PCR法制备地高辛标记探针斑点杂交

要
结果表明? 此 探 针 在 对 白 斑 综 合 症 病 毒 的 检 测@ 对虾暴发性流行病的诊断等方面具有很高的应用 关键词 多聚酶链式反应 $ 核酸探针 A 白斑综合症病毒 $ 中国对虾 ( A A ! " # %& & ’( B 5 4 8 * A B 5 4 8 5 & & 文章编号 * . . * C * D , $ , . . * ( . , C , . * C . 5
中图法分类号
在 已 报道的所有 对虾病 毒 中 + 白斑综合症病毒$ 毒 +%& %E F G H& 7 I G & J 9 K L I MH’F L N O & ’(
* Q 性强 + 危害大 + 地域分布及宿主范围广泛 P 且由于对虾的水生生活习性 @ + %& & ’ 的细胞内寄生
特 性以及 %& 到 目 前为 止 还不 能完全 控制 其疫情 + 人们 只能采 取 & ’ 的经水 和经口传播 途 径 + 措施进行综合预防 > 尽早发现和消灭传染源 + 果断切断传播途径 + 是目前最有效的预防措施 > 这 样就需要建立和完善灵敏 @ 准确 @ 高效 @ 快捷 @ 方便的检测或诊断方法 > 核酸斑点杂交法通过特 异性探针与病毒 1 具有快速 @ 准确 @ 简便易行等特点 > 本文运用 ! RS 的杂交检测病毒 + " #法 快速制备了地高辛 $ 标记探针 + 并用斑点杂交法检测白斑综合症病毒 + 以期为对虾暴发病 1 2 3( 的检测和快速诊断以及抗特定病原对虾的选育提供一种可靠 @ 实用的方法 >
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+ , 史成银 , 黄 雷质文 *
) ) ,
杨 冰 , 俞开康 * 战文斌 *
青岛 + , . . / ( $ *青岛海洋大学水产学院 + 青岛 + $ ,中国水产科学研究院黄海水产研究所 + , . 0 * (
摘
用! 探针长度为 4 探针的产量为 , 5 0 + * 8 -9 ; >此 6 7 : < = " # 法成功制备了 1 2 3 标记探针 + 探 针与随机引物合成探针检测样品灵敏度相近 >用此探针核酸斑点杂交法检测了 4 5尾中国对虾 > 价值 >
第/ *卷 第 ,期 , . . *年 /月
青 岛 海 洋 大 学 学 报
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! " # 法制备地高辛标记探针斑点杂交 检测白斑综合症病毒 $ %& & ’(
!讨
论
核酸克隆技术在对虾病毒方面的应用研究促使对虾病毒的基因检测技术迅速发展 J 常规
的核酸探针制备过程是 K 取得病毒核酸片断的克隆 后 K 将 所选 择的克 隆进行 大规 模培养 K 抽提 克隆质粒 K 酶切和电泳回收克隆片段 K 采用 L 六聚核苷酸随机引物和 MN 聚合酶 O1 5 3 P 片断 Q S T% U 标记的核苷酸进行标记反应 R 此法耗时长 操作繁琐 如果回收的克隆片断不纯 可能存在 J K K K
R V U 非特异性标记 J另一种探针制备方法是采用 " 的四对引 JM0 Y # $ 5 ? 5等 对对虾杆状病毒 W X " 物和斑节对虾杆状病毒 W 的两对引物随机连结 K 筛选出一对半随机引物 W 以 V % \ ] ^ _ V ! S Y K ZX [Y
进行 " 得到 _ 然 后用 L % b ‘a a [L MN 为 模板 K # $扩增K c d标记 " # $扩增 产 物 而 < @的 产 物 K R _ U 得到探针 J 但徐洪涛等 以 V 以从中国对虾纯化的 ‘a 却 % \ ] ^ _ V ! S为引物 K a [L MN 为模板 K 未扩增出预期产物 J但据 " 即 ‘a 基因组 L 以中国大陆 W eMfX c c c a [Y MN 部分序列设计引物 K 流 行 的 ‘a 该 文作者 称 为 " 得到 ! 然 % % a [W B MfX [Y L MN 为 模 板 进 行 " # $扩 增K < @的 产 物 K 后用 L c d 标记 " # $ 扩增产物而得到探针 J 本实验直接运用 " # $ 法快速制备 L c d 标记探针 K 探 针 的长度为 % 图] 在相同 条件 下 K 用" & _ W Y g < @ # $ 法 制 备的 L c d 标记探 针和试 剂 盒 探 针 检 测虾样 K 二者结果基本一致 W 图S 说明 " 对虾暴 Y J # $ 制备的 L c d 标记探针与本实验室研制的 h 发性流行病原核酸探针点杂交检测试剂盒 W 型Y 探针的灵敏度基本相同 J造成二者不完全一 i c 致的原因是因为本实验室所研制的探针是混合探针 K 较" # $ 法制备的单一探针有更多的标记 结合位点 K 所以后者比前者显色稍微弱一点 J 斑点杂交是最常用的一种较快捷的基因检测方法 J 根据杂交膜上点样斑点以有无或强弱 就能推测样品是否染毒以及染毒程度 J 此方法操作简便 K 所需试剂和仪器简单 K 一次可以对大
