深度测序技术简介
蛋白质谱的测序深度
蛋白质谱的测序深度
蛋白质谱的测序深度是一个用于描述蛋白质组学研究中数据质量和覆盖度的参数。
在蛋白质组学中，测序深度通常指的是对样本中蛋白质的分析和鉴定的详尽程度。
这涉及到从样本中提取蛋白质、酶解、质谱分析和数据解析的整个过程。
以下是关于蛋白质谱测序深度的一些详细说明：
1. 样本制备：测序深度的起始点是样本的制备。
为了获得尽可能全面的蛋白质信息，研究人员需要选择合适的样本处理方法，以确保能够提取和保留样本中的大多数蛋白质。
2. 酶解：在质谱分析之前，通常会用特定的蛋白酶（如胰蛋白酶）将蛋白质酶解成肽段。
这一步是为了使大分子蛋白质更易于质谱分析。
酶解的效率和质量也会影响最终的测序深度。
3. 质谱分析：质谱仪是蛋白质组学研究中的核心工具。
它通过测量肽段的质荷比（m/z）和碎裂模式来识别和定量蛋白质。
质谱分析的参数设置（如分辨率、扫描范围、碎裂能量等）会直接影响测序深度。
4. 数据解析：质谱数据需要经过复杂的生物信息学分析才能转化为有意义的蛋白质信息。
这包括肽段和蛋白质的鉴定、定量以及后续的功能注释和通路分析等。
数据解析的算法和软件的选择也会对测序深度产生影响。
测序深度的增加意味着能够鉴定和定量的蛋白质种类和数量增加，从而提供更全面和准确的蛋白质组信息。
然而，增加测序深度通常需要更高的实验成本、更复杂的实验设计和更强大的计算能力。
因此，在实际研究中，需要根据具体的研究目的和资源来选择适当的测序深度。
线粒体平均测序深度-概述说明以及解释
线粒体平均测序深度-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述:线粒体平均测序深度是指在基因测序过程中针对线粒体基因组进行的测序深度平均值。
线粒体是细胞的重要细胞器之一，具有自主复制和自主转录的能力，其基因组含有一部分的核酸序列，参与到细胞的能量代谢和调控等重要生命活动中。
因此，对线粒体基因组的测序研究具有重要的生物学意义。
线粒体平均测序深度作为评估测序质量和覆盖度的指标，能够反映测序实验中线粒体基因组的测序覆盖程度和读长的平均深度。
在基因组学研究中，通过对样本中线粒体平均测序深度的分析，可以评估线粒体基因组的测序质量，判断测序的覆盖度和准确度，为后续的数据分析和生物信息学研究提供可靠的基础数据。
同时，线粒体平均测序深度还可用于评估样本中线粒体基因组的多样性和变异情况。
不同个体之间、不同种群之间的线粒体基因组存在着一定程度的变异，而线粒体基因组的多样性和变异对于进化生物学、遗传学等领域的研究具有重要意义。
通过对线粒体平均测序深度的分析，可以揭示不同样本之间的基因组差异，进一步探索线粒体基因组在个体和种群水平上的进化和遗传特征。
综上所述，线粒体平均测序深度在生物学研究中具有重要的意义和应用前景。
通过对线粒体平均测序深度的评估和分析，可以为后续的基因组学研究提供可靠的基础数据，并为进化生物学、遗传学等领域的研究提供重要的理论支持。
因此，深入研究线粒体平均测序深度的定义、影响因素和应用前景，对于推动相关领域的科学研究和技术发展具有重要意义。
1.2文章结构文章结构：本文将按照以下方式进行组织和呈现。
首先，引言部分将对线粒体平均测序深度的概念进行简要介绍，并解释本文的目的。
接下来的正文部分将分为两个主要部分。
第一部分将深入讨论线粒体平均测序深度的定义和意义，包括其在生物学研究中的重要性和应用。
第二部分将探讨影响线粒体平均测序深度的因素，包括实验设计、测序平台和数据处理等方面的因素。
最后，结论部分将对线粒体平均测序深度的应用前景进行展望，并总结全文的主要内容。
RNA-seq技术原理及应用
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三、RNA-seq结果分析
两类样本 RNA-seq 数据比较分析的框架
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四、RNA-seq技术应用
1、转录本结构研究 利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰
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二、RNA-seq技术原理
RNA-se精q选实ppt验课件流程图
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三、RNA-seq结果分析
为了便于测序数据的发布和共享，高通量测序数据以 FASTQ 格式来记录所测的碱基读段和质量分数。 NCBI、EBI、 DDBJ 等数据中心建立了大容量的数据库 SRA来存放共享的测 序数据。
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三、RNA-seq结果分析
RNA-seq 数据的基本处理
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三、RNA-seq结果分析
1. 序列定位算法
（1）空位种子索引法：首先将读段切分，并选取其中一段 或几段作为种子建立搜索索引，再通过查找索引、延展匹配来 实现读段定位 ，通过轮换种子考虑允许出现错配的各种可能的 位置组合（Maq）。
