第四章 生物样品的采集、储存及预处理

第四章生物样品的采集、储存及预处理第一节生物样品的采集、储存体内药物分析的任务和分析对象具有如下特点:被测定的药物和代谢物的浓度极低；样品介质复杂，其中存在各种各样直接或间接影响测定结果的物质，大多需要分离和净化；仅有少量样品可供分析，尤其是在连续测定过程中，很难再度获得完全相同的样品；样品的稳定性需要特别注意等。

一、生物样品的采集生物介质(biological matrix)包括全血、血浆、血清、尿、粪、唾液和各种组织。

其中最常用的生物样品是血液和尿液。

1.血样的采集供测定的血样应能代表整个血药浓度。

若能从动脉或心脏取血最为理想，但只能用于动物，不能用于人。

动物采血可根据不同种类及实验需要，采取适当的方法。

如大、小鼠可由尾动脉、静脉、心脏、眼眶取血或断头取血等，家兔可由耳缘静脉、颈静脉等多处取血，犬可由前、后肢静脉等处取血。

对于受试者通常采用静脉取血(成人从肘正中静脉取血，小儿从颈外静脉取血)。

静脉取血一般将注射器针头插入静脉血管抽取。

抽取的血液转移至试管或其它容器时应缓缓压出，以防血细胞破裂。

全血在加肝素或柠檬酸、草酸盐等抗凝剂后，离心分取血浆，其体积约为全血的一半。

血清则是由血液中纤维蛋白原等影响下，引起血块凝结而析出，离心取用，而血块凝结时往往易造成药物吸附的损失。

全血直接作为样品时，也应加入抗凝剂混匀，防止凝血。

对大多数药物来说，血浆浓度与红细胞中的浓度呈正比，所以测定全血不能比测定血浆提供更多的信息。

而全血的净化较血浆与血清复杂，尤其是溶血后，血色素等可能会给HPLC测定带来影响。

但是，一些药物可与红细胞结合，或药物在血浆和红细胞的分布比率因人而异，在这些情况下，宜采用全血。

血样抽取量受到一定的限制。

人体药代动力学研究需要在多个时间点(一般为12~20点)取样，每次由前臂静脉取血3~5m1。

随着高灵敏度测定方法的建立，取样量可继续降低，从而更易为受试者接受。

实验动物取血量应注意是否超过了动物的生理承受能力。

制备血浆样品时，将采取的血样置含有抗凝剂的试管中，缓缓转动试管使其充分混合、离心，所得上清液即为血浆。

常用的抗凝剂有肝素，它是体内正常的生理成分，因而不会改变血样的化学组成或引起药物的变化，一般不会干扰测定。

通常lml血液采用20个单位的肝素即可抗凝。

可将配制好的肝素溶液均匀地涂布在试管壁上，于60~70℃烘干备用。

其它抗凝剂有柠檬酸、草酸盐、EDTA等，但它们可能引起被测组分发生变化或干扰某些药物的测定。

制备血清样品时，将采取的血样在室温下至少放置30~60min，待血液凝固后，以3000~4000r/min离心10min，分取上层澄清的血清。

血浆和血清在采血后应及时分离。

短期保存时需置冰箱（4℃）中，长期保存时需置冰箱(-20℃以下)冷冻备用。

2.尿样的采集尿药测定主要用于药物剂量回收、药物代谢及生物利用度研究，也可用于乙酰化代谢和氧化代谢快、慢型测定等。

因为尿药浓度通常变化较大，所以应测定一定时间内排入尿中药物的总量，这就要同时测定在规定时间内的尿量(体积)及尿药浓度。

尿液的主要成分是水、尿素及盐类。

它是一种良好的细菌培养基，因而需立即冷藏或防腐处理，否则细菌会很快繁殖而引起尿素分解，产生氨气，这在夏天进行得很快，除产生异常气味外，还有可能导致样品分解。

冷藏条件一般可置4℃冰箱内。

若欲在室温下保存，应在收集尿样后，立即加入防腐剂。

常用的防腐剂有甲苯、氯仿或改变尿液的酸碱性，以抑制细菌的繁殖。

加入的防腐剂是否干扰测定或与被测组分发生化学反应，应由实验验证，以便选取合适的防腐措施。

在所有体液样品中，尿样最容易获得，并且样品量大，取样次数可以增加，内含药物(母体药物及代谢物)浓度高。

健康人的尿液中不含蛋白质，不需除蛋白，所以常用作药物体内代谢研究。

