深度测序技术简介

高度自动化的系统 读取片段多，适合进行大量小片段的测序，如microRNA profiling 基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号衰减，读取序列较短，给de novo sequencing 拼接带来困难
SOLiD sequencing


每个碱基读取两次非常高的准确性，特别是对于SNP的检测 灵活的系统，完善的磁珠编码系统，可以进行样品的pooling，分割测序区域 读取长度受连接反应的轮数限制，给de novo sequencing 拼接带来困难
ADVANTAGE & DISADVANTAGE
454 sequencing

读取长度大，400bp 可以对未知基因组进行从头测序de novo sequencing 当遇到polymer时，如AAAAAA等，荧光强度和碱基个数不成线性关系，判定重复 碱基个数有困难
Solexa sequencing

CLONAL SINGLE MOLECULE ARRAYS 单分子克隆 Attach single molecules to surface
Amplify to form clusters Prepare DNA fragments Ligate adapters
Sequence ~1000 molecules per ~ 1 µ m cluster ~1000 clusters per 100 µ m square ~40 million clusters per experiment
A T G C G C A G A T G C T T A C G A T A C C C G A
Detect signal Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat
C T
1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可 以被去除的阻断基团
高通量测序的应用



De novo 测序 基因深度测序（genome re-sequencing） 转录组深度测序（transcriptome re-sequencing） Digital expression profiling ChIP-seq Methy-seq
Transcriptome resequencing：
Create “Water-in-oil” emulsion
Adapter complement
Enrich Anneal Seq primer “Break micro-reactors” Isolate DNA containing beads Perform emulsion PCR
Generation of millions of clonally amplified templates on each bead No cloning and colony picking
20 microns
REVERSIBLE TERMINATOR CHEMISTRY 可逆终止反应
• All 4 labelled nucleotides in 1 reaction
O HN O PPP 3’ O N
cleavage fluor site
O 5’ DNA O HN O O N
X
block

文库制备：微珠单分子克隆
SOLiD 利用探针的连接反应读取模板的DNA序列
1024种8碱基探针 4色荧光，4种双核苷酸，每色荧光有256个探针(4^6)
绿宇生物科技 专业建库 测序 QQ:110199525
http://www.gbio.cn
连接法测序 （一）
测序引物与adapter退火
探针连接，检测荧光
Illumina Solexa 合成测序 Sequence by Synthesize
ABI SOLiD 连接法测序 Sequence by Ligation
Roche 454 焦磷酸测序 Pyrophosphate Sequencing 基本原理
ROCHE 454测序技术
边合成边测序（sequencing by synthesis） 454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购 目前，Roche 454 GS FLX Titanium每次运行能 产生100万条序列，平均读长能达到400nt， 且第400个碱基的准确率能达到99%。一次运 行所需时间为10小时，能获得4-6亿个碱基的 序列信息。

