病毒的分离培养与动物接种、鸡胚接种法
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病毒的分离培养与动物接种、 鸡胚接种法
练习内容
• 1．小白鼠脑内接种法 • 2．小白鼠滴鼻感染法 • 3．鸡胚尿囊腔接种法
目的要求
• 1．了解病毒分离的方法 • 2．了解病毒接种的实验途径 • 3．掌握鸡胚尿囊腔接种的方法与尿囊 液收获的方法
病 毒 的 分 离
• 一、标本采取的原则 • 二、标本的处理 • 三、病毒的分离方法
• （2）剖检及收获 • 收获前鸡胚应置 4 ℃冰箱过夜，使鸡胚 内血液凝固。收获时，用碘酒将气室部 卵壳 消毒，将气室处卵壳剥去，（不 要将碎片落入壳膜）。然后用无菌手术 刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破 卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉 素小瓶内，于低温保存。
三、病毒的检查
• （一）直接检查法 1．痘疱的形成 2．鸡胚死亡 （二）间接检查法
二、病毒的鸡胚接种、培养与 收获
• （一）接种 实验室经常应用的接种途径有四种： 绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔和卵黄囊 接种等。（见表12—6）
• （二）研磨和稀释 对脑、脊髓等组织标本首先应经研 磨器或乳钵中充分研磨后，加稀释液 （PH7.6肉汤或10％脱脂牛乳生理盐水 或0.5％水解乳蛋白Hanks液）制成组织 悬液，然后经2000转／分离心20分钟。 必要时可加抗生素处理（同上）。
病毒的分离培养的方法
• 动物接种法 • 鸡胚培养及病毒的鸡胚接种法 • 组织培养与病毒的细胞感染法
尿囊腔接种
• 【材料】 • 新城鸡瘟病毒10毫升稀释液，10—12日 龄鸡胚，卵垫， 1 毫升无菌注射器及 14 号针头，小锉了刀，橡皮乳头、大头针， 眼科镊子及小镊子，无菌培养皿、无菌 生理盐水，碘酒，酒精棉球。
• 【方法】 选9—11日龄鸡胚，照检后划出气室和胎 位，在气室边缘上2—8毫米处避开血管 作一标记，将碘酒在此消毒后，用蛋钻 钻一小扎（勿损伤壳膜），用注射器注 入病毒0.1—0.2毫升，然后用溶化石蜡 封口，置33—35℃孵育（时间见表12— 6）。
鸡胚培养及病毒的鸡胚接种法
• 一、鸡胚的孵育 （一）鸡卵的选择 一般都选新鲜、10天以内莱亨鸡（Leghorn bird）的受精卵以保证规格质量上的一致 （二）孵育 孵育时可将鸡卵放人卵箱内进行,气室向上， 孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40— 70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次， 以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。
小白鼠滴鼻感染法（示教）
• 【材料】 • 小白鼠、流盛病毒的鼠肺适应株悬液、无消 毛细吸管、无菌小试管、乙醚、棉球及动物 罐等。 • 【方法】 • 1 ．首先将小白鼠 1 只投于带盖的，内放有浸 蘸乙醚的棉球的容器内行全身麻醉。注意麻 醉的深度，一般不宜太深或太浅，太深时易 遭致麻痹死亡或吸人性肺炎，太浅则易在滴 注时打喷嚏。
• 2．用左手取出小白鼠握在掌中，大拇指及食 指抓住耳部使其头部朝前并呈仰卧位 置，另 一手将吸有病毒悬液的滴管，慢慢滴于管口 而不使其自然掉落呈悬滴状，将悬滴 靠至动 物鼻尖，动物在呼吸时带人，一般滴入0.03— 0.05毫升，不宜过多，感染材料如被吸人肺内， 容易引起动物肺水肿，往往于接种后一天内 死亡。 • 3．动物慢慢苏醒，在罐中逐日观察，通常在 数日后开始发病，发病的症状常为耸毛，咳 嗽、不食、甚至死亡，解剖可观察到肺脏有 肺炎或出血性病灶。
一、标本采取的原则
1. 病毒标本的采取应尽早为好. 2.由于大多数病毒对热不稳定，应该立 即接种，如果不能及时接种或需保存， 一般置50％甘油盐水4℃或一20℃以下 保存。
二、标本的处理
• （一）除菌处理 粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位 /毫升，置4℃过夜。 鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/ 毫升，置4℃作用4小时。 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、 呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入 等量的乙醚4℃过夜除菌。
