基因结构与表达分析.ppt

基线：扩增曲线中的水平部分，为空白或 背景信号。
阈值（临界点）:
扩增信号进入指数增长期的最下限， 即由基线期进入指数增长期的拐点。
值:
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。
值与[]0的关系
标准曲线：值对[]0作图
3. 反向（ ）
对已知片段两侧的未知序列进行扩 增和研究。
用限制性内切酶A消化 用T4连接酶环化
自动测序步骤
4种带有不同荧光染料标记的终止物
测序反应
反应产物毛细管电泳分离
激光激发不同大小片段上的荧光分子， 发射出四种不同波长的荧光
三、化学降解法
将待测片段3′或5′端进行同位素标记，标记 的片段分成四个反应，分别用不同的化学试剂 处理，造成碱基特异性切割，使片段分别于某 一种碱基处断裂。
化学降解G反应模式图
实时应用：用于基因拷贝数和表达定 量分析。
荧光标记方法 ①荧光染料
I 作用机理
每形成一个双链，就有一定数量的染料
②
寡核苷酸探针的5′端标记一个荧光报 告基团（ ），3′端标记一个荧光淬灭基团 （ ）。
③
探针具有发夹结构，5′端标记荧光 报告基团，3′端标记淬灭基团。
终点量是经过扩增的量，存在 部分失真，起点定量重现性好，终 点定量误差大。
硫酸二甲酯
哌啶
第三节 聚合酶链式反应
()
一、技术原理 二、耐热聚合酶 三、引物设计原则 四、条件的优化
一、技术原理
5
模板 引物 聚合酶 2+
5
5
Cycle 1
1 52
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5 5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
引物： 单链片段,提供复制起始的3′。
引物延伸产物 比两引物限定区长的延伸产物。仅发生在以原始为模
聚合酶特性
● 5′→3′聚合酶活性； ● 5′→3′外切酶活性； ● 逆转录酶活性； ● 较弱的非模板依赖性； ● 缺乏3′→5′外切酶活性。
自动化的实现
热循环： ①高温变性（93~98℃） ②低温退火（37~65℃） ③中温延伸（70~75℃）
产物的琼脂糖凝胶电泳分析
1000 900 800 700 600 500 400
板的扩增过程中，以倍数形式扩增(2n)。
扩增终产物大小 介于两条退火引物5′末端之间的双链片段。
原理
是模拟天然复制过程，利用聚合酶催化一 对引物间特异片段合成的体外扩增技术。
主要热循环过程：变性、退火、延伸。
变性
模板 引物
扩增产物的量
（1）n Y: 扩增产物的量 A: 最初靶分子数 E: 扩增效率 n: 循环次数
基因结构与表达分析 的基本策略
第一节 序列分析
一、双脱氧链末端终止法 二、自动化序列分析
三、化学裂解法
一、双脱氧链末端终止法 （）
、和的结构
ATP dATP
A
OH
OH
A
OH
A
引物
延伸的新 合成链
单链模板
1. 双脱氧末端终止法原理
DNA合成反应中，ddNTP不存在 3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸的 5′-P 端 形 成 3′ ， 5′- 磷 酸 二 酯 键 ， 导 致 DNA新链的延伸提前终止于ddNTP 。
测序技术基础：
高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ , ）。 能分离长度为300-500个碱基， 差别仅1个碱基的单链寡核苷酸片段。
4
7
11
5′ T A C G C T G A A T G A 3′
AG CT
2. 测序主要步骤
已知序列 5′ 3′
3′ 测序引物
5′ 3′
测序引物延伸 5′ 3′
未知序列 变性 模板-引物退火 标记反应 延伸-终止反应
5′CACTGAACGTAGGCCT3′ 3′TCCGGATGCAAGTCAC5′
引物自身不应形成发夹结构
4.其它原则:
① 引物长度: 10～30 ② 碱基分布: A、T、G、C 随机分布
③ 含量：40 ～60% 4()+2() ④ 引物3′末端碱基：最好选T、C、G，不选A
避免出现3个以上的连续碱基，如或
用限制性内切酶B消化
4.
利用高度保守序列设计引物扩增 哺乳动物未知片段的方法。
5. 原位 ( )
制备细胞 多聚甲醛固定 蛋白酶K消化
原位 地高辛标记
6. 巢式（ ）
设计两对引物，一对引物对应的序 列在模板外侧，称外引物，另一对引 物互补序列在同一模板的外引物的内 侧，称内引物，外引物扩增产物为内 引物的扩增模板，经过二次，可检出
平台效应（ ）：
经过一定数量的循环后，片段不再呈 指数累积，而是进入平台期。
二、耐热聚合酶
大肠杆菌聚合酶Ⅰ片段 ： ① 热稳定性差，不耐高温。 ② 反应温度偏低，产生非特异扩增。
T4 与T7 聚合酶:热稳定性差。
聚合酶
从嗜热水生菌( 1) 株中直接分离出来。
较高的热稳定性：
95℃的半衰期: 40 最适温度: 72 ℃ ～80 ℃ 催化反应速率:
300
三、引物设计原则
基本原则：
1. 引物与模板的序列要完全互补 2. 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体
或发夹结构 3. 引物不能在模板的非目的位点引发聚合
反应(错配)
1. 引物与模板的序列要紧密互补
特异扩增
5′3′ 3′5′
2. 引物不能在模板的非目的位点引发 聚合反应(错配)
错误引发
3.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体 或发夹结构
3′ 待测双;
&
&
&
GACT
测序步骤
• 单链模板的制备 • 模板与测序引物退火 • 掺入法标记反应 • 延伸-终止反应 • 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 • 放射自显影
二、自动化序列分析
5′ T A C G C T G A A T G A 3′
用荧光化合物分别标记4种终止反应产物， 替代放射性同位素标记是实现测序自动化的
引物5′端修饰技术
附加核酸序列
用途
限制酶位点
克隆（如定向克隆）
噬菌体启动子
合成RNA探针、测序
蛋白质结合序列 产物纯化、检测
核糖体结合序列 高效表达
加错配碱基造成突变 定点诱变
引物用量计算
106 Y（）= X·33×──
330 . N X = ──×105 N
1 A260 ≈33μg N: 引物碱基数
四、条件的优化
(一) 聚合酶浓度： 1.0～2.5 100 μl反应液
(二) 浓度：20～200 μ (三) 2+浓度：0.5～2.5 (四) 引物浓度：0.1～0.5 μ
五、改进技术 1. ( )
以为模板逆转录合成，再
2. 实时荧光定量
通过起点定量和荧光检测系统实时监 测累积荧光强度，对产物实时定量的技术。