实验9.3 Red ET同源重组2015.3.25

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RedET同源重组技术概述

RedET同源重组技术概述RedET同源重组技术是一种利用酵母宿主的遗传重组系统，将目标基因在酵母中进行同源重组而得到转基因株系的技术。

该技术在生物医学和生物工程领域具有广泛的应用前景。

本文将对RedET同源重组技术进行概述并介绍其原理、应用以及存在的问题。

RedET同源重组技术的原理基于酵母自然发生的同源重组机制。

酵母是一种单细胞真核生物，其核糖体RNA和转录因子与哺乳动物的细胞中类似，使得酵母成为一种理想的宿主，用于表达复杂蛋白质的研究和生产。

在RedET同源重组技术中，采用了遗传重组系统来介导目标基因与酵母染色体发生同源重组，从而实现目标基因的插入和表达。

RedET同源重组技术的核心是一种诱导目标基因与酵母染色体同源重组的DNA修复机制。

该修复机制主要基于酵母中两个DNA重组酶RecE和RecT的相互作用。

RecE酶在酵母中识别并切割目标基因与酵母染色体之间的同源序列，形成单链切口。

然后RecT酶结合在切口上，介导目标基因与酵母染色体的DNA重组。

最后，通过酵母DNA修复机制，目标基因与酵母染色体实现了同源重组，并插入到酵母基因组中。

RedET同源重组技术具有广泛的应用领域，尤其在基因工程和蛋白表达中具有重要作用。

首先，该技术可以用于基因敲除和基因座替换，为基因功能研究提供了有效的手段。

其次，RedET同源重组技术也可以用于构建表达突变蛋白或蛋白片段的酵母株系，用于蛋白结构和功能研究。

此外，通过RedET同源重组技术，还可以构建酵母株系用于产生异源重组蛋白，并通过大规模筛选酵母株系实现高效蛋白生产。

然而，RedET同源重组技术在应用过程中也存在一些问题和局限性。

首先，该技术的目标基因与酵母染色体之间需要具有足够的同源性，这对于异源基因的插入造成了一定的限制。

其次，RedET同源重组技术在染色体插入位置的选择性方面存在一定的限制，这可能影响目标基因的表达水平和稳定性。

此外，酵母株系在目标基因插入后可能会发生染色体结构的重组和重排，这可能会对酵母的生长和基因表达产生影响。

Red-ET同源重组技术主要内容与运用-生物技术论文-生物学论文

Red-ET同源重组技术主要内容与运用-生物技术论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——2001年人类基因组测序完成，基因中所含有的大量的功能信息越来越受到人们的关注。

为了解这些复杂的人类密码的含义，对单个基因功能的研究也显得越来越重要。

然而，对于真核生物基因片段而言，其序列中除了包含具有功能、能表达的外显子之外，还含有很多调控序列等内含子，如此一个基因片段则可能大至几十或上百Kb.虽然现今有相应的载体，如BAC（人工染色体）和PAC（P1人工染色体）能装载如此大量的基因信息，但是要找到这些基因片段的限制性内切位点，并在体外对其进行长距离的片段扩增的难度比较大[1、2].Red/ET重组技术是以传统的同源重组技术为基础，但是，相对于普通的同源重组技术而言，它具有简单、快速、高效等特点，而且整个重组过程不需要经过体外扩增阶段，这样可以避免外界环境引起的不必要的突变。

1 传统同源重组自然发生的同源重组是两个DNA分子之间进行片段交换，从而使序列重排。

1956年，在大肠杆菌中，A John Clark发现了两种与同源重组有关的酶，RacA和RecBCD.在同源重组发生的时候，RecA 结合DNA单链或双链，对双链DNA进攻，把原来配对的互补链分开，并尝试自身与被入侵DNA链配对。

当配对成功后，RecA蛋白脱落。

或者在RecBCD的引导下，使目标DNA解旋，以便使外源DNA分子插入并在RecA的帮助下进行重组。

当两条链发生重组时，会产生holliday中间体，该中间体在重组完成时由RuvAB和RecG蛋白进行拆分。

至此，形成两条含有异源序列的双链DNA.在质粒或噬菌体转入大肠杆菌的实验中，当同源区段小于75bp时会使重组率显着降低。

但是实际上，在RecA重组系统中，要求同源臂的长度在1kb左右，且反应条件要求比较苛刻。

2 Red/ET 同源重组技术Red/ET同源重组系统，其实是Red同源重组系统和ET同源重组系统的总称，其中ET系统于1998年由Stewart等在大肠杆菌中导的Rac噬菌体中发现，随后又在噬菌体中发现了Red系统。

RedET同源重组技术概述.pptx

引物设计方法
同源臂的长度在15～50bp时，重组效率就能满足实验要求，重组效率随着同源臂长度的增加而增加。
同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998）
源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体和插入片段的黏性末端（15-50bp）互补形成稳定的带缺刻的环状重组质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切酶活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B）（图片来自Subramanian et al. 2003）
Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶（Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。