RNA-seq技术原理及应用
主要内容
1、RNA-seq技术简介 2、RNA-seq技术原理 3、RNA-seq结果分析 4、RNA-seq技术应用
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一、RNA-seq技术简介
1.诞生于 20 世纪 70 年代的 Sanger 法是最早被广 泛应用的 DNA 测序技术，也是完成人类基因组计 划的基础。
2. 2005 年以来，以 Roche 公司的 454 技术、 Illumina 公司的 Solexa 技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序技术相继诞生，又称作深 度测序技术。
deep sequencing原理
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深度测序生物学分析
深度测序生物学分析随着近年来基因测序技术的迅速发展，深度测序技术已经成为了生物学领域中最具影响力的技术之一。
深度测序技术（Next-generation sequencing, NGS）是指利用高通量测序平台对大量DNA或RNA样品进行测序分析的技术。
与传统的Sanger序列测序相比，深度测序无需进行PCR扩增，可同时对多个样品进行测序，具有高通量、高精度、低成本的优势，极大地促进了生物学领域的研究进展。
本篇文章将探讨深度测序生物学分析的相关内容。
一、深度测序技术原理深度测序技术是基于高通量平台的DNA或RNA测序，通过高通量测序仪器对样品进行测序，会得到几十亿个碱基对的数据。
具体来说，深度测序技术的分子生物学原理主要包含以下几个步骤。
第一步是DNA或RNA的提取和纯化步骤，通常会使用标准的提取试剂盒和试剂来纯化用于深度测序的样品。
第二步是将DNA或RNA样品打碎成特定的长度，通常是为了适应不同的NGS平台。
其中，DNA片段的长度通常为几十bp到几千bp的范围，RNA片段的长度通常为几十bp到几百bp的范围。
第三步是将DNA或RNA样品夹在适当的引物上，并在适当的条件下进行PCR扩增。
第四步是使用高通量测序仪器进行测序。
目前市面上常用的高通量测序仪器包括Illumina HiSeq、MiSeq、NovaSeq、Ion Torrent PGM和Proton等。
第五步是进行数据分析。
这个步骤通常包括测序数据质量控制、序列比对、变异检测、RNA表达谱分析等内容。
二、深度测序技术应用范围深度测序技术已经广泛应用于许多生物学领域的研究。
下面列举一些测序应用的常见领域。
1. 基因组学深度测序技术可以广泛用于基因组、转录组等多个维度的研究中，其中最典型的应用是对多种生物物种基因组的分析。
深度测序技术的出现使得构建完整的物种基因组成为可能。
在基因组学领域，深度测序技术也可以用于DNA甲基化、基因重排、基因拷贝数变异等方面的研究。
NGS深度基因测序技术在疾病诊断医学中的前景展望
NGS深度基因测序技术在疾病诊断医学中的前景展望NGS（Next-Generation Sequencing）深度基因测序技术是近年来迅速发展的一项重要技术，其在疾病诊断医学中有着广阔的前景。
NGS技术具有高通量、高灵敏度、高准确性和低成本等优势，已经被广泛应用于疾病的诊断、预测、治疗和个体化医疗等方面。
首先，NGS技术在疾病诊断中的应用前景广阔。
传统的基因测序技术需要耗费大量时间和资源，不能满足快速准确诊断的需求。
而NGS技术通过并行测序大量DNA片段，可以在较短的时间内完成大规模基因测序，从而为疾病的早期诊断和个体化治疗提供有力支持。
通过对患者基因组的全面分析，可以发现潜在的致病基因变异，帮助医生做出准确的诊断。
此外，NGS技术还能够识别疾病的基因模式和相关的基因表达变化，为病理生理过程的理解提供更多线索。
其次，NGS技术可以为疾病的预测和风险评估提供更准确的方法。
通过对大规模样本的基因组分析，可以发现潜在的致病基因和易感基因，为疾病的患病风险评估提供基础。
NGS技术的高通量和高灵敏度能够检测极低频率的基因变异，从而发现对特定疾病易感的遗传变异。
此外，NGS技术还能够对复杂疾病的遗传因素、环境因素和生活方式因素进行深入研究，为疾病的预防和干预提供更全面的信息。
NGS技术在疾病治疗中也具有巨大的发展潜力。
通过对患者基因组的深度测序，可以预测个体对特定药物的反应，从而实现个体化的药物选择和用药方案设计。
NGS技术还可以帮助医生监测疾病的微环境和基因表达变化，为精准治疗和药物研发提供重要参考。
此外，NGS技术还可以通过筛查患者、亲属和群体中潜在的致病基因变异，为基因治疗和基因编辑提供有力支持。
值得注意的是，NGS技术在疾病诊断医学中的应用还面临一些挑战和障碍。
首先，NGS技术的数据处理和分析需要强大的计算和存储能力，这对医疗机构的硬件设施和人员技术素养提出了要求。
其次，如何对庞大的基因组数据进行准确解读和诊断，仍然是一个亟待解决的问题。
高通量测序基础知识
高通量测序基础知识简介陆桂什么是高通量测序？高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。
