高效液相色谱在生物制药中的应用

高效液相色谱在生物制药中的应用

高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。

1.高效液相色谱的介绍

高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。高效液相色谱有5种类型：

1、吸附色谱（Adsorption Chromatography）

2、分配色谱（Partition Chromatography）

3、离子色谱（Ion Chromatography）

4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）

5、亲和色谱（Affinity Chromatography）

此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点。高效液相色谱的缺点就是有柱外效应，在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。

2.高效液相色谱在生物制药中的应用

2.1高效液相色谱在检测药物含量方面的应用

药物与人类的健康，生活质量的提高关系极大，许多药品由于受到纯度的影响，药效不能充分发挥，甚至产生毒副作用；有时服用前需作各种试验，带来很多麻烦，高效液相色谱的测定就比较简单。高效液相色谱是分离与纯化药物的最佳选择。在药物分析中，由于有灵敏度高，快速简便，专一性的特点，广泛的应用于药物分析中，主要是定量分析，特别在干扰较多的时候表现得比其他方法好。

色谱柱，以高效液相色谱法可以用来测定毗虫琳原药的含量：选择ODS-C

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甲醇和水为流动相，采用反相高效液相色谱法测定毗虫琳原药的含量。该方法快速简便，准确度高[3]。高效液相色谱法测定氨咖黄敏胶囊的含量：色谱柱为Aglient c s柱(250 mm×4．6 mm，5 m)，流动相为l％醋酸溶液(用乙二胺调pH 至3．7)一甲醇(60：40)，流速为1．0 mL／min-1，检测波长272 nm，柱温30℃。结果对乙酰氨基酚、咖啡因进样量分别在0．1222～3．0555 g和0．007 482～0．1871 g范围内与峰面积呈良好线性关系，r分别为1．0000和1．0000(n=6)，平均加样回收率分别为99．54％ (RSD=0．66％ )和100．43％(RSD=0．92％ )[4]。

高效液相色谱法测定复方乳酸左氧氟沙星缓释滴鼻液中两组分含量：采用柱(4．6 mm~250 mm，5μm)，以乙腈-0.02mol·L-1磷酸二氢钾溶液(17：Dionex C

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83，含0．2％三乙胺，磷酸调pH 3．5)为流动相，流速为1 mL·min-1，检测波长为217 nm[5]。

高效液相色谱法测定复方痛风定颗粒中秋水仙碱含量：色谱柱：AgilentHC-C

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柱(4．6 mm×250 mm，5μm)，流动相：甲醇一水(45：55)；检测波长：245 nm；柱温：25℃，流速1．0 mL·min-1；进样量l0 L；分离度不低于2．0，理论塔板数以秋水仙碱峰面积计算不低于3 000[6]。

高效液相色谱法测定狼疮灵颗粒中芍药苷的含量：采用高效液相色谱法，色谱柱：Hypersil ODS-2(150 mm X 4.6 mm，5.0μm)；流动相：乙腈一0．4％的磷酸水溶液(10：90)；检测波长：230 nm；流速：1．0 mL／min，柱温：25℃[7]。

除了以上这些例子意外，高效液相色谱还可应用于其他各种药品中有机物或无机物浓度的检测，如：高效液相色谱法测定排石利胆片中芍药苷的含量，高效液相色谱法测定小儿清解冲剂中连翘苷含量，高效液相色谱法检查骨筋丸胶囊中非法添加的松香酸等[8-10]。高效液相色谱检测的方法重复性好、快速可行、操作简单、简捷准确、结果准确并且可靠，可用于控制各种药品中有效成分的质量。并且可以广泛应用。

2.2高效液相色谱在检测制药废水中的应用

制药废水中的残留药物成分对环境造成的污染越来越严重, 制药废水的治理已成为环境保护工作中相当重要的方面。所以检测制药废水也是生物制药工业下游技术中很重要的一个组成部分。

高效液相色谱也可应用于测定制药废水中相关物质的含量，如：

高效液相色谱法同时测定制药废水中的交沙霉素、茶碱及扑热息痛。同时测定制药废水中残留的茶碱、扑热息痛、交沙霉素3种药物的高效液相色谱方法。样品经固相萃取处理后进行色谱分析。采用的色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS

柱( 4.6 mm i d X 200 mm) ；流动相A 液为0.025 mol/ L KH

2PO

4

-H

3

PO

4

缓冲液

( pH 2.75)，流动相B液为甲醇；梯度洗脱；紫外检测波长为230 nm(交沙霉素)、272 nm(茶碱)、243 nm(扑热息痛) 。制药废水中3 种药物的加标回收率均高于93%, 相对标准偏差(n = 6) 小于2.1% , 检测下限( S / N = 3) 不高于1.0μg/ L。