实验93RedET同源重组XXXX325.pptx

力，增加电转化效率。
五、 Red/ET重组操作流程
引物设计合成
线性供体dsDNA 底物的制备
线性载体的制备
重组子筛选
重组产物转化至感受态细胞
重组子检测
重组反应
1. 设计合成引物
设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则，但是上下游引物要加上15-20bp的载体同源序列。载体同源序列如何添加主要分以下两种情况：（1）载体酶切后是5’端突出或平末端，则引物上的同源序列包括5’端突出序列的同源序列。（2）载体酶切后是3’端突出，则引物上的同源序列不包括3’ 端突出序列的同源序列。
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活DNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体

同源重组

同源重组同源重组（Homologous Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。

同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。

目录1简介2基因敲除1. 2.1 定义2. 2.2 技术路线3转移法4DNA1简介同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。

同源重组同源重组反应通常根据交叉分子或holliday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。

同源重组反应严格依赖DNA分子之间的同源性，100%重组的DNA分子之间的重组常见于非姐妹染色体之间的同源重组，称为Homologous Recombination，而小于100%同源性的DNA分子之间或分子之内的重组，则被称为Hemologus Recombination。

后者可被负责碱基错配对的蛋白如原核细胞内的MutS 或真核生物细胞内的MSH2-3等蛋白质“编辑”。

同源重组可以双向交换DNA分子，也可以单向转移DNA分子，后者又被称为基因转换（Gene Conversion)。

RedET同源重组技术概述(PPT 49页)

Red同源重组原理示意图
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) SC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、什么是Red/ET同源重组二、技术的特点三、作用机制四、功能元件五、操作流程及关键因素六、在基因工程中的主要应用七、新技术的发展八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持一个恰到好处的平衡，这样才能使生物体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
引物设计方法

RedET同源重组技术概述(PPT 49页)

• 染色体的遗传差异主要由两种机制产生，一种是突变，一种是遗传重组。
广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同
六、 Red/ET重组技术的主要应用
1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆（Subcloning） 4. 直接克隆（Direct cloning）
1. 重组质粒的构建
(1) 传统基因克隆技术的缺点
➢ 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切
酶的消化，当缺
少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，
降低模板对筛选工作带来的难度；
（1）纯化回收PCR产物；（2）内切酶消化处理模板；（3）使用R6K复制子。
3. 线性载体的制备
线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1）酶切
选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底，将导致阴性克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。 2）PCR扩增
“质粒多聚体”问题解决办法：
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式；利用RecE/RecT重组酶系统；
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因（Kan）替换pUC19中的氨苄抗性基因（Amp）
解决办法：采用“线性DNA+线性DNA”重组方式；利用RecE/RecT重组酶系统；减低质粒拷贝数。

red同源重组步骤

Red同源重装步骤1.制备BL21及HMS的red同源重组大肠杆菌。

(1)目前有pKD46质粒，BL21化学感受态，HMS174电击感受态。

(2)实验准备①LB液体培养基（无抗/氨苄抗性），LB固体培养基（4个），氨苄抗生素，甘油(3)实验操作①化学转化1)-80℃取出一只感受态（100ul），手指融化后插入冰上，放置5min。

2)在超净台内，加入2ul连接好的pKD46质粒，用手指轻柔的拨动使其混匀，然后插入冰中静置30min；3)42℃热激90s，重新插回冰中放置5min；4)在超净台内每支EP管中各加1mL的LB液体培养基，30℃、200rpm摇晃培养1h；5)然后在常温、3000rpm条件下，离心5min。

弃部分上清，留100μL左右留作吹悬，涂布在含有氨苄青霉素（）的LB固体培养基上，30℃倒置培养过夜。

6)次日，挑选合适大小的单菌落至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，加15%-30%甘油保菌，保存至-80℃冰箱中。