什么是Sanger法测序（一代测序）Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。
直到掺入一种链终止核苷酸为止。
每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。
终止点由反应中相应的双脱氧而定。
每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing）全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。
通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。
什么是de novo测序de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。
转录组学主要技术及其应用研究
转录组学主要技术及其应用研究转录组学是研究细胞或组织中转录产物（RNA）在一定时间和空间范围内的全面表达的一门学科。
它通过测定和分析RNA的种类和数量来揭示基因调控的差异和发生的机制。
转录组学技术包括深度测序、微阵列和实时定量PCR等，这些技术在生物医学研究、农业生物技术和环境学等领域中应用广泛。
深度测序（RNA-seq）是目前应用最广泛的转录组学技术之一、它利用高通量测序技术对细胞或组织中的RNA进行全面测序，可以获得转录本的序列和表达水平。
通过比较不同条件下的RNA-seq数据，可以鉴定和分析差异表达基因，揭示基因调控的变化和潜在的生物学过程。
此外，RNA-seq还可以用于发现新的转录本、分析剪接异构体、检测非编码RNA等。
微阵列技术是另一种常用的转录组学技术。
它基于DNA微阵列芯片的原理，将大量的探针固定在芯片上，用来捕获和检测RNA分子。
通过测量特定的转录本与相应探针的结合程度，可以得到转录本的相对表达水平。
微阵列技术具有高通量、高平行性和灵敏度的优势，可以同时分析成百上千个基因的表达。
实时定量PCR（qPCR）是一种准确而灵敏的测定RNA表达水平的技术。
它通过引入荧光染料和PCR反应循环的监测，可以实时检测并定量RNA分子的数量。
qPCR可以精确测量低丰度的RNA分子，具有快速、高通量和高灵敏度等特点，常用于验证和定量RNA-seq和微阵列的结果。
转录组学技术在许多领域中得到了广泛的应用。
在生物医学研究中，转录组学技术可以用于鉴定与疾病相关的基因和调控网络，揭示疾病发生发展的分子机制。
例如，通过对疾病组织和健康组织的转录组进行比较，可以发现疾病标志物和治疗靶点。
转录组学技术还可以用于研究肿瘤的发生发展机制和预后评估。
在环境学领域，转录组学技术可以用于研究环境污染对生物体的影响。
通过分析转录组数据，可以发现受污染环境下的生物体的代谢途径和信号通路发生的变化，评估环境污染的影响和危害程度。
测序技术大比拼
测序技术大比拼深度测序技术（Deepequencingtechnology）可能很快就能和现有的某些芯片技术一较高下了。
但目前科研界对这两项技术前景的看法并不一致，究竟哪种技术更好，应用范围更广泛还没有定论。
两款新型测序仪——Polonator与HeliScop新型测序技术平台多样化的市场市场大角力新旧测序技术整合效应测序设备公司的“钱景”更新一代测序技术前景如何呢？两款新型测序仪——Polonator与HeliScop新一代测序技术（Ne某t-generationequencing,NGS）正以它强大的测序能力风靡整个科研界。
仅仅2022年，就有两款全新型测序仪面世，一款是美国DanaherMotion公司推出的Polonator，另一款是美国Helico 公司的HeliScop。
与其它新一代测序仪一样，这两款测序仪也因其测序快速、测序费用低廉而备受好评，也因此被测序界誉为革命性的、突破性的成果。
这两款产品不仅能实现人们期待已久的个体基因诊断和个体化用药治疗，更有分析家认为，它们将取代功能类似的芯片类产品。
Polonator测序仪HeliScope单分子测序仪2新型测序技术平台自从2005年454LifeScience公司（2007年该公司正式被Roche收购）推出了454FL某焦磷酸测序平台（44FL某pyroequencingplatform）以来，曾推出过3730某lDNA测序仪（3730某lDNAAnalyzer）的AppliedBioSytem（ABI）这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了，因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列（eriecapillaryarrayelectrophoreiequencingmachine）遇到了两个强有力的竞争对手，一个是2006年美国Illumin公司推出的Sole某a基因组分析平台（GenomeAnalyzerplatform），另一个是2007年ABI公司推出的新产品SOLiD测序仪（见表1）。
tngs检测技术原理
tngs检测技术原理TNGS（Targeted Next-Generation Sequencing）检测技术是一种高通量测序技术，能够对特定基因区域进行深度测序，从而实现对个体基因组的全面分析。
