胃癌发生过程中细胞膜磷脂变化的研究
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现代肿瘤医学 2010年 05月 第 18卷第 05期
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胃癌发生过程中细胞膜磷脂变化的研究
张 佳 1 ,叶尔买克 1 ,王健生 1 ,吴文安 1 ,王嗣岑 2 ,张明鑫 1 ,周苏娜 1
Va ria tions of ce llu la r m em b rane p hosp ho lip ids w ith genesis of gastric cance r
【收稿日期 】 2009 - 11 - 20 【修回日期 】 2009 - 12 - 18 【基金项目 】 国家自然科学基金资助项目 (编号 : 30600744) 【作者单位 】 1西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤外科 ,陕西
西安 710061 2西安交通 大 学 医 学 院 药 物 研 究 所 , 陕 西 西 安 710061 【作者简介 】 张佳 (1985 - ) ,男 ,陕西西安人 ,博士研究生 ,主要研 究方向为肿瘤免疫治疗基础 。 【通讯作者 】 王健生 (1970 - ) ,男 ,湖北人 ,教授 ,博士生导师 ,主要 研究方向为肿瘤生物信息学 、肿瘤免疫治疗基础 。
流速 1. 0 m l/m in,检测波长 205 nm ,检测灵敏度 0. 05 Aufs,柱压 3. 4 mPa。取同一样品重复选样 3 次 ,测得 P I、PS、 PE、PC 峰高的变异系数 (CV % ) 均小于 2 %。 1. 5 统计学分析
运用 SPSS 16. 0统计软件对结果进行处理 ,以 P < 0. 05 为有显著性差异 。 2 结果
我们前期的研究中发现 ,和癌旁正常组织比较 ,胃癌组 织的脂类红外吸收光谱发生明显改变 ,癌组织细胞膜的磷脂 含量明显升高 [1 - 2 ] 。哺乳动物的细胞膜主要组分为磷脂酰 胆碱 (phosphatidylcholine, PC) ,磷脂酰乙醇胺 ( phosphatidyle2 thanolam ine, PE) ,磷脂酰丝氨酸 ( phosphatidylserine, PS) ,磷 脂酰肌醇 (phosphatidylinositol, P I) 。进一步研究在肿瘤发生 过程中 ,肿瘤细胞膜磷脂含量升高 ,作为膜磷脂主要组成成 分的 PC、PE、PS和 P I变化如何对于研究肿瘤发生过程中生
表 1 细胞膜磷脂在胃癌原发灶 、癌旁黏膜组织含量比较 ( x ±s)
高于癌旁正常组织 ,提示胃癌的发生中磷脂的代谢发生了改
磷脂
癌原发灶
癌旁黏膜组织
P
(mg / g)
( n = 30)
( n = 30)
变 。研究发现 , P I代谢产生的两个第二信使 - 三磷酸肌醇 ( IP3)和甘油二酯 (DAG)参与细胞信号调节 ,促进细胞增殖
Sigma 产品 。色谱流动相为乙腈 - 甲醇 - 85 %磷酸 ( 100 ∶3 ∶ 1 , V / V / V ) ,采用 μPorasil 柱 ( 3. 9 mm i. d. ×300 mm ) 。 乙腈为国产光谱纯 ,甲醇 、氯仿和磷酸为国产分析纯 。 1. 3 细胞膜磷脂的提取 1. 3. 1 组织匀浆制备 称取组织 0. 3g放入平皿中 ,加适量 生理盐水 ,平皿置入冰水混合物中 ,清洗数次干净后用眼科 剪将组织尽快剪碎成组织块 ,将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管 中制备匀浆 ,上下转动研磨数十次 ( 6 - 8 m in) ,充分研碎 ,使 组织匀浆化 。离心 ,弃去上清液 ,加入低渗 Tris液 (预冷的 、 10mmol/L、pH7. 4、低渗 Tris (三羟甲基氨基甲烷 ) - HCl 缓 冲液 ) 。 1. 3. 2 超声破膜 将上述匀浆液于超声波清洗机中于冰浴 条件下破膜 30 m in。 1. 3. 3 离心 破膜后的匀浆液于低温离心机中 4℃、1000 g 离心 20 m in,弃沉淀 ,低渗 Tris液重悬上清液 。将上述上清 液于低温离心机中 4℃、10000 g离心 20m in,弃去上清液 ,低 渗 Tris液重悬 。将上液于低温离心机中 4℃、10000 g离心 20 m in,弃去上清液 ,得到沉淀 , 4℃保存 。 1. 3. 4 细胞膜纯度鉴定 用电子显微镜技术对细胞膜纯度 及膜结构进行鉴定 ,观察到细胞质膜的片状物及由膜性结构
卷曲成的小泡 ,证实细胞膜的制备方法可行 。细胞膜悬浮于 一定体积的 50 mmol/L Tris - HCl (pH = 7. 4) 缓冲溶液中 , 制成细胞膜悬液 ,用 Low ry 法测定膜蛋白含量 ,一般不低于 0. 5 mg/m l。 1. 3. 5 提取膜磷脂 沉淀加入 5m l Tris - HCl缓冲液制成 悬浮液取 2m l悬浮液加入 5m l CHCl3 - CH3OH ( 2 ∶1, V / V ) ,振摇 1 m in,加蒸馏水 1 m l,离心 3 000 g/m in, 10 m in,液 体分层 。取下清液 ,真空浓缩仪中干燥 ,保存于 - 20 ℃。 测定时用氯仿溶解直接测定 。 1. 4 液相色谱检测磷脂的含量