②电击转化1)-80℃取出一只感受态（100ul），手指融化后插入冰上，放置2min。

2)在超净台内，加入2ul连接好的pKD46质粒，用手指轻柔的拨动使其混匀，然后插入冰中静置2-3min；3)电击2500v后，立即加入提前预热好的培养基，30℃、200rpm摇晃培养1h；4)然后在常温、3000rpm条件下，离心5min。

弃部分上清，留100μL左右留作吹悬，涂布在含有氨苄青霉素（）的LB固体培养基上，30℃倒置培养过夜。

5)次日，挑选合适大小的单菌落至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，加15%-30%甘油保菌，保存至-80℃冰箱中。

2.red同源重组电击感受态制备(1)实验准备①泡酸：两个250mL锥形瓶，一个培养皿。

②灭菌：1)活化培养基25ml（1mL*3*2）2)50*2感受态培养基3)一个过滤L-阿拉伯糖的滤器4)100ml左右去离子水5)150ml左右15% 甘油（22.5mL甘油）6) 1.5ml ep管枪尖（黄枪尖要剪）50ml离心管*4③试剂：1)Amp 抗生素（）2)10M的L-阿拉伯糖（1.80g加入1.2ml水中，过滤。

RedET重组及其在生物医学中的应用解析

21卷 3 期 2005年 5 月生物工程学报Chinese Journal o f Biotechnology V ol. 21N o. 3May 2005R ed Π ET重组及其在生物医学中的应用R ed Π ET R ecombination and its Biomedical王军平13,张友明2W ANGJun 2Ping 13and ZH ANG Y ou 2Ming 211, 重庆 40003821基因桥研究室 , 11State K ey Laboratory o f , and Injury , Institute o f Combined Injury , College o f Preventive Medicine , The Third Military MedicalUniver sity , Chongqing 400038, 21G ene Bridge G mbH , Dresden 01307, G ermanyαβ系统而成立的 DNA 工程平台—摘要经过应用Rac噬菌体的RecEΠRecT和λ噬菌体的 Red Π Red ——Red Π ET重组 , 是一种不依靠于限制性内切酶的分子克隆新技术。

运用该技术能够介导PCR 产物或寡核苷酸对目标基因进行剪切、插入、交融及突变等多种操作, 在生物医学领域里拥有广阔的应用远景, 特别在基因组功能研究中对 BACs 、PACs 和细菌染色体的打靶修饰以及基因敲除动物DNA 靶分子的迅速建立等方面最有效。

跟着 Red Π ET重组的推行与应用 , 该技术自己也在不停被改进 , 在工作效率获取明显提升的同时 , 其操作也变得更为简单、省时、省力。

联合自己的一些研究结果 , 对 Red ΠET重组的技术特色、发显现状和在修饰 , BACs , 噬生物医学中的应用进行了详尽论述。

重点词Red ΠET重组 ,DNA菌体中图分类号Q78 文件表记码 A 文章编号100023061(20050320502205Abstract Red Π ET recombination , a powerful hom olog ous recombinationsystem based on the Red operon ofλ phage or RecEΠ RecT from Rac esph a gen , provid innovative approach for DNA engineering. Deletion , insertion and mutation can bequickly and precisely performed on the target gene mediated by RedΠ ET recombination with PCR derived DNA fragments or olig onucleoti 2des. This technical platform hasextensive applications in biomedical field including bacterial artificial chrom osome modification , gene knock 2out construction and genetic m odification of E . coli strains aswell as some other kinds of m icroorganisms. Recently , Red Πn ETwasrecombinatioim provedin several aspects so that it becomes m ore powerful and maneuverable. The characteristic and development of Red Π ET recombination and its biomedicalapplications were described in this review. K ey w ords Red Π ET recombination ,DNA m odification , bacterial artificial chrom osomes , phage跟着包含人类基因组计划在内的各样基因组测序工程的实行与达成, 以序列信息为基础的基因组功能研究随即成为生命科学领域的又一重要课题 [1] 。