本文将从TNGS检测技术的原理、应用以及优缺点等方面进行阐述。
一、TNGS检测技术的原理TNGS检测技术主要基于Illumina测序平台，通过将目标DNA片段进行多轮PCR扩增，得到大量的DNA片段。
然后将这些DNA片段连接到测序芯片上，并进行测序反应。
测序过程中，通过使用荧光标记的碱基，以及逐个碱基加入的方式，可以逐一确定DNA序列。
最后，通过计算机分析和拼接这些碱基的信息，就能够得到目标基因区域的DNA序列信息。
二、TNGS检测技术的应用1. 遗传病检测：TNGS检测技术可以对多个与遗传病相关的基因进行测序，从而快速准确地诊断患者的遗传病风险。
2. 癌症基因变异检测：通过对癌症相关基因进行测序，可以发现患者体内的致病基因变异，为癌症的早期预防和治疗提供依据。
3. 感染病原体检测：通过对感染病原体的基因进行测序，可以准确鉴定感染源，指导临床治疗。
4. 个体基因组分析：通过对个体基因组的测序，可以了解个体的遗传特征，为个性化医学提供基础数据。
三、TNGS检测技术的优缺点1. 优点：（1）高通量：TNGS技术可以同时对成千上万个基因进行测序，大大提高了测序效率和吞吐量。
（2）高灵敏度：由于对目标基因区域进行深度测序，TNGS技术能够检测到低频突变，提高了检测的灵敏度。
（3）高准确性：TNGS技术经过多轮PCR扩增和测序反应，可以减少测序错误率，提高测序的准确性。
（4）多样性：TNGS技术可以同时对多个样本进行测序，适用于大规模研究和临床应用。
2. 缺点：（1）数据分析复杂：TNGS技术产生的数据量大，数据分析和解读需要专业的生物信息学分析工具和技术支持。
（2）成本较高：与传统测序技术相比，TNGS技术的设备和试剂成本较高，限制了其在临床应用中的推广。
测序深度计算
探究测序深度计算的方法与应用随着生物技术的不断发展，测序深度的计算在生物学研究中扮演着越来越重要的角色。
测序深度的合理计算能够为我们提供精准、有效的数据，从而使我们能够更好地了解生物体的基因组结构、功能和演化等方面的信息。
本文将从测序深度的定义、计算和应用三个方面介绍测序深度的相关知识。
第一部分：测序深度的定义测序深度即指在进行某个基因组或者DNA样本的测序时，采用的测序技术（如Illumina、PacBio等）所得到的每一个位置的核苷酸的覆盖次数。
例如，对于一个1000bp的序列，采用Illumina测序技术进行测序，如果得到了10000条序列，并且每个位置都至少被测序过了10次，那么测序深度就是10x。
第二部分：测序深度的计算测序深度的计算是十分重要的，常见的算法有如下三种：1.通过N50长度计算测序深度N50长度是指将序列按照长度排序，从最长的序列开始加和，直到加和值占总长度50%的那个序列长度，该长度就是N50长度。
假设我们测序了一个长度为1GB的基因组，N50长度为10KB，那么每个位置的测序深度就是1GB/10KB=100x。
2.通过比对计算测序深度将测序得到的短序列（reads）比对到参考基因组上，计算每个位置的测序深度。
这种算法准确性较高，但需要占用较多的运算资源。
3.通过组装计算测序深度将测序得到的短序列组装成长序列，再将组装后的序列比对至参考基因组上，计算每个位置的测序深度。
这种算法准确性较高，但需要占用较多的存储资源。
第三部分：测序深度的应用测序深度的应用广泛，尤其是在基因组学、转录组学等领域。
下面列举几个常见的应用场景：1.基因组和转录组的组装：通过测序深度，我们可以更准确地拼接出基因组或转录组的长序列；2.SNP检测：在分析基因型的过程中，测序深度可以帮我们识别出单核苷酸多态性（SNP）位点；3.表达谱分析：通过对转录组进行RNA测序，并结合测序深度，可以更好地分析基因的表达情况。
深度测序技术简介
Brain
118 162 85 73 91 48 266 217 91 10
0 46 41 0 8 0 240 51 716 132
UHR
861 163 35
0 96 0 271 1538 0 10 113 799 12 42 346 59 81 0 0 69
Symbol Gene Description
SNV： Single Nucleotide Substitution Variant
DIGITAL EXPRESSION PROFILING（1）： 人大脑组织与UHR（UNIVERSAL HUMAN REFERENCE）的表达差异
Tag Sequence GATCAAACCAAGGCCCAGGC GATCACTGTTAATGATTTGC GATCAGTGTCTTTTCAGCAC GATCATCATGACCAATGAAA GATCATGCTGGCTGCAAAGA GATCCAAACCCAAGTCTTGA GATCCAAGATAAAGAAGGCA GATCCCAGACTGGTTCTTGA GATCCCCAATTGACTCAGAG GATCCGGGGCTGCAGGCTTG GATCCTACAGAAGTGGAGCT GATCCTAGTAATTGCCTAGA GATCCTGCGGGAGTCTCCCG GATCCTGTGAAGGCCTGGAA GATCGAGACACGTGATGGGA GATCGAGGACAGTGCAACCA GATCTCAATGCCAATCCTCC GATCTGCACGCCGCTGACCC GATCTGTGCCCAGAGATGGG GATCTGTGGAGAATGTACAC