【Abstrct】 O bjective: To detect membrane phospholip ids and study the relationship of membrane phospholip ids with genesis of gastric cancer. M ethods:M embrane phospholip ids of P I, PS, PE, and PC were detect w ith high per2 formance liquid chromatography. Results: In p rimary foci and paratumor gastric mucosa of 30 cases, the content of P I were (mg/ g) : 1. 69 ±0. 09, 1. 18 ±0. 10 respectively, PS 0. 55 ±0. 04, 0. 54 ±0. 04 respectively, PE 52. 57 ±5. 58, 27. 54 ±3. 36 respectively, and PC 121. 36 ±6. 49, 62. 90 ±5. 02 respectively. The contents of P I , PE and PC were higher in p rimary foci than in paratumor mucosa ( P < 0. 01). PS in p rimary foci and paratumor gastric mucosa was not significantly different( P > 0. 05). Conclusion:M embrane phospholip ids have obvious variations in genesis of gastric cancer. R ises of P I, PE and PC were associated w ith genesis of gastric cancer. 【Key words】gastric cancer; cell membrane; phospholip ids
30例胃癌患者原发灶及癌旁黏膜组织的细胞膜磷脂色 谱峰出现的顺序依为 P I、PS、PE、PC,不同组织色谱检测结果 分别见图 1。
图 1 细胞膜磷脂色谱图
胃癌原发灶 (A ) 、癌ห้องสมุดไป่ตู้黏膜组织 (B )
胃癌原发灶 、癌旁黏膜组织中膜磷脂不同组分含量的检 组成 [5 ] ,使得肿瘤细胞膜磷脂含量相对正常细含量增加 。
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
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MODERN ONCOLOGY,M ay12010, VO I118, NO105
物大分子含量与结构的改变 、寻找新的诊断指标和治疗靶点 具有重要意义 。 1 材料与方法 1. 1 临床资料
30例样品均取自西安交通大学医学院第 一附属医院 2008年 2 - 3月间胃癌患者手术后新鲜标本 。其中男性 18 例 ,女性 12例 ,年龄 32 - 70岁 ,平均 56岁 。手术切除胃标本 后生理盐水冲洗净黏液和血污 ,切取 1 cm ×1 cm ×1cm 大小 组织 2块 ,一块取自肿瘤中心 (非坏死部位 ) ,另一块取自切 缘最远端 。所取组织一分为二 ,一块放入液氮中冷冻保存备 用 ;另一块 10%的福尔马林溶液固定 ,石蜡包埋 ,常规病理切 片染色检查 。 1. 2 实验材料
冷冻 离 心 机 , 真 空 浓 缩 仪 , pH 7. 4 低 渗 Tris 缓 冲 液 (10mmol/L pH 7. 4 Tris - HCl缓冲液 ) ;色谱分析系统为 LC - 2010AHT L IQU ID CHROMATOGRAPH ( SH IMAD IU ) ,配备 紫外检测器和自动进样阀 ;色谱工作站为 LC solution version 1. 22 sp1 ( SH IMAD IU ) ; 磷 脂 酰 肌 醇 ( P I) 、磷 脂 酰 丝 氨 酸 ( PS) 、磷脂酰乙醇胺 ( PE) 、磷脂酰胆碱 ( PC) 标准品均为
ZHANG J ia1 , YE Er - mai - ke1 , WAN G J ian - sheng1 , WU W en - an1 , WANG Si - cen2 , ZHANG M ing - xin1 , ZHOU Su - na1
1 F irst A ffilia ted Hospita l of X i’an J iaotong U n iversity, X i’an 710061, Ch ina; 2 S chool of M ed icine, X i’an J iaotong U n iversity, X i’an 710061, Ch ina.