同源重组PPT95页

一、同源重组（homologous recombination）
同源重组（homologous recombination）发生在两个同源DNA分子之间。真核细胞减数分裂过程中，同源染色体彼此配对，同源染色体DNA 片段发生交叉与互换。这是发生在真核生物中的同源重组。同源重组在接合、转导或转化后外源 DNA整合到细菌基因组中。Robin Holliday提出的遗传重组模型是人们从分子水平上认识重组的基础。
RecBCD的酶活性受重组热点Chi的调节。Chi位点大肠杆菌基因组中的一种不对称的8 bp核苷酸序列， 5′-GCTGGTGG-3′，Chi位点能够改变RecBCD的酶活性，它是大肠杆菌重组过程的必需组分，是重组的热点。一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其3’→5’外切酶活性受到抑制， 5’→3’外切酶活性被激活，由原来优先降解3’末端链，改变为只降解5’末端链。但是它的解旋酶活性未受到影响。 RecBCD酶活性变化的结果是产生3’ 末端带有Chi位点的ssDNA。
4. 大肠杆菌的遗传重组
通过遗传分析，在大肠杆菌细胞中已经发现了3种重组途径，即RecBCD、 RecE、RecF途径。以下步骤为这3种途径所共有：（1）产生一个具有3’－ OH末端的单链DNA片段；（2）单链DNA侵入其同源双链DNA分子；（3）形成Holliday中间体，并发生分支迁移；（4）内切核酸酶对中间体进行切割，连接后产生重组体；（5）三种重组途径均需要 RecA蛋白。
5. 真核细胞的同源重组
发生在减数分裂过程中的同源重组有两方面的重要作用。一是确保同源染色体能够正确配对，而同源染色体的联会是生殖细胞形成时染色体数目减半的基础。另外，减数分裂重组也常常引起非姊妹染色单体之间的交换，结果是亲本DNA分子上的等位基因在下一代发生了重新排列。

同源重组的克隆方法

同源重组的克隆方法**《同源重组的克隆方法》**嘿，朋友！今天我要跟你唠唠同源重组的克隆方法，这可是个超级厉害的技术哟！首先，咱们得搞清楚啥是同源重组。

这就好比是两个失散多年的双胞胎，突然在茫茫人海中找到了彼此，然后手拉手紧紧拥抱在一起。

在分子生物学里呢，就是两段有相似序列的 DNA 片段，它们就像那对双胞胎一样，能精准地连接在一起。

那开始咱们的第一步，准备工作得做好！就像你要出门旅行，得先把行李收拾妥当。

你得有要克隆的目标 DNA 片段，还有载体 DNA ，这载体就像是一辆小货车，负责把咱们的目标 DNA 拉到目的地。

还有各种酶，比如限制性内切酶，这玩意儿就像是一把小剪刀，能把 DNA 剪成咱们想要的片段。

然后呢，进入第二步，用限制性内切酶把目标 DNA 和载体 DNA 都剪一剪。

这时候你得小心，别剪错地方啦，不然就像你出门剪坏了衣服，那可就尴尬喽！剪完之后，就得到了有粘性末端的 DNA 片段。

接下来第三步，这可是关键的一步！把剪好的目标 DNA 和载体DNA 放在一起，就像让两个拼图的边缘对齐。

这时候，它们那些相似的序列，也就是同源序列，就开始发挥作用啦，它们会互相吸引，就像磁铁的两极。

然后在一些酶的帮助下，比如 DNA 连接酶，它们就紧紧地连接在一起，形成了一个重组的 DNA 分子。

第四步，把这个重组的 DNA 分子转到细菌或者其他细胞里，让它们帮咱们复制和表达。

这就好比是把种子种到地里，等着它发芽长大。

我跟你说，我自己刚开始弄这个的时候，那真是状况百出。

有一次我着急忙慌地做实验，结果把酶加错了，那感觉就像是上错了车，完全跑偏啦！还有一次，我不小心把 DNA 样本弄混了，搞得我自己都晕头转向，简直是一场灾难！但是别怕，只要咱们按照步骤，一步一步来，多练习几次，肯定能掌握这个同源重组的克隆方法。

最后再跟你强调一下哈，每一步都得细心，准备工作要充分，酶不能加错，操作的时候要稳准狠。

相信我，等你熟练掌握了这个方法，那感觉就像是拥有了一把神奇的钥匙，可以打开好多科学的大门！好啦，朋友，快去试试这个同源重组的克隆方法吧，祝你成功！。

实验同源重组PPT讲稿

λ噬菌体的pL操纵子示意图来自l phagegba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶（Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
实验同源重组课件
内容
一、什么是Red/ET同源重组二、技术的特点三、作用机制四、功能元件五、操作流程及关键因素六、在基因工程中的主要应用七、新技术的发展八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持
一个恰到好处的平衡，这样才能使生物体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切酶活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B）（图片来自Subramanian et al. 2003）
Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异