UBB Ubiquitin B RING1 Ring finger protein 1 DIRAS2 DIRAS family, GTP-binding RAS-like 2 PHF20 PHD finger protein 20
超广谱二代深度测序技术
超广谱二代深度测序技术高通量测序技术（High-throughput Sequencing）是一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，又称下一代测序技术（Next-Generation Sequencing）、二代测序技术，其使得可对一个物种的基因组和转录组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序（Deep Sequencing）。
第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing By Synthesis），即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现在广泛应用的二代测序仪供应商主要为Illumina和Life Tech （Thermo Scientific）。
Illumina美国Illumina公司自2006年进军基因测序市场以来，陆续发布了HiSeq、MiSeq、NextSeq等一系列测序仪器。
（Illumina公司的各型号测序仪）测序方法采用边合成边测序的方法，基于专有的可逆终止化学反应原理。
测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flowcell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。
然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。
（Illumina测序原理）Life Tech（Thermo Scientific）美国Life Tech公司，现被Thermo Scientific（赛默飞）收购。
在2010年底推出了首款半导体测序仪Ion PGMTM，可配合使用不同的芯片，满足不同的通量需求，随后又推出了Ion Proton平台。
（Life Tech测序仪）测序基于半导体测序原理。
在半导体芯片上布满小孔，每一个小孔就是一个测序反应池，当一个被单克隆序列覆盖的磁珠进入小孔后，开始测序反应：按照顺序依次流经四种碱基，当发生碱基插入时，便有H离子的释放，从而引起小池内的PH的变化，PH的变化被反应池下面的感应器所感应，依次引起电势和电压的变化，然后最终被转换为碱基信息。
RNA-seq技术原理及应用
Illumina/Solexa 测序技术的基本原理是边合成边 测序，即测序过程是以 DNA 单链为模板，在生成 互补链时，利用带荧光标记的 dNTP 发出不同颜色 的荧光来确定不同的碱基。 新加入 dNTP 的末端被可逆的保护基团封闭，既 保证单次反应只能加入一个碱基，又能在该碱基读 取完毕后，将保护基团除去，使得下一个反应可继 续进行。为了增加荧光强度，使之更易被成像系统 所采集，该技术在测序之前还需要对待测片板扩增
序列组装和比较
1
图像获得和处理
TGCT…
簇序列读取反应
2
3
TTTT…
4
RNA-seq实验流程图
为了便于测序数据的发布和共享，高通量测序数据以 FASTQ 格式来记录所测的碱基读段和质量分数。 NCBI、EBI、 DDBJ 等数据中心建立了大容量的数据库 SRA来存放共享的测 序数据。
SHRiMP、Mosaik）。
2. 基因表达水平估计 RNA-seq 数据最基本的应用是检测基因的表达水 平 ，与基因芯片数据相比 ，RNA 测序得到的是数字 化的表达信号，具有灵敏度高、分辨率高、无饱和区 等优势。 RNA 测序数据是对提取出的 RNA 转录本中随机 进行的短片段测序，如果一个转录本的丰度高，则测 序后定位到其对应的基因组区域的读段也就多，可以 通过对定位到基因外显子区的读段计数来估计基因表 达水平。
3. 选择性剪接事件识别和剪接异构体表达水平推断 只要测序深度足够深，就能检测到所有转录本的全 部序列，包括来自剪接接合区的序列。Tophat 等软件 定位剪接接合区读段的策略能标定出剪接事件中的两 个剪接位点：供体位点和受体位点。通过比较供体位 点和受体位点的组合，就能识别选择性剪接事件。 进一步，通过对供体和受体位点的读段计数，结合 外显子其他区域的读段数据，还能定量地计算选择性 剪接事件之间的比例。
核糖体印记与深度测序技术
1. 核糖体印记与深度测序技术将核糖体图谱（ribosome profiling ）和深度测序（deep sequencing ）相结合，研究人员可以从基因组水平监测蛋白质的翻译状况。
深度测序的强大功能对生物学研究的各个领域都产生了极大的影响。
在诸如全基因组测序等方面，新技术的高效性和经济性使人们得以以一种以前无法想象的方式进行试验研究。
而在另一些情况下，例如RNA 测序时，借助深度测序可以进行更多的定量分析，获得更大的动态范围。
