两人合作发明了示波器，并研 究神经纤维的功能 用 1 微米尖端的微电极研究中 枢兴奋和抑制 两人合作揭示了神经元通过电 脉冲与其它神经元传递信息 《神经活动的电表现》 “突触后抑制的离子机制” “神经传导的离子基础” “神经兴奋和传导的定量分析” 发现神经元的功能 获奖工作 研制成功记录心脏动作电位的 心电图机并命名心电图波。 获奖题目或著作 “弦线式电流计和心脏动作电位的测量” “神经纤维的活动” 《神经系统的整合作用》
1981年Hamill和 Neher等对该技术进行了改进，引进了全细胞 记录技术，从而使该技术更趋完善；
1983年10月，《Single-Channel
Recording》一书的问世，奠
定了膜片钳技术的里程碑。
Neher
（1944-） （德国细胞生理学家）
Sakmann
（1942-） （德国细胞生理学家）
6 优点 7 观察指标
第二节：电压钳制技术
(Voltage clamp technique)
利用微电极技术，虽然记录到细胞内的电 变化过程，但不能阐明这种变化的原因。要阐 明跨膜电变化机制，必需应用电压钳制技术。 这一技术首先是由 Cole 及其同事设计，在经 Hodgkin 等人加以改进，用于神经电生理研究， 弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。
2.微电极放大器（microelectrode amplifier）
组成：精密稳压电源、高输入阻抗探 头、主放大器、电容补偿电路、校正电 路、低通滤波电路等
Axopatch 200B （AXON，USA）
要求：
（1）足够高的放大能力
（2）频率响应范围大 0—100Hz
（3） 低噪声 >50uV 1000MΩ
1944
1963
1967
“受体与感知” “神经末梢的化学传递” “视觉皮层的研究” “视皮层的发育和环境的影响”
1970 1981
1991
《单通道记录》
第一节 常规心肌电生理研究技术
在常规心肌电生理研究中，主要是采用
玻璃微电极插入在体或离体心肌细胞内，记
录心肌细胞的跨膜电活动，并研究各种因素
对其电活动的影响。
1976 年德国马普生物物理化学研究所 Neher 和 Sakmann 首次
在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到乙酰胆碱 （ Acetylcholine, ACh ）激活的单通道离子电流，从而产生了 膜片钳技术（patch clamp technique）；
1980年 Sigworth等获得 10-100GΩ的高阻封接（ Gigaseal），
电极：
（1）玻璃微电极
（2）金属电极
（3）离子选择性电极 （4）单极电极 （5）多管电极
三 在体心脏电活动的细胞内记录
（intracellular recording in situ）
1 实验装置 包括浮置式玻璃微电极、 微电极推进器、微电极放大器、示波 器、照相装置、记录仪、计算机等
监听器 微放器 推进器 记录仪
充、放电，也可用于电阻器上的电流流动。 流为Ir。
1
纵向电阻（Ro、Ri）
由胞浆的性质所决定，具有较高的电阻率，
它与直径是反比关系（直径大、电阻小，直
径小，电阻大）。由于它的存在，使生物电
的传导主要沿细胞膜所包围的容积导体进行。
它是单位长度的电阻，单位是Ω/cm ，细胞
外间质的容积很大，其单位长度电阻（ Ro ）
微电极
示波器 照相机 计算机 打印机
心脏
2 动物手术
3 4 5 电极制作要求 插入 应用范围 生理、药理、心肌缺血等
6
优点：在近于生理状态下实验，可观察整 体因素对心肌电活动的影响，可研究药物及 其代谢产物的作用过程，更有利于阐明各种 调节因素、致病因素或药物对心肌电生理特 性的影响机制 缺点：记录不持久，影响因素多