各种细菌的培养

海水中的微生物分离

（一）厌气细菌的分离和无氧装置

在水层及沉积物中都有厌气细菌生长着。要将它们分离培养需要创造缺氧环境，其方法很多，通常可分为物理、化学和生物三类方法。物理方法是将接种物置于抽气（或加充非氧气）密闭箱中，使其在缺氧下培养长出。化学吸氧法是用化学药品把培养器中的氧气吸去．造成缺氧的培养环境。生物吸氧法是利用燕麦萌发时的旺盛呼吸作用，吸收培养环境中的氧气，形成缺氧的环境条件．

1.焦性没食子酸吸氧法

利用焦性没食子酸在碱性溶液中吸收游离氧气，造成决氧的培养环境．此法较适用于小型的科学实验。每克没食子酸（淡绿色）在过量碱性溶液中能吸收100毫升空气中的氧．生成深棕色的焦性没食橙。

试验步骤

①把样品稀释液接种于加1%葡萄糖、0.1%硫化甘醇酸钠和0.0002%美蓝的2216E 培养基中，这种培养基灭菌后应避免与大气接触。如果所接种的是淡水样品，可用葡萄糖肉膏蛋白胨培养基替代2216E 培养基。

②吸20%氢氧化钠溶液2.5 毫升于小玻璃皿或试剂瓶的塑料盖中，将此皿放于玻璃板或搪瓷盘上。

③加焦性没食子酸0.5 克。

④立即将预先接种好的培养皿倒扣于小玻璃皿上。

⑤用溶化的石腊将培养皿与玻璃板之间的缝隙封固，置于适当温度下培养至长出明显的菌落后进行观察。

注意事项：

①可将吸氧剂改用等量的焦性没食子酸与无水碳酸钠混合物（l -2 克），不必加水，这样有利于吸水，便于形成单颗菌落。

②必须选用适当高度的培养皿和盛吸氧剂小皿（或试剂瓶盖）以防吸氧剂同培养基接触．

2 ．圆形玻璃板隔绝空气培养法

当平板培养基接种后．立即用比平皿稍小的无菌圆形玻璃板盖上，以避免培养基同空气接触。而后送入培养箱培养。在长出菌落后．除玻璃圆板周围外 , 美蓝的颜色会很快恢复，即处于还原状态．没有同氧起氧化作用，这说明培养基上的细菌处于缺氧状态，长出的菌落为厌氧细菌菌落。

3 ．机械抽气法

把已接种的平板培养物立即放入干燥器中，用真空泵抽出空气，而后通入CO2以维持干燥器内外压力平衡，以利于细菌生长。在一定温度下培养至长出明显菌落，观察其形态。

4 ，生物吸氧法

将培养有发芽旺盛的燕麦小平皿放在玻璃板上，把已接种的大培养皿倒盖在上面，以石蜡密封大平皿与玻璃板间的缝隙，置一定温度下培养至长出明显的菌落 . 将其中的小玻璃皿换成培养有发芽旺盛燕麦芽的小平皿）。

5 ．注意事项

厌氧菌的培养必须符合以下三个条件：

（1）当氧气与培养基接触期间和在培养基制备中不能产生有毒的氧化作用产物。

（2）保温和培养期间．需保持培养基排除空气的条件．

（3）在培养装置中可维持低氧化还原作用。

并非所有方法都能符合这些条件，但必须尽量符合。采用对实验有利和方便的方法。

（二）芽孢杆菌的分离

水中有芽孢杆菌属（Bacillus），如玻璃样芽孢杆菌、杆状芽孢杆菌、华丽芽孢杆菌等好气菌属。也有嫌气性的梭状芽孢杆菌属。淡水中常有蜡质芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌等．

1 ．培养基成分及其制备

（1）芽孢杆菌培养基（I）:

K2HPO4 0.5 克

MgSO4 ·7H2O 0.5 克

柠檬酸钢铁铵0.5克

柠檬酸2 克

甘油20 克

L-谷氨酸4 克

陈海水（或自来水）1000 毫升

pH 7.4

( 2 ）巨大芽孢杆菌培养基（II）:

酵母膏2.5 克

胰胨1 克

陈海水或蒸馏水1000毫升

琼脂18 克

将各成分放于水中加热溶解，调pH 为7.2 分装，121℃蒸汽下灭菌20 分钟，制成平板和斜面。

( 3 ）刺激芽孢生长培养基：

蛋白胨10 克

酵母浸出膏3 克

淀粉3 克

MgSO4 0.1 克

KH2PO4 1.5 克

Na2HPO4 50 克

水1000 毫升

制法：将上述的成分混和，加热溶解。调pH 为7.8 ，用滤纸过滤。分装于15 × 155 毫米的试管，每管约10 毫升．于121 ℃下的蒸汽压下灭菌15分钟，存于冰箱备用。

用途：用于刺激梭状菌迅速产生芽孢，即使非常不易产生芽孢的魏氏杆菌，在此培养中也能迅速长出芽孢。

2 ．分离步骤

（1）将样品制成悬浮液．置于80 ℃水浴锅中加热10-20 分钟，杀死不形成芽孢的其他种菌体（包括所要分离的菌体也被杀死，但芽孢不死，可萌发）。

（2）取出静置10 分钟。

（3）按划线法或稀释法进行分离纯化。

（三）海洋发光细菌的分离培养

发光细菌所发的光是冷光，在转变化学能为光能中。效率接近百分百．所以发光细菌是研究光源材料之一，细菌灯可作为危险品仓库的照明，在细菌发光时绝对需要氧气，故可应用于低浓度氧的测定，发光细菌也可用于毒物和抗菌素的测定，将来还可能用于宇宙航行时对地球外的生命物质的探测。海洋发光细菌既可从鱼的体表、内脏，发光器官分离而得，也可从海水或河口水及其沉积物中分离得到。发光细菌在新鲜的海洋鱼类体表多于腐败的鱼体。鱼体一旦腐败，腐生菌繁殖很快．并且取代发光细菌。故分离发光细菌时要用新鲜鱼或其他新鲜海洋动物。典型的发光细菌是筒状细菌，大小约1.1×42.2微米，也有球状和弧状，又分单极鞭毛和周生鞭毛，多数为革兰氏阴性菌．我国已分离的发光细菌目前有四种。

1 ．增殖培养

（1）取一条新鲜鱼，放在无菌的大培养皿内，向鱼体上倒入无菌的3 %食盐水，使液面高度在鱼体腹线处．不可将鱼体完全淹没。将鱼的内脏拉出用无菌剪刀剪开胃肠．取出内含物放于无菌培养皿中，同样加入无菌的3%食盐水．不淹没鱼内脏，浸入二分之一即可。

（2）置于15 ℃温箱中培养l-2 天后，在微暗处观察。鱼体表面微弱的亮点便是发光细菌，则应及时挑出分离，否则腐生菌滋长，而发光菌就会消失。

2 ．第一次分离

（1）鸡蛋培养基的制备，将一个鸡蛋的蛋白及蛋黄全部倒入烧杯中，加入3%食盐水100 毫升，搅匀，分装于培养皿中；每个培养皿约倒15-20毫升，在121 ℃的蒸汽下灭菌30 分钟。

（2）在黑暗处用接种环分别从鱼体表面和鱼内脏内含物上的亮点处挑取少许亮度较大的发光细菌菌落。在鸡蛋培养基上划线分离，挑取亮度较弱的菌落分别在另两个鸡蛋培养基上划线。

（3）在15 ℃温箱中培养1-2 天，则可在培养基表面看到发光细菌的菌落。此时发光细菌菌落中发光细菌己占优势，但还混有许多腐生纽菌。若不及时分离纯化．由于腐生细菌的大量繁殖会抑制发光细菌生长。最后，将取而代之。

3.第二次分离

（1）蛋白胨牛肉膏的制备；

蛋白胨1 克

牛肉膏l 克

K2HPO4 0.1 克

MgSO4·7H2O 5 克

NaCl 3 克

琼脂1.5-2.0克

将以上物质加蒸馏水至100 毫升，混匀，加热溶解，调pH7.4 ，于121 ℃蒸汽压下灭菌30 分钟。冷至45 ℃后分装培养皿上，制成平板培养基．（2）在黑暗处分别挑选培养基上发光细菌菌落少许，在平板培养基上划线分离。

（3）在15℃温箱中培养1-2 天，则可看到单个的发光细菌菌落。

（4）挑取各种菌落少许分别涂片，各用革兰氏染色法和鞭毛染色法染色，观察其菌落形态。