测结果见表 1。原发灶及癌旁黏膜组织中 PS含量无显著差
细胞膜磷脂由 P I、PS、PE、PC组成 ,在本实验中 ,我们发
异 ( P > 0. 05) 。原发灶中 P I、PE、PC含量高于癌旁黏膜组织 现 P I、PE、PC 3种膜磷脂含量在肿瘤中增加且具有统计学差
( P < 0. 01) 。
异 ( P < 0. 01) , PS改变虽无显著性意义 ,但在肿瘤中含量也
Modern Oncology 2010, 18 (05) : 0855 - 0857
【摘要 】 目的 :检测胃癌原发灶及癌旁黏膜组织细胞膜磷脂含量 ,探讨其与胃癌发生的关系 。方法 :采用高 效液相色谱法检测胃癌原发灶及癌旁黏膜组织细胞膜 P I、PS、PE和 PC的含量 。结果 : 30例胃癌患者中原发 灶和癌旁黏膜组织中细胞不同膜磷脂的含量 (mg/ g) : P I为 1. 69 ±0. 09和 1. 18 ±0. 10; PS为 0. 55 ±0. 04和 0. 54 ±0. 04; PE为 52. 57 ±5. 58和 27. 54 ±3. 36; PC为 121. 36 ±6. 49和 62. 90 ±5. 02。癌与癌旁黏膜组织中 PS的含量差异无显著性意义 ( P > 0. 05) 。结论 :胃癌发生过程中胃癌原发灶中 P I、PE、PC含量高于癌旁黏膜 组织 ( P < 0. 01) 。胃癌原发灶与癌细胞膜磷脂发生了明显变化 , P I、PE、PC增高与胃癌发生有关 。 【关键词 】胃癌 ; 细胞膜 ; 膜磷脂 【中图分类号 】R730. 21; R735. 2 【文献标识码 】A DO I: 10. 3969 / j. issn. 1672 - 4992. 2010. 05. 06 【文章编号 】1672 - 4992 - (2010) 05 - 0855 - 03
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胃癌发生过程中细胞膜磷脂变化的研究
张 佳 1 ,叶尔买克 1 ,王健生 1 ,吴文安 1 ,王嗣岑 2 ,张明鑫 1 ,周苏娜 1
Va ria tions of ce llu la r m em b rane p hosp ho lip ids w ith genesis of gastric cance r
【收稿日期 】 2009 - 11 - 20 【修回日期 】 2009 - 12 - 18 【基金项目 】 国家自然科学基金资助项目 (编号 : 30600744) 【作者单位 】 1西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤外科 ,陕西
西安 710061 2西安交通 大 学 医 学 院 药 物 研 究 所 , 陕 西 西 安 710061 【作者简介 】 张佳 (1985 - ) ,男 ,陕西西安人 ,博士研究生 ,主要研 究方向为肿瘤免疫治疗基础 。 【通讯作者 】 王健生 (1970 - ) ,男 ,湖北人 ,教授 ,博士生导师 ,主要 研究方向为肿瘤生物信息学 、肿瘤免疫治疗基础 。
流速 1. 0 m l/m in,检测波长 205 nm ,检测灵敏度 0. 05 Aufs,柱压 3. 4 mPa。取同一样品重复选样 3 次 ,测得 P I、PS、 PE、PC 峰高的变异系数 (CV % ) 均小于 2 %。 1. 5 统计学分析
运用 SPSS 16. 0统计软件对结果进行处理 ,以 P < 0. 05 为有显著性差异 。 2 结果
我们前期的研究中发现 ,和癌旁正常组织比较 ,胃癌组 织的脂类红外吸收光谱发生明显改变 ,癌组织细胞膜的磷脂 含量明显升高 [1 - 2 ] 。哺乳动物的细胞膜主要组分为磷脂酰 胆碱 (phosphatidylcholine, PC) ,磷脂酰乙醇胺 ( phosphatidyle2 thanolam ine, PE) ,磷脂酰丝氨酸 ( phosphatidylserine, PS) ,磷 脂酰肌醇 (phosphatidylinositol, P I) 。进一步研究在肿瘤发生 过程中 ,肿瘤细胞膜磷脂含量升高 ,作为膜磷脂主要组成成 分的 PC、PE、PS和 P I变化如何对于研究肿瘤发生过程中生
表 1 细胞膜磷脂在胃癌原发灶 、癌旁黏膜组织含量比较 ( x ±s)
高于癌旁正常组织 ,提示胃癌的发生中磷脂的代谢发生了改
磷脂
癌原发灶
癌旁黏膜组织
P
(mg / g)
( n = 30)
( n = 30)
变 。研究发现 , P I代谢产生的两个第二信使 - 三磷酸肌醇 ( IP3)和甘油二酯 (DAG)参与细胞信号调节 ,促进细胞增殖