【Βιβλιοθήκη Baidu法】
1．1毫升注射器抽取脑炎病毒悬液0.1毫升，去除注射器
内的气泡。 2 ．取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指 和食指握住小白鼠的头部，左手掌轻轻按住小白鼠的 体部。 3．右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右颊部皮毛 4 ．右手拿住注射器在小白鼠眼与耳根连线的中点略偏 耳朵的方向注入，进入颅腔，进针2—3毫米，不要插 得太深，注射量为0.02—0.03毫升。 5 ．注射完毕，将用过的注射器煮沸消毒，动物一般在 3—4天开始发病，食欲减退，活动迟纯、耸毛、振颤、 慢慢发展为麻痹瘫痪而死亡。
• （三）检卵 鸡卵孵育 4 ～ 5 天后，即可用检卵器检查鸡胚发 育情况（二天一次）。 1．未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 2 ．活鸡卵：鸡胚发育 4 天后，在检卵器上就可 见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡 胚），有明显的自然转动。 3．死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎 活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎 频死或已经死亡，应将其挑捡出来。 鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和 胚胎的位置待用。
动物接种法
• 动物接种是最原始的病毒培养方法，常 用的动物有小白鼠、大白鼠、田鼠、豚 鼠、 家兔，有时也用猴、猿、猩猩等。 接种时要根据病毒对动物，组织细胞等 嗜性不同而选 择特定的部位，如鼻腔、 皮内、皮下、腹腔、脑内、静脉等（见 表12—2）。
小白鼠脑内接种法（示教）
• 【材料】 1. 脑炎病毒（小白鼠脑脊髓炎）悬液：脑 组织先用无菌生理盐水洗去血液，再加 100 ％脱脂奶水研磨成 10 毫升悬液，离 心沉淀30分钟，吸取上清液。 2.小白鼠：3周龄，体重6—8克。
练习内容
• 1．小白鼠脑内接种法 • 2．小白鼠滴鼻感染法 • 3．鸡胚尿囊腔接种法
目的要求
• 1．了解病毒分离的方法 • 2．了解病毒接种的实验途径 • 3．掌握鸡胚尿囊腔接种的方法与尿囊 液收获的方法
病 毒 的 分 离
• 一、标本采取的原则 • 二、标本的处理 • 三、病毒的分离方法
• （2）剖检及收获 • 收获前鸡胚应置 4 ℃冰箱过夜，使鸡胚 内血液凝固。收获时，用碘酒将气室部 卵壳 消毒，将气室处卵壳剥去，（不 要将碎片落入壳膜）。然后用无菌手术 刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破 卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉 素小瓶内，于低温保存。
三、病毒的检查
• （一）直接检查法 1．痘疱的形成 2．鸡胚死亡 （二）间接检查法
二、病毒的鸡胚接种、培养与 收获
• （一）接种 实验室经常应用的接种途径有四种： 绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔和卵黄囊 接种等。（见表12—6）
• （二）研磨和稀释 对脑、脊髓等组织标本首先应经研 磨器或乳钵中充分研磨后，加稀释液 （PH7.6肉汤或10％脱脂牛乳生理盐水 或0.5％水解乳蛋白Hanks液）制成组织 悬液，然后经2000转／分离心20分钟。 必要时可加抗生素处理（同上）。
病毒的分离培养的方法
• 动物接种法 • 鸡胚培养及病毒的鸡胚接种法 • 组织培养与病毒的细胞感染法
尿囊腔接种
• 【材料】 • 新城鸡瘟病毒10毫升稀释液，10—12日 龄鸡胚，卵垫， 1 毫升无菌注射器及 14 号针头，小锉了刀，橡皮乳头、大头针， 眼科镊子及小镊子，无菌培养皿、无菌 生理盐水，碘酒，酒精棉球。
• 【方法】 选9—11日龄鸡胚，照检后划出气室和胎 位，在气室边缘上2—8毫米处避开血管 作一标记，将碘酒在此消毒后，用蛋钻 钻一小扎（勿损伤壳膜），用注射器注 入病毒0.1—0.2毫升，然后用溶化石蜡 封口，置33—35℃孵育（时间见表12— 6）。
鸡胚培养及病毒的鸡胚接种法
