基因结构与表达分析.ppt

测序技术基础：
高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ , ）。 能分离长度为300-500个碱基， 差别仅1个碱基的单链寡核苷酸片段。
4
7
11
5′ T A C G C T G A A T G A 3′
AG CT
2. 测序主要步骤
已知序列 5′ 3′
3′ 测序引物
5′ 3′
测序引物延伸 5′ 3′
未知序列 变性 模板-引物退火 标记反应 延伸-终止反应
四、条件的优化
(一) 聚合酶浓度： 1.0～2.5 100 μl反应液
(二) 浓度：20～200 μ (三) 2+浓度：0.5～2.5 (四) 引物浓度：0.1～0.5 μ
五、改进技术 1. ( )
以为模板逆转录合成，再
2. 实时荧光定量
通过起点定量和荧光检测系统实时监 测累积荧光强度，对产物实时定量的技术。
聚合酶特性
● 5′→3′聚合酶活性； ● 5′→3′外切酶活性； ● 逆转录酶活性； ● 较弱的非模板依赖性； ● 缺乏3′→5′外切酶活性。
自动化的实现
热循环： ①高温变性（93~98℃） ②低温退火（37~65℃） ③中温延伸（70~75℃）
产物的琼脂糖凝胶电泳分析
1000 900 800 700 600 500 400
基因结构与表达分析 的基本策略
第一节 序列分析
一、双脱氧链末端终止法 二、自动化序列分析
三、化学裂解法
一、双脱氧链末端终止法 （）
、和的结构
ATP dATP
A
OH
OH
A
OH
A
引物
延伸的新 合成链
单链模板
1. 双脱氧末端终止法原理
DNA合成反应中，ddNTP不存在 3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸的 5′-P 端 形 成 3′ ， 5′- 磷 酸 二 酯 键 ， 导 致 DNA新链的延伸提前终止于ddNTP 。
用限制性内切酶B消化
4.
利用高度保守序列设计引物扩增 哺乳动物未知片段的方法。
5. 原位 ( )
制备细胞 多聚甲醛固定 蛋白酶K消化
原位 地高辛标记
6. 巢式（ ）
设计两对引物，一对引物对应的序 列在模板外侧，称外引物，另一对引 物互补序列在同一模板的外引物的内 侧，称内引物，外引物扩增产物为内 引物的扩增模板，经过二次，可检出
5′CACTGAACGTAGGCCT3′ 3′TCCGGATGCAAGTCAC5′
引物自身不应形成发夹结构
4.其它原则:
① 引物长度: 10～30 ② 碱基分布: A、T、G、C 随机分布
③ 含量：40 ～60% 4()+2() ④ 引物3′末端碱基：最好选T、C、G，不选A
避免出现3个以上的连续碱基，如或
实时应用：用于基因拷贝数和表达定 量分析。
荧光标记方法 ①荧光染料
I 作用机理
每形成一个双链，就有一定数量的染料
②
寡核苷酸探针的5′端标记一个荧光报 告基团（ ），3′端标记一个荧光淬灭基团 （ ）。
பைடு நூலகம்
③
探针具有发夹结构，5′端标记荧光 报告基团，3′端标记淬灭基团。
终点量是经过扩增的量，存在 部分失真，起点定量重现性好，终 点定量误差大。
300
三、引物设计原则
基本原则：
1. 引物与模板的序列要完全互补 2. 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体
或发夹结构 3. 引物不能在模板的非目的位点引发聚合
反应(错配)
1. 引物与模板的序列要紧密互补
特异扩增
5′3′ 3′5′
2. 引物不能在模板的非目的位点引发 聚合反应(错配)
错误引发
3.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体 或发夹结构
硫酸二甲酯
哌啶
第三节 聚合酶链式反应
()
一、技术原理 二、耐热聚合酶 三、引物设计原则 四、条件的优化
一、技术原理
5
模板 引物 聚合酶 2+
5
5
Cycle 1
1 52
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5 5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
引物： 单链片段,提供复制起始的3′。
引物延伸产物 比两引物限定区长的延伸产物。仅发生在以原始为模
引物5′端修饰技术
附加核酸序列
用途
限制酶位点
克隆（如定向克隆）
噬菌体启动子
合成RNA探针、测序
蛋白质结合序列 产物纯化、检测
核糖体结合序列 高效表达
加错配碱基造成突变 定点诱变
引物用量计算
106 Y（）= X·33×──
330 . N X = ──×105 N
1 A260 ≈33μg N: 引物碱基数
自动测序步骤
4种带有不同荧光染料标记的终止物
测序反应
反应产物毛细管电泳分离
激光激发不同大小片段上的荧光分子， 发射出四种不同波长的荧光
三、化学降解法
将待测片段3′或5′端进行同位素标记，标记 的片段分成四个反应，分别用不同的化学试剂 处理，造成碱基特异性切割，使片段分别于某 一种碱基处断裂。
化学降解G反应模式图
板的扩增过程中，以倍数形式扩增(2n)。
扩增终产物大小 介于两条退火引物5′末端之间的双链片段。
原理
是模拟天然复制过程，利用聚合酶催化一 对引物间特异片段合成的体外扩增技术。
主要热循环过程：变性、退火、延伸。
变性
模板 引物
扩增产物的量
（1）n Y: 扩增产物的量 A: 最初靶分子数 E: 扩增效率 n: 循环次数
平台效应（ ）：
经过一定数量的循环后，片段不再呈 指数累积，而是进入平台期。
二、耐热聚合酶
大肠杆菌聚合酶Ⅰ片段 ： ① 热稳定性差，不耐高温。 ② 反应温度偏低，产生非特异扩增。
T4 与T7 聚合酶:热稳定性差。
聚合酶
从嗜热水生菌( 1) 株中直接分离出来。
较高的热稳定性：
95℃的半衰期: 40 最适温度: 72 ℃ ～80 ℃ 催化反应速率:
3′ 待测双链 5′ 5′ 单链模板
5′
5′
&
&
&
&
GACT
测序步骤
• 单链模板的制备 • 模板与测序引物退火 • 掺入法标记反应 • 延伸-终止反应 • 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 • 放射自显影
二、自动化序列分析
5′ T A C G C T G A A T G A 3′
用荧光化合物分别标记4种终止反应产物， 替代放射性同位素标记是实现测序自动化的
基线：扩增曲线中的水平部分，为空白或 背景信号。
阈值（临界点）:
扩增信号进入指数增长期的最下限， 即由基线期进入指数增长期的拐点。
值:
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。
值与[]0的关系
标准曲线：值对[]0作图
3. 反向（ ）
对已知片段两侧的未知序列进行扩 增和研究。
用限制性内切酶A消化 用T4连接酶环化