在另一些研究中，例如最近由美国加州大学（University of California ）的Jonathan Weissman 小组发表的有关翻译图谱（translational profiling ）的研究中报道的那样，深度测序不仅是一个有效的定量手段，同时还能提供很多有用的新信息。
使用核酸酶消化mRNA 时，在翻译过程中发挥作用的核糖体结合并保护了大约30bp 的mRNA 片段。
Weissman 等人将细胞中这些被保护的mRNA 片段构建成DNA 文库，再使用Illumina 公司的测序仪对文库中所有的片段进行测序，最终得到了一幅有关细胞中蛋白质翻译情况的完整“画卷”。
这种方法可以应用于很多方面。
首先，它能广泛地用于蛋白质组研究当中。
正如Weissman 说道的那样，“对于像人类一样复杂的基因组，你真的无法解释清楚细胞表达出来的多肽是什么。
而这种新方法刚好给了你一个客观的、全面的机会去弄清楚这些多肽。
”现在，Weissman 等人正在使用这种新方法研究酵母，因为酵母比较简单，同时也被研究得比较透彻，因此相对来说比较容易研究。
但是从理论上来说，该方法是可以应用到其它任何一种物种中的。
另外，将该技术与标记有抗原表位的核糖体（epitope-tagged ribosomes ）结合使用，还有可能用于研究组织特异性的蛋白质翻译（tissue-specific translation ）。
深度解析DNA测序技术
深度解析DNA测序技术DNA测序技术是一种可以解析人类基因组的技术，是现代生物学和医学领域中不可或缺的技术之一。
随着技术的不断发展和更新，测序技术也在不断地更新和进步。
DNA简介在讲解DNA测序技术之前，我们需要认识DNA。
DNA即为脱氧核糖核酸，是人类细胞中最重要的一种物质，负责储存和传递生命信息。
DNA分为两个互补的链，每个链都是由四种氮碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，这四种氮碱基的排列顺序就决定了一个基因的密码，进而控制人的生长、发育和功能。
测序技术DNA测序技术的本质就是利用不同的方法对DNA碱基序列进行分析。
最早的DNA测序技术是1960年代由Frederick Sanger发明的“Sanger测序法”，它是一种化学方法，通过不断地克隆DNA 分子，构建完整的DNA序列。
此后，新的测序方法不断涌现，其中较为重要的包括荧光检测法、平台化测序技术、第三代单分子测序技术等，每个方法都有其自身的优缺点。
Sanger测序法Sanger测序法是早期的一种测序技术，其原理是通过DNA聚合酶将一个小段DNA序列合成成DNA链，然后通过一系列的特殊试剂和化学反应将其分割成碱基的单一链，最后将其通过凝胶电泳分离，从而得到一条完整的DNA序列条带图谱。
该方法由于需要不断的克隆并测序，需要较长的时间才能完成，但其准确性较高，是分析小于1000bp的DNA序列的较好选择。
荧光检测法荧光检测法采用的是大规模高通量并行测序技术，在该技术中将长链DNA分开，并通过对称DNA模板和噬菌体载体辅助快速扩增，大规模形成DNA拷贝段进行并行测序，同时在之后的测序过程中，将dNTP分为多种不同颜色进行荧光标记，将这些信息进行解析并还原成DNA序列POS信息，即可得到整体的DNA序列图谱。
其优势在于测序速度较快，可高通量测序，缺点是在复杂物种中准确度略有降低。
平台化测序技术平台化测序技术是基于固定阵列测序和DNA纳米孔测序，即将设备视为整个平台，通过对这个平台上的每个工作流程进行大规模的开发和调整，从而提高设备的测序效率。
基因深度测序技术的分析和应用
基因深度测序技术的分析和应用近年来，基因深度测序技术的发展迅速而广泛应用，它以其高精度、高通量、高速度和低成本，成为了现代生物学研究中的一项重要工具。
基因深度测序技术可以对基因组进行比对、重组、注释等深度分析和挖掘，应用广泛，包括人类疾病基因研究、农业生产和生态环境研究等多个领域。
一、基因深度测序技术的原理与流程基因深度测序技术主要是利用高通量测序平台对DNA分子进行测序。
DNA测序可以基于不同的原理，其中Sanger测序(链颠法)是首个开发成功的DNA测序技术。
Sanger测序包括PCR扩增、DNA片段纯化、终止淋巴中产生的链断裂等步骤，测序结果的读取主要依靠荧光信号。
但是Sanger测序技术成本较高、测序长度限制、支持低通量和低深度覆盖，因此无法满足现代基因组学、转录组和蛋白质组学的需求。
基于通过亚硝酸盐防止DNA链扩增的技术的开发，第二代测序技术应运而生。
相较于Sanger测序，第二代测序技术具有高通量、高效率和低成本的优势。
第二代测序可以分为两大类：一种是基于桥式PCR扩增的技术，如Illumina(爱伦贝格)和454(罗威)平台；另一种是基于逆转录-差旋转链扩增(Pyrosequencing)的技术，如Ion Torrent(离子商)和SOLiD (软银)平台。
第三代单分子测序技术的出现，如PacBio(鲨鱼基因)和Oxford Nanopore即将推出的MinION /PromethION平台提供了长读长和高精度的测序，因此被大量应用于基因组学研究。
不同平台的基因测序分析技术都有不同的特点，一般包括以下步骤：DNA样本制备、文库构建、装载和预处理、测序、数据分析和解读。