3.唾液样的采集由于某些药物在唾液中的浓度与血浆浓度密切相关，即可利用唾液中的浓度反映血浆中的药物浓度。

由于唾液样品采集时无伤害、无痛苦，取样不受时间、地点的限制，因而样品容易获得。

一般成人每日分泌唾液1~1.5L。

唾液的比重为1.003~1.008，粘度是水的1.9倍；唾液的pH在6.2~7.6之间变动，分泌量增加时趋向碱性而接近血液的pH。

通常得到的唾液含有粘蛋白。

唾液的采集应尽可能在剌激少的安静状态下进行，采集前应漱口，除去口腔中的食物残渣，唾液自然分泌流入收集管中。

采集后离心，分取上清液作为药物浓度测定的样品。

也可采用物理方法(嚼石蜡片等)或化学方法(广泛应用的是柠檬酸或维生素C等，有的将约10mg柠檬酸结晶放在舌尖上，或者将10%的柠檬酸溶液喷在舌上，弃去开始时的唾液后再取样)刺激，使在短时间内得到大量的唾液，但这样可能影响唾液中的药物浓度。

唾液中的粘蛋白决定了唾液的粘度，它是在唾液分泌后受唾液中的酶催化而生成的。

为阻止粘蛋白的生成，应将唾液在4℃以下保存。

如果分析时没有影响，则可用碱处理唾液，使粘蛋白溶解而降低粘度。

唾液在保存过程中，会放出CO2，而使pH升高，需要测定唾液pH时，应在取样时测定较好。

冷冻保存的唾液解冻后应将样品混匀后使用，以免产生误差。

需要指出的是只有知道唾液中药物浓度与血清中药物的总浓度有一定的比值时，唾液中药物浓度的监测才有意义。

4.粪样的采集新鲜粪便收集之后应立即冷冻处理。

因粪便内含有大量蛋白质，且微量药物包含在大量固体食物残渣中，对药物的分离和测定都带来麻烦。

因此，必须采取蛋白变性处理及药物分离、纯化等措施。

二、生物样品的储存由于实验设计的要求，如药代动力学研究，在一定的时间内必须采集大量的样品，受分析速度的限制，往往不能做到边采样边分析，需将部分样品适当储存。

冷冻保存是最常用的方法。

冷冻既可以终止样品中酶的活性，又可以储存样品。

在某些情况下若收集的样品来不及冷冻处理，可先将其置冰屑中，然后再行冷冻储存。

冷冻时，若使用玻璃容器储存样品，需注意防止温度骤降使容器破裂，造成样品损失或污染。

而塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。

某些药物特别是碱性药物还会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此，必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。

为防止含酶样品中被测组分进一步代谢，采样后必须立即终止酶的活性。

常采用的方法有：液氮中快速冷冻、微波照射、匀浆及沉淀、加入酶活性阻断剂(通常加入氟化钠)等。

另外，某些生物样品中的药物易被空气氧化，如儿茶酚类中的阿朴吗啡，具有邻苯二酚结构，易被空气氧化产生醌类杂质，若收集的血浆样品不加抗氧剂直接在–l5℃冷藏，仅能稳定4周，但加入抗坏血酸后，则可稳定10周。

又如卡托普利，由于采血后该药仍会被血浆中的酶继续氧化，使血药浓度大大降低，因而必须低温下立即分离出血浆并加入抗氧剂及稳定剂，以防止体外继续代谢。

对于见光易分解的药物(如硝苯地平)，在采集生物样品时还需注意避光。

第二节生物样品的预处理血浆(plasma)和血清(serum)是体内药物分析经常采用的样本，其中尤以血浆最为常用。

因为药物在体内达到平衡状态时，血浆中药物浓度一般与药物在作用部位的浓度密切相关，可以反映药物在靶器官的状况。

进行HPLC分析时，生物样品一般都需要进行纯化处理。

对纯化程度的要求，取决于使用的分析方法及样品所含杂质情况。

仅有少数情况下可取样品直接进样，对于大多数样品而言，进行预处理是必要的。

由于血药浓度一般很低(一般为μg/ml或ng/m1水平)，样品的基质、内源性物质及代谢产物相当复杂，若直接进行测定，内源性物质可能产生干扰，药物浓度太低会达不到仪器灵敏度要求。