Sigma 产品 。色谱流动相为乙腈 - 甲醇 - 85 %磷酸 ( 100 ∶3 ∶ 1 , V / V / V ) ,采用 μPorasil 柱 ( 3. 9 mm i. d. ×300 mm ) 。 乙腈为国产光谱纯 ,甲醇 、氯仿和磷酸为国产分析纯 。 1. 3 细胞膜磷脂的提取 1. 3. 1 组织匀浆制备 称取组织 0. 3g放入平皿中 ,加适量 生理盐水 ,平皿置入冰水混合物中 ,清洗数次干净后用眼科 剪将组织尽快剪碎成组织块 ,将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管 中制备匀浆 ,上下转动研磨数十次 ( 6 - 8 m in) ,充分研碎 ,使 组织匀浆化 。离心 ,弃去上清液 ,加入低渗 Tris液 (预冷的 、 10mmol/L、pH7. 4、低渗 Tris (三羟甲基氨基甲烷 ) - HCl 缓 冲液 ) 。 1. 3. 2 超声破膜 将上述匀浆液于超声波清洗机中于冰浴 条件下破膜 30 m in。 1. 3. 3 离心 破膜后的匀浆液于低温离心机中 4℃、1000 g 离心 20 m in,弃沉淀 ,低渗 Tris液重悬上清液 。将上述上清 液于低温离心机中 4℃、10000 g离心 20m in,弃去上清液 ,低 渗 Tris液重悬 。将上液于低温离心机中 4℃、10000 g离心 20 m in,弃去上清液 ,得到沉淀 , 4℃保存 。 1. 3. 4 细胞膜纯度鉴定 用电子显微镜技术对细胞膜纯度 及膜结构进行鉴定 ,观察到细胞质膜的片状物及由膜性结构
卷曲成的小泡 ,证实细胞膜的制备方法可行 。细胞膜悬浮于 一定体积的 50 mmol/L Tris - HCl (pH = 7. 4) 缓冲溶液中 , 制成细胞膜悬液 ,用 Low ry 法测定膜蛋白含量 ,一般不低于 0. 5 mg/m l。 1. 3. 5 提取膜磷脂 沉淀加入 5m l Tris - HCl缓冲液制成 悬浮液取 2m l悬浮液加入 5m l CHCl3 - CH3OH ( 2 ∶1, V / V ) ,振摇 1 m in,加蒸馏水 1 m l,离心 3 000 g/m in, 10 m in,液 体分层 。取下清液 ,真空浓缩仪中干燥 ,保存于 - 20 ℃。 测定时用氯仿溶解直接测定 。 1. 4 液相色谱检测磷脂的含量
【Abstrct】 O bjective: To detect membrane phospholip ids and study the relationship of membrane phospholip ids with genesis of gastric cancer. M ethods:M embrane phospholip ids of P I, PS, PE, and PC were detect w ith high per2 formance liquid chromatography. Results: In p rimary foci and paratumor gastric mucosa of 30 cases, the content of P I were (mg/ g) : 1. 69 ±0. 09, 1. 18 ±0. 10 respectively, PS 0. 55 ±0. 04, 0. 54 ±0. 04 respectively, PE 52. 57 ±5. 58, 27. 54 ±3. 36 respectively, and PC 121. 36 ±6. 49, 62. 90 ±5. 02 respectively. The contents of P I , PE and PC were higher in p rimary foci than in paratumor mucosa ( P < 0. 01). PS in p rimary foci and paratumor gastric mucosa was not significantly different( P > 0. 05). Conclusion:M embrane phospholip ids have obvious variations in genesis of gastric cancer. R ises of P I, PE and PC were associated w ith genesis of gastric cancer. 【Key words】gastric cancer; cell membrane; phospholip ids