454 SEQUENCING： EMULSION PCR (EMPCR)
A
+ PCR Reagents + Emulsion Oil
B
Micro-reactors
Adapter carrying library DNA Mix DNA Library & capture beads (limited dilution)
Gene Description
Ribosomal protein L29 Peroxiredoxin 2 Profilin 2 Stathmin-like 4 Cytochrome c oxidase subunit Vb Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, alpha 1 Ubiquitin B Ring finger protein 1 DIRAS family, GTP-binding RAS-like 2 PHD finger protein 20 Immunoglobulin J polypeptide Fibronectin 1 Nuclear factor I/X (CCAAT-binding transcription factor) Topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa Keratin 8 Integrin, beta 7 Brain abundant, membrane attached signal protein 1 Dopamine receptor D1 interacting protein Glial fibrillary acidic protein Amyloid beta (A4) precursor-like protein 2
118 162 85 73 91 48 266 217 91 10 0 46 41 0 8 0 240 51 716 132
UHR
861 163 35 0 96 0 271 1538 0 10 113 799 12 42 346 59 81 0 0 69
Symbol
RPL29 PRDX2 PFN2 STMN4 COX5B GABRA1 UBB RING1 DIRAS2 PHF20 IGJ FN1 NFIX TOP2A KRT8 ITGB7 BASP1 DRD1IP GFAP APLP2
Solexa 测序 Workflow
ABI SOLiD 连接法测序 Sequence by Ligation 基本原理
ABI SOLID测序技术
2010年末又发布了最新产品--SOLiD 5500xl测序 平台。 SOLiD 5500xl含有两张微流体芯片（microfluidic FlowChip），每张芯片含有6条相互独立的运行通 道（run lane）。每条lane都能运行相对独立的测 序反应，这样的设计使得SOLiD 5500xl测序平台 极具灵活性。最大测序读长为75nt，同样支持 Fragment、Pair-end和Mate-Paired文库。单次运 行能得到的最大数据量为300Gb（使用最新设计 的nanobeads）。测序的系统准确性能达到 99.99%
Incorporation Detection Deblock; fluor removal
3’ OH free 3’ end
Next cycle
SEQUENCING-BY-SYNTHESIS (SBS)
3’ 5’
Cycle 1: Add sequencing reagents First base incorporated Remove unincorporated bases
ຫໍສະໝຸດ Baidu
Solid line： at least one read Dashed line：at least 20 reads
Analysis of percentage of reads containing known coding region SNVs in the six tissue samples.
ILLUMINA SOLEXA测序技术
Illumina公司于2007年初花费6亿美金巨资收 购了Solexa, 2010年初，Illumina将其第二代测 序仪Genome Analyzer IIx升级到HiSeq 2000 HiSeq 2000含有两张Flow cell，可同时运行或 者只运行其中一张。读长为100nt，同时支持 Fragment、Pair-end和Mate-Paired文库。每次 运行最多可产生200 GB的数据量（读长为 2x100nt）。
深度(高通量）测序技术简介 NEXT GENERATION SEQUENCING

Sample fragmentation Library preparation Sequencing reaction Data analysis
Roche 454 焦磷酸测序 Pyrophosphate Sequencing
2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号 3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序 反应
T C
G A T
5’
Base calling from the raw data TG C TAC GAT …
1 2 3 4 5 6
7
8
9
TTTTTTTGT…
The identity of each base of a cluster is read off from sequential images 根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相 应的DNA序列
切除荧光基团
第二轮探针连接，检测荧光
切除荧光基团 每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序引物读取的序列是不完整的
连接法测序 （二）
测序引物沿着Adapter移动5次，确保每个位点都被检测
连接法测序 （三）
0位置是Adapter的最后一个碱基，因此只检测一次， 该碱基是进行解码所必须的。
SNV： Single Nucleotide Substitution Variant
DIGITAL EXPRESSION PROFILING（1）： 人大脑组织与UHR（UNIVERSAL HUMAN REFERENCE）的表达差异
Tag Sequence GATCAAACCAAGGCCCAGGC GATCACTGTTAATGATTTGC GATCAGTGTCTTTTCAGCAC GATCATCATGACCAATGAAA GATCATGCTGGCTGCAAAGA GATCCAAACCCAAGTCTTGA GATCCAAGATAAAGAAGGCA GATCCCAGACTGGTTCTTGA GATCCCCAATTGACTCAGAG GATCCGGGGCTGCAGGCTTG GATCCTACAGAAGTGGAGCT GATCCTAGTAATTGCCTAGA GATCCTGCGGGAGTCTCCCG GATCCTGTGAAGGCCTGGAA GATCGAGACACGTGATGGGA GATCGAGGACAGTGCAACCA GATCTCAATGCCAATCCTCC GATCTGCACGCCGCTGACCC GATCTGTGCCCAGAGATGGG GATCTGTGGAGAATGTACAC Brain
454 SEQUENCING： DEPOSITION OF DNA BEADS INTO THE PICOTITER™PLATE
Load Enzyme Beads
Load beads into PicoTiter™Plate
Centrifuge Step
Illumina Solexa 合成测序 Sequence by Synthesize 基本原理
malignant pleural mesotheliomas (MPMs) ：恶性胸膜间皮瘤 pulmonary adenocarcinoma (ADCA)：肺腺癌
Transcriptome characteristics
Expression difference between
MPM and ADCA sample compare to a lung tissue control