二、基因深度测序技术在医学领域的应用在医学领域，基因深度测序技术被广泛应用于癌症、遗传病和疾病基因分析等领域。
基因组测序已经成为了一种能够帮助诊断各种疾病的有力工具。
例如，癌症研究重点在于发现肿瘤和正常基因组之间的差异，在基因测序的分析过程中，研究人员可以更加详细地了解肿瘤的基因组结构和特征，帮助确定肿瘤的分子级别和疗法选择。
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REVERSIBLE TERMINATOR CHEMISTRY 可逆终止反应
• All 4 labelled nucleotides in 1 reaction
O HN O PPP 3’ O N
cleavage fluor site
O 5’ DNA O HN O O N
X
block
454 SEQUENCING： EMULSION PCR (EMPCR)
A
+ PCR Reagents + Emulsion Oil
B
Micro-reactors
Adapter carrying library DNA Mix DNA Library & capture beads (limited dilution)
118 162 85 73 91 48 266 217 91 10 0 46 41 0 8 0 240 51 716 132
UHR
861 163 35 0 96 0 271 1538 0 10 113 799 12 42 346 59 81 0 0 69
Symbol
RPL29 PRDX2 PFN2 STMN4 COX5B GABRA1 UBB RING1 DIRAS2 PHF20 IGJ FN1 NFIX TOP2A KRT8 ITGB7 BASP1 DRD1IP GFAP APLP2
454 SEQUENCING： DEPOSITION OF DNA BEADS INTO THE PICOTITER™PLATE
Load Enzyme Beads
Load beads into PicoTiter™Plate
Centrifuge Step
Illumina Solexa 合成测序 Sequence by Synthesize 基本原理
SNV： Single Nucleotide Substitution Variant
DIGITAL EXPRESSION PROFILING（1）： 人大脑组织与UHR（UNIVERSAL HUMAN REFERENCE）的表达差异
Tag Sequence GATCAAACCAAGGCCCAGGC GATCACTGTTAATGATTTGC GATCAGTGTCTTTTCAGCAC GATCATCATGACCAATGAAA GATCATGCTGGCTGCAAAGA GATCCAAACCCAAGTCTTGA GATCCAAGATAAAGAAGGCA GATCCCAGACTGGTTCTTGA GATCCCCAATTGACTCAGAG GATCCGGGGCTGCAGGCTTG GATCCTACAGAAGTGGAGCT GATCCTAGTAATTGCCTAGA GATCCTGCGGGAGTCTCCCG GATCCTGTGAAGGCCTGGAA GATCGAGACACGTGATGGGA GATCGAGGACAGTGCAACCA GATCTCAATGCCAATCCTCC GATCTGCACGCCGCTGACCC GATCTGTGCCCAGAGATGGG GATCTGTGGAGAATGTACAC Brain
2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号 3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序 反应
T C
G A T
5’
Base calling from the raw data TG C TAC GAT …
1 2 3 4 5 6
7
8
9
TTTTTTTGT…
The identity of each base of a cluster is read off from sequential images 根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相 应的DNA序列
Gene Description
Ribosomal protein L29 Peroxiredoxin 2 Profilin 2 Stathmin-like 4 Cytochrome c oxidase subunit Vb Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, alpha 1 Ubiquitin B Ring finger protein 1 DIRAS family, GTP-binding RAS-like 2 PHD finger protein 20 Immunoglobulin J polypeptide Fibronectin 1 Nuclear factor I/X (CCAAT-binding transcription factor) Topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa Keratin 8 Integrin, beta 7 Brain abundant, membrane attached signal protein 1 Dopamine receptor D1 interacting protein Glial fibrillary acidic protein Amyloid beta (A4) precursor-like protein 2