因此，生物样品中的药物一般须经过分离、纯化和浓集后再供测定。

生物样品的前处理是色谱分析中必不可少的操作步骤，其目的可归纳为：(1)改善分析结果的准确度与精密度；(2)延长色谱柱的寿命(如除去固体杂质)；(3)改善组分的可测定性(如被测组分的富集)；(4)改善选择性(例如排除基质干扰)；(5)改变样品中组分的色谱行为。

不管为了什么目的，在设计或执行某一个前处理步骤时都应考虑到下列问题：(1)被测组分的理化性质；(2)样品的化学组成；（3）药物的蛋白结合率；（4）基质干扰的类型；(5)样品组分处理过程中的稳定性；(6)注意样品在收集、储存和前处理过程中容器的污染；(7)适合色谱系统的样品最终使用的溶剂；(8)前处理过程尽量简单，有尽可能高的精密度和准确度；(9)前处理的最后一步应使被测组分富集等。

为了对色谱分析中常用的前处理方法有比较全面的了解，下面就有关问题作进一步说明。

一、样品均匀化对于血浆样品，应在测定前混合均匀，以免造成测定误差。

可置涡流混合器上混匀，血浆样品往复振摇亦可达到均匀化的目的。

对粪便、肌肉和组织等固体样品都存在均匀化这一问题。

对含有不溶性组分的样品(例如组织和粪便)，须将样品进行匀浆处理，以保证样品的均匀性。

同时还应注意取样的代表性问题。

二、去蛋白处理生物样品如血浆、血清等含有大量的蛋白质，它们能结合药物，因此对于某些药物的测定，必须先将与蛋白结合的药物游离之后再作进一步处理。

测定血液、尿液和脑脊髓液等体液中的药物时，因这些体液中含有蛋白质，在测定时会形成泡沫、浑浊或出现沉淀而干扰测定；用反相高效液相色谱法进行分析时，虽然可以直接进样，但体液中的蛋白质(以及脂类、盐类和其它内源性杂质)会沉结在色谱柱上，大大缩短色谱柱的寿命。

如用反相HPLC测定血浆中的醋氨酚时，有人在分析柱前安装预柱，直接进样l.5μl血浆样品，进样500次左右，便产生柱堵塞、柱效降低等现象。

因此，生物样品去蛋白是必要的。

通常去蛋白过程是将蛋白质变性处理后，把与蛋白结合的药物解离出来，离心分离以除去蛋白。

目前已有很多去蛋白方法可供使用，但使用各种方法之前应了解该方法是否会导致生物样品中的药物发生分解或影响药物的提取等。

通常除蛋白的方法是在含蛋白样品中加入适当的沉淀剂或变性剂，使蛋白质脱水而沉淀(如有机溶剂、中性盐)，有的是由于蛋白质形成不溶性盐而析出(如一些酸类：三氯醋酸、高氯酸、磷酸、苦味酸)，离心后取上清液用于分析。

甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有机溶剂，中性盐有硫酸铵、氯化铵等。

无机盐沉淀蛋白是可逆的，即将蛋白稀释后仍具有生理活性，而有机溶剂和酸类沉淀的蛋白是不可逆的，用甲醇沉淀蛋白的优点是上清液清澈，沉淀为絮状易于分离；乙腈与之相反，产生细的蛋白沉淀，但沉淀效率较甲醇高。

甲醇与乙腈是反相液相色谱法中常用的蛋白沉淀剂，因为它们与流动相的组成相同。

但若还需加有机溶剂提取，则由于加入的有机沉淀剂使水相和有机相部分混溶，会影响样品的提取效率。

大多数药物在适当pH下可用有机溶剂直接萃取出来，同时，药物与血浆蛋白的结合处于可逆平衡状态，因此不必事先除去蛋白即可自体液中提取出药物。