Red同源重组技术研究进展

Red 同源重组技术研究进展韩聪1,2张惟材1*游松2(1军事医学科学院生物工程研究所北京 100071 2沈阳药科大学沈阳 110016)摘要伴随着分子生物学的发展,一种基于噬菌体Red 重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。

Red 重组系统由三种蛋白组成:E xo 蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA 的末端,从5 端向3 端降解DNA,产生3 突出端;Beta 蛋白结合在单链DNA 上,介导互补单链DNA 退火;Gam 蛋白可与RecBC D 酶结合,抑制其降解外源DNA 的活性。

Red 同源重组技术具有同源序列短(40~60bp)、重组效率高的特点。

这种技术可在DNA 靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。

此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA 。

Red 同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。

关键词 Red 同源重组基因打靶基因工程收稿日期:2003 08 05 修回日期:2003 11 03*通讯作者,电子信箱zhangweicai@同源重组是基因工程实验中常用的技术手段,在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用。

常规的基因打靶技术是以Rec A 同源重组为基础,通常需要数百碱基甚至更长的同源序列,并且重组效率较低,更由于真核基因组中大量重复序列的存在,而导致意外重排现象的发生。

B AC 、PAC 、YAC 等克隆载体的构建为基因克隆提供了有力工具,但常规的克隆操作依赖于限制性酶切位点的存在,还需繁琐的连接、纯化步骤,大大限制了对大片段基因功能的研究。

近几年来,一种基于噬菌体Red 重组酶作用的同源重组技术逐渐成为基因工程研究的热点之一,并取得了一系列重要进展。

Red 同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有40~60bp 同源序列的PCR 片段导入宿主菌细胞,利用噬菌体Red 重组酶的作用,使导入细胞的线性DNA 片段与染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组,靶基因被标记基因置换下来(如图1所示)。

实验93RedET同源重组2015325

“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体和插入片段的黏性末端（15-50bp）互补形成稳定的带缺刻的环状重组质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体
DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删除、突变等；
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶（Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
• 染色体的遗传差异主要由两种机制产生，一种是突变，一种是遗传重组。

同源重组名词解释生物化学

同源重组名词解释生物化学同源重组啊，就像是生物化学世界里一场超级炫酷的基因派对。

你可以把基因想象成一群性格各异的小生物，它们在细胞这个大舞台上有着自己的生活。

同源重组就像是基因们的换衣游戏。

这些基因有着相似的部分，就像它们穿着款式差不多的衣服。

然后呢，它们突然决定互相交换一下衣服的某个部分，这一交换可不得了，就像把蓝色衣服上的口袋换到了红色衣服上，基因的功能可能就会发生奇妙的改变。

这过程就好比是一场精确的拼图游戏，但这个拼图是微观的、超级复杂的。

基因片段们要找到自己对应的那一块，而且误差只能在极小的范围内，就像在一堆几乎一模一样的小沙粒里找到特定的那一颗，夸张点说，这比在宇宙中找到一颗特定的星星还难。

有时候同源重组像是基因世界里的红娘。

如果有个基因有点小缺陷，在这个大派对里，它可以通过同源重组找到自己的“完美另一半”，把好的部分换过来，就像从一个健康的基因那里借来了力量，瞬间从一个“小弱鸡”变成了“强壮哥”。

它也像是基因的魔法整容术。

原本长得不怎么好看（功能不好）的基因，经过同源重组这么一捣鼓，就像是整了容一样，变得焕然一新，开始在细胞里发挥新的、强大的作用。

同源重组这个过程还像一个超级神秘的地下交易市场。

基因们偷偷地在这里进行着片段的交换，而且一切都在细胞的监管之下进行着，只不过这个监管有点宽松，只要是同源的，就可以进行交易（重组）。

你要是把细胞看成一个小王国，同源重组就是这个王国里独特的文化传统。

每一代细胞都会进行这样的基因交流，就像人类家族里传承的习俗一样，一代一代传下去，不断地让基因家族变得更加多样化。

而且同源重组就像是基因们的冒险之旅。

基因片段离开自己熟悉的环境，跑到别的基因那里去融合，不知道未来会发生什么，可能是创造出一个超级厉害的新基因，也可能会有点小意外，但不管怎样，这都是基因进化的重要一步。