• 一、鸡胚的孵育 （一）鸡卵的选择 一般都选新鲜、10天以内莱亨鸡（Leghorn bird）的受精卵以保证规格质量上的一致 （二）孵育 孵育时可将鸡卵放人卵箱内进行,气室向上， 孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40— 70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次， 以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。
小白鼠滴鼻感染法（示教）
• 【材料】 • 小白鼠、流盛病毒的鼠肺适应株悬液、无消 毛细吸管、无菌小试管、乙醚、棉球及动物 罐等。 • 【方法】 • 1 ．首先将小白鼠 1 只投于带盖的，内放有浸 蘸乙醚的棉球的容器内行全身麻醉。注意麻 醉的深度，一般不宜太深或太浅，太深时易 遭致麻痹死亡或吸人性肺炎，太浅则易在滴 注时打喷嚏。
• 2．用左手取出小白鼠握在掌中，大拇指及食 指抓住耳部使其头部朝前并呈仰卧位 置，另 一手将吸有病毒悬液的滴管，慢慢滴于管口 而不使其自然掉落呈悬滴状，将悬滴 靠至动 物鼻尖，动物在呼吸时带人，一般滴入0.03— 0.05毫升，不宜过多，感染材料如被吸人肺内， 容易引起动物肺水肿，往往于接种后一天内 死亡。 • 3．动物慢慢苏醒，在罐中逐日观察，通常在 数日后开始发病，发病的症状常为耸毛，咳 嗽、不食、甚至死亡，解剖可观察到肺脏有 肺炎或出血性病灶。
一、标本采取的原则
1. 病毒标本的采取应尽早为好. 2.由于大多数病毒对热不稳定，应该立 即接种，如果不能及时接种或需保存， 一般置50％甘油盐水4℃或一20℃以下 保存。
二、标本的处理
• （一）除菌处理 粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位 /毫升，置4℃过夜。 鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/ 毫升，置4℃作用4小时。 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、 呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入 等量的乙醚4℃过夜除菌。
【Βιβλιοθήκη Baidu法】
1．1毫升注射器抽取脑炎病毒悬液0.1毫升，去除注射器
内的气泡。 2 ．取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指 和食指握住小白鼠的头部，左手掌轻轻按住小白鼠的 体部。 3．右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右颊部皮毛 4 ．右手拿住注射器在小白鼠眼与耳根连线的中点略偏 耳朵的方向注入，进入颅腔，进针2—3毫米，不要插 得太深，注射量为0.02—0.03毫升。 5 ．注射完毕，将用过的注射器煮沸消毒，动物一般在 3—4天开始发病，食欲减退，活动迟纯、耸毛、振颤、 慢慢发展为麻痹瘫痪而死亡。
• （三）检卵 鸡卵孵育 4 ～ 5 天后，即可用检卵器检查鸡胚发 育情况（二天一次）。 1．未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 2 ．活鸡卵：鸡胚发育 4 天后，在检卵器上就可 见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡 胚），有明显的自然转动。 3．死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎 活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎 频死或已经死亡，应将其挑捡出来。 鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和 胚胎的位置待用。
动物接种法
• 动物接种是最原始的病毒培养方法，常 用的动物有小白鼠、大白鼠、田鼠、豚 鼠、 家兔，有时也用猴、猿、猩猩等。 接种时要根据病毒对动物，组织细胞等 嗜性不同而选 择特定的部位，如鼻腔、 皮内、皮下、腹腔、脑内、静脉等（见 表12—2）。
小白鼠脑内接种法（示教）
• 【材料】 1. 脑炎病毒（小白鼠脑脊髓炎）悬液：脑 组织先用无菌生理盐水洗去血液，再加 100 ％脱脂奶水研磨成 10 毫升悬液，离 心沉淀30分钟，吸取上清液。 2.小白鼠：3周龄，体重6—8克。