切除荧光基团
第二轮探针连接，检测荧光
切除荧光基团 每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序引物读取的序列是不完整的
连接法测序 （二）
测序引物沿着Adapter移动5次，确保每个位点都被检测
连接法测序 （三）
0位置是Adapter的最后一个碱基，因此只检测一次， 该碱基是进行解码所必须的。
Solexa 测序 Workflow
ABI SOLiD 连接法测序 Sequence by Ligation 基本原理
ABI SOLID测序技术
2010年末又发布了最新产品--SOLiD 5500xl测序 平台。 SOLiD 5500xl含有两张微流体芯片（microfluidic FlowChip），每张芯片含有6条相互独立的运行通 道（run lane）。每条lane都能运行相对独立的测 序反应，这样的设计使得SOLiD 5500xl测序平台 极具灵活性。最大测序读长为75nt，同样支持 Fragment、b（使用最新设计 的nanobeads）。测序的系统准确性能达到 99.99%
ILLUMINA SOLEXA测序技术
Illumina公司于2007年初花费6亿美金巨资收 购了Solexa, 2010年初，Illumina将其第二代测 序仪Genome Analyzer IIx升级到HiSeq 2000 HiSeq 2000含有两张Flow cell，可同时运行或 者只运行其中一张。读长为100nt，同时支持 Fragment、量（读长为 2x100nt）。
Create “Water-in-oil” emulsion
Adapter complement
Enrich Anneal Seq primer “Break micro-reactors” Isolate DNA containing beads Perform emulsion PCR
Generation of millions of clonally amplified templates on each bead No cloning and colony picking
深度(高通量）测序技术简介 NEXT GENERATION SEQUENCING
Sample fragmentation Library preparation Sequencing reaction Data analysis
Roche 454 焦磷酸测序 Pyrophosphate Sequencing
Incorporation Detection Deblock; fluor removal
3’ OH free 3’ end
Next cycle
SEQUENCING-BY-SYNTHESIS (SBS)
3’ 5’
Cycle 1: Add sequencing reagents First base incorporated Remove unincorporated bases
CLONAL SINGLE MOLECULE ARRAYS 单分子克隆 Attach single molecules to surface
Amplify to form clusters Prepare DNA fragments Ligate adapters
Sequence ~1000 molecules per ~ 1 µ m cluster ~1000 clusters per 100 µ m square ~40 million clusters per experiment
Solid line： at least one read Dashed line：at least 20 reads
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Analysis of percentage of reads containing known coding region SNVs in the six tissue samples.
malignant pleural mesotheliomas (MPMs) ：恶性胸膜间皮瘤 pulmonary adenocarcinoma (ADCA)：肺腺癌
Transcriptome characteristics
Expression difference between
MPM and ADCA sample compare to a lung tissue control
Illumina Solexa 合成测序 Sequence by Synthesize
ABI SOLiD 连接法测序 Sequence by Ligation
Roche 454 焦磷酸测序 Pyrophosphate Sequencing 基本原理