30例胃癌患者原发灶及癌旁黏膜组织的细胞膜磷脂色 谱峰出现的顺序依为 P I、PS、PE、PC,不同组织色谱检测结果 分别见图 1。
图 1 细胞膜磷脂色谱图
胃癌原发灶 (A ) 、癌ห้องสมุดไป่ตู้黏膜组织 (B )
胃癌原发灶 、癌旁黏膜组织中膜磷脂不同组分含量的检 组成 [5 ] ,使得肿瘤细胞膜磷脂含量相对正常细含量增加 。
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
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MODERN ONCOLOGY,M ay12010, VO I118, NO105
物大分子含量与结构的改变 、寻找新的诊断指标和治疗靶点 具有重要意义 。 1 材料与方法 1. 1 临床资料
30例样品均取自西安交通大学医学院第 一附属医院 2008年 2 - 3月间胃癌患者手术后新鲜标本 。其中男性 18 例 ,女性 12例 ,年龄 32 - 70岁 ,平均 56岁 。手术切除胃标本 后生理盐水冲洗净黏液和血污 ,切取 1 cm ×1 cm ×1cm 大小 组织 2块 ,一块取自肿瘤中心 (非坏死部位 ) ,另一块取自切 缘最远端 。所取组织一分为二 ,一块放入液氮中冷冻保存备 用 ;另一块 10%的福尔马林溶液固定 ,石蜡包埋 ,常规病理切 片染色检查 。 1. 2 实验材料
冷冻 离 心 机 , 真 空 浓 缩 仪 , pH 7. 4 低 渗 Tris 缓 冲 液 (10mmol/L pH 7. 4 Tris - HCl缓冲液 ) ;色谱分析系统为 LC - 2010AHT L IQU ID CHROMATOGRAPH ( SH IMAD IU ) ,配备 紫外检测器和自动进样阀 ;色谱工作站为 LC solution version 1. 22 sp1 ( SH IMAD IU ) ; 磷 脂 酰 肌 醇 ( P I) 、磷 脂 酰 丝 氨 酸 ( PS) 、磷脂酰乙醇胺 ( PE) 、磷脂酰胆碱 ( PC) 标准品均为
ZHANG J ia1 , YE Er - mai - ke1 , WAN G J ian - sheng1 , WU W en - an1 , WANG Si - cen2 , ZHANG M ing - xin1 , ZHOU Su - na1
1 F irst A ffilia ted Hospita l of X i’an J iaotong U n iversity, X i’an 710061, Ch ina; 2 S chool of M ed icine, X i’an J iaotong U n iversity, X i’an 710061, Ch ina.
测结果见表 1。原发灶及癌旁黏膜组织中 PS含量无显著差
细胞膜磷脂由 P I、PS、PE、PC组成 ,在本实验中 ,我们发
异 ( P > 0. 05) 。原发灶中 P I、PE、PC含量高于癌旁黏膜组织 现 P I、PE、PC 3种膜磷脂含量在肿瘤中增加且具有统计学差
( P < 0. 01) 。
异 ( P < 0. 01) , PS改变虽无显著性意义 ,但在肿瘤中含量也
Modern Oncology 2010, 18 (05) : 0855 - 0857
【摘要 】 目的 :检测胃癌原发灶及癌旁黏膜组织细胞膜磷脂含量 ,探讨其与胃癌发生的关系 。方法 :采用高 效液相色谱法检测胃癌原发灶及癌旁黏膜组织细胞膜 P I、PS、PE和 PC的含量 。结果 : 30例胃癌患者中原发 灶和癌旁黏膜组织中细胞不同膜磷脂的含量 (mg/ g) : P I为 1. 69 ±0. 09和 1. 18 ±0. 10; PS为 0. 55 ±0. 04和 0. 54 ±0. 04; PE为 52. 57 ±5. 58和 27. 54 ±3. 36; PC为 121. 36 ±6. 49和 62. 90 ±5. 02。癌与癌旁黏膜组织中 PS的含量差异无显著性意义 ( P > 0. 05) 。结论 :胃癌发生过程中胃癌原发灶中 P I、PE、PC含量高于癌旁黏膜 组织 ( P < 0. 01) 。胃癌原发灶与癌细胞膜磷脂发生了明显变化 , P I、PE、PC增高与胃癌发生有关 。 【关键词 】胃癌 ; 细胞膜 ; 膜磷脂 【中图分类号 】R730. 21; R735. 2 【文献标识码 】A DO I: 10. 3969 / j. issn. 1672 - 4992. 2010. 05. 06 【文章编号 】1672 - 4992 - (2010) 05 - 0855 - 03