如果把基因比喻成乐高积木块，同源重组就是把这些积木块重新组合的过程。

原来搭成一个小房子的积木，经过重组后可能就变成了一艘宇宙飞船，完全是一种全新的创造。

用同源重组的方法进行基因修复毕业论文167068522

毕业论文设计题目用同源重组的方法进展基因修复目录摘要 (i)Abstract................................................................................................................................................. i i 第一章同源重组技术的研究进展.. (1)1 前言 (1)1.1微生物育种技术概述 (1)1.2同源重组技术开展 (2)1.3Red同源重组技术 (3)1.4 CRISPR介导基因的编辑技术 (4)第二章质粒ptarget的构建 (8)1 材料 (8)1.1菌株和质粒 (8)1.2培养基与常用溶液 (8)1.4克隆中所用到的引物 (9)1.5 仪器 (9)2方法 (9)2.1 PCR反响体系与反响条件 (10)2.2凝胶回收 (10)2.3 gibson (11)2.4将质粒Ptarget导入DH5α中 (11)2.5 ptarget中N20的测序 (12)2.6 ptarget质粒提取 (12)3结果分析 (12)3.1 ptarget质粒的构建 (12)3.2 N20测序比照 (13)4讨论 (14)第三章基因组片段的获取与验证 (15)1 材料 (15)1.1 菌株和质粒 (15)1.2 引物 (15)1.3 大肠杆菌培养基 (16)1.4 仪器 (16)2 方法 (16)2.1细菌基因组的别离 (17)2.2 PCR反响体系与反响条件 (18)2.3 DNA片段的回收与纯化 (19)2.4 T克隆的反响体系与反响条件 (19)2.5 化学转化 (20)2.6 T—clone vector的菌落验证PCR反响体系与反响条件 (20)3 结论与分析 (20)3.1 mu-BL21基因组DNAtyrA、tnaB、talB、gabD、gabT基因的验证 (20)4讨论 (21)第四章基因同源重组 (22)1材料 (22)1.1菌体和质粒 (22)1.2培养基与常用溶液 (22)常用溶液与试剂 (23)1.3引物 (23)1.4 仪器 (23)2 方法 (24)2.1wt-BL21感受态的制备 (24)2.2cas9质粒的电转化 (24)2.3 wt-BL21/cas9感受态的制备 (24)2.4 各基因片段的同源重组 (25)2.5 重组验证菌落PCR的反响体系与反响条件 (25)2.6 同源重组成功的单克隆的获取 (26)2.7 Ptarget和cas9质粒的去除 (28)3结果与分析 (28)4．讨论 (29)第五章回补基因对菌体生长和色氨酸消费的影响 (30)1 材料 (30)1.1菌种和质粒 (30)2 方法 (30)2.1 RBS8质粒的扩增 (30)2.2 mut-B8/mut-RBS8中mut-RBS8质粒的剔除 (31)2.3 BL21、mut-B8、wt-B8、holo-B8感受态的制备 (31)2.4 RBS8质粒的电转化 (31)2.5校正曲线制作 (31)2.6 wt-BL8、holo-BL8和BL21 生长曲线的比照 (31)2.7 色氨酸含量的测定 (32)3 结果分析 (32)4讨论 (35)参考文献 (36)致谢 (37)摘要诱变育种是工业上获得性能优良的菌株的必要手段，但是在对表达载体进展生物诱变时，就会不可防止的造成工程菌本身染色体的变异，为研究这些染色体的变异对工程菌本身的影响，本实验使用同源重组技术对通过artp诱导突变的BL8〔BL21表达菌敲出3个基因后的工程菌〕工程菌进展基因交换,并以色氨酸定位研究对象，观察其产率上变化，对其突变碱基对色氨酸的产量的影响进展了初步研究。

原核生物的同源重组

原核生物的同源重组在生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组（Homologous Recombination）。

同源重组的频率与DNA或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。

同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍。

3.1.1 原核细菌的基因转移程序原核细菌的基因转移程序是基于物理学和生物学的原理建立起来的，将质粒或噬菌体DNA导入细菌受体细胞的方法主要有以下几种：1．Ca2+诱导转化法1970年，有人发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA，此后不久，对这种程序进一步的优化实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序如图3-1所示。

将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+协助细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。

此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。

经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。

此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2和CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。

1983年，有人除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。

目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。