实验9.3 Red ET同源重组2015.3.25

Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体
DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删 除、突变等；
三重同源重组示意图
cry1Ac的启动子片段和 终止子片段“一步”重 组入pHT315质粒上
2. 四重同源重组（Quadruple recombineering）
切酶消化难以得到相应的产物。
➢ 方法看似简单，但实验周期长。
➢ 大片段难以与载体正确连接。
➢ 无法同时连接多个（2个以上）的DNA片段。
限制性内切酶
连接酶
同源重组克隆步骤
步骤1： 酶切目的片段 步骤2：酶切载体
步骤3: 目的片段与载体连接
步骤4: 重组子转化到感 受态细胞 传统克隆步骤
同源重组克隆与传统克隆比较
抗生素使用浓度与Red/ET重组效率的关系
常用抗生素的工作浓度
7. 重组子的检测
检测方法：酶切分析、PCR检测、平板双划线、测序等；
一般采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定。为避免假阳性结果，鉴定引物选 择一条为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物。
高拷贝质粒修饰存在“质粒多聚体” 现象；
PCR反应中的突变；扩增GC含量较高的DNA片段时，选用Triplemaster、
HotStarTaq 等），用合成的引物PCR扩增获得dsDNA底物；
纯化PCR产物：
（1）减少模板背景对筛选工作带来的难度； （2）降低其剩余引物与靶标DNA片段的结合，提高重组效率； （3）去处PCR产物中的盐离子，提高转化效率。
降低模板对筛选工作带来的难度；
（1）纯化回收PCR产物； （2）内切酶消化处理模板； （3）使用R6K复制子。
3. 线性载体的制备
线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1）酶切
选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底，将导致阴性 克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。 2）PCR扩增
克隆片段 长度
一次克隆 片段数
感受态效 率要求
所用的酶
片段的插 入位点
片段酶切
载体线性 化方法
同源重组克隆 50bp-10kb
传统克隆 50bp-2kb
1-5个
1个
1×108cfu/ug以上 1×107cfu/ug以上
重组酶 任何位点
T4连接酶 特定位点
不需要 酶切或PCR
需要 酶切
2. 染色体的修饰
源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。 随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体 和插入片段的黏性末端（15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组 质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
引物设计方法
同源臂的长度在15～50bp时，重组效率就能满足实验要求， 重组效率随着同源臂长度的增加而增加。
同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998）
2. 线性供体dsDNA底物的制备
选用保真度高的DNA聚合酶（如Phusion、Pyrobest等，减少
Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡，这样才能使生物 体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
• 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生， 一种是突变，一种是遗传重组。
广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、 什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组 酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同
选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在18-20bp左右，建 议用高保真的聚合酶扩增。为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议 用Dpn I内切酶消化PCR产物，降低背景，提高阳性率。
不管采取哪种方法，最终线性化载体的浓度需>50ng/ul，高浓度的载体有 利于提高效率。
4. 同源重组反应
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶 （Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
（1）配置反应体系 将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中进行重组
反应（摩尔比可计算方法见附录），10 ul体系(见下表) 注意：1.目的片段与载体的摩尔比在2:1-5:1之间，摩尔比低于2:1效
率会降低；2.反应时间在15-30分钟，时间太短不利于重组反应
试剂
加量
10x Buffer
插入选择标记
插入无选择标记的DNA片段
E. coli染色体上插入抗性基因
传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较
3. 亚克隆 （Subcloning）
4. 直接克隆 （Direct cloning）
（A）亚克隆和直接克隆示意图
（B） 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小
六、 Red/ET重组技术的主要应用
1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆（Subcloning） 4. 直接克隆（Direct cloning）
1. 重组质粒的构建
(1) 传统基因克隆技术的缺点
➢ 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切
酶的消化，当缺少
合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，利用内
6. 重组子筛选
复苏培养物8000rpm离心1分钟收集菌体，根据需要将一定 量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上,37℃倒置培养12-16h 后观察菌落生长情况。 使用抗生素的最低抑菌浓度，有利于获得更多的重组子：
在10μg/mL的卡那霉素平板上重组子的数目是60μg/mL的卡那霉素平板上 重组子的数目的6倍。
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突 变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可 直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也 可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。
Red同源重组原理示意图
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) pSC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
亚克隆 pGB-15A载体抗性基因簇
Red/ET subcloning
直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇
3 mg基因组DNA用EcoR V消化
EcoRV (36739)
EcoRV (664)
p15A ori
Cm
Mx unknown PKS gene cluster (~36kb)
5.重组产物转化至感受态细胞
注意：所使用的感受态细胞效率≥1×108cfu/μg. 冰上融化一管100 μl的DH5α感受态细胞。
加入5-10μl反应液到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育 30分钟。
42℃水浴中热激45-90秒后，冰浴3分钟。
加入890μl SOC液体培养基，37℃复苏45-60分钟。
1ul
Recombination Enzyme 1ul
线性化载体（>50ng/ul） 50-100ng
插入片段（>50ng/ul） 150-200ng
dd H2O
补足至10ul
（2）短暂离心混匀，37℃孵育15分钟。
（3）反应结束后，取5-10ul反应液立即进行转化，剩余反应液可在4℃或
-20℃保存待用。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟 基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
redγ： 防止 E. coli中的核酸酶 RecBCD对外源线性DNA片
段的消化。
Digestion Binding
3’ 5’
Reda(RecE)
Redb(RecT) Single-strand
annealing
3’ 5’
Strand invasion
Repair/Replication
Selection
力，增加电转化效率。
五、 Red/ET重组操作流程
引物设 计合成
线性供体dsDNA 底物的制备
线性载体的 制备
重组子 筛选
重组产物转化 至感受态细胞
重组子检测
重组反应
1. 设计合成引物
设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则，但是上下 游引物要加上15-20bp的载体同源序列。载体同源序列如何 添加主要分以下两种情况： （1）载体酶切后是5’端突出或平末端，则引物上的同源序 列包括5’端突出序列的同源序列。 （2）载体酶切后是3’端突出，则引物上的同源序列不包括3’ 端突出序列的同源序列。
EcoRV
EcoRV
PKS from other bacteria： Photorhabdus lumineciens Psedumonas flurescencse
p15A-cm Cluster A
(38015 bp)
异源表达
七、 Red/ET重组新技术的发展 1. 三重同源重组（Triple recombineering）
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切 酶活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B） （图片来自Subramanian et al. 2003）
Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
2. 不受靶标DNA分子大小的限制；
3. 不受内切酶切位点的限制；
4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、
缺失、替换等的几率；
5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩
短实验周期。
三、 Red/ET重组的作用机制
1.链入侵模式
Red/ET重组链入侵模型
2.链退火模型
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同 的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
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RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
“质粒多聚体”问题解决办法：
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统；
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因（Kan）替换pUC19中的氨苄抗性基因（Amp）
解决办法： 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统； 减低质粒拷贝数。