* 材料和方法
* 8 *实验中国对虾 $ ( 4 5尾中国对虾于 * B B B年 B月 *日取自青岛琅岈台 T U V W U X Y Z [ \ V U V Y \ Y 发病虾池和未发病虾池 >取其鳃丝 + 置于 & 本实验室研制 ( 保存 + 充分研磨后取上 ] ^!采样液 $ 清液待测 > * 8 ,! " # 法快速制备 1 2 3 标记探针 ! " # 法合 成 探 针 的模板 为含有 %& & ’1 RS 特异性 P * Q 片断的重组质粒 + 由 本 实 验 室 制 备A 正 向 和 反 向 引 物 亦 由 本 实 验 室 设 计A 其余试剂均购自 公司 >反应体系 $ 包含 * * . . ( . . ‘! * . @ * . # I _ E H < = < =* " # 缓冲液 @ < =* M^ K a a ! < =各 * M^
万方数据
S期
雷质文 K 等l " # $ 法制备地高辛标记探针斑点杂交检测白斑综合症病毒 W ‘a a [Y
S b !
图! " # $ 法制备探针斑点杂 交检测 % &尾中国对虾的结果 * ! + ’ ( ) , -. / 0 1 2 3 4 0 / ( 5 )6 7 8 9 : 7 8 , ; < . ( = ( > ? 2 ( 3 5< ;2 , -@ . 3 < -= A 1 3 @ = % &C* < ;" # $2 3= 2 B 2 D E F G H G I F I
图 0 核酸探针斑点杂交对比实验结果 G 0 # ] @ 4 R K^ K % a 6 V J _ e f g h i f g R H ‘ ^ @ ! @ j A V @ J 8‘ HV R KN ^ J ‘ K ! K k K 6 J N K !‘ H$ 5 FA 8 !‘ HV R KN ^ J ‘ K J _ b @ V N ^ J ! a I K !‘ H^ A 8 ! J 2N ^ @ 2K ^ 左图 试剂盒探针检测结果 右图 $ 5 F 法制备探针检测结果 图’ $ . 5 F 法制备 , 标记探针的电泳图 G ’ L ] @ 4 6 K I V ^ J N R J V J 4 ^ A 2J _ V R KN ^ J ‘ KN ^ J ! a I K !‘ H$ 5 F ’ W 7 : $ 5 F 2A ^ b K ^ % c Md 5 0 & C W $ 5 F 法制备的 , . 标记探针
R & U S U 可达上百个 Y 进行检测 K 可在基层条件一般的实验室进行 Jj 史成银等 R 和徐洪 量样品 W 3等 Q _ U 涛 等R 利用此种方法来检测 ‘a a [J 本 文 用 " # $ 法快 速 制备 地高辛 标记探 针斑 点杂交 检测 图! 通过与病理组织切 片以 及 原 位杂 交对 比分 析 K 表明 " % &尾中国对虾 W Y K # $ 法快速 制备地
万方数据
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& ’ ( ( +, / 1 & ’ ( ’ ( 9 : & 0 ! "# $ % ) *’ . 标 记混合物 & ) *0 23 34 5 6 ) *引物混 合 物 7 8 4 ) * ) *模 0 板7 混 匀 后< 进行一个热启动7 离心后加入 ’ 1 ( 9 : ; = > ?’ ( & 1 1 ?1 : ; 8 4 ) * 2@ 8 2@ 8 ) *# A B聚 合 酶< 进行 C 1个循环 7 = 0 ? C ( & 1 0 ? C ( & D 0 ? ’ : < D 0 ? 1 ? 保存 E取 ’ % % 2@ 8 2@ 8后 > ) *$ 5 F 产物 电 泳; 往剩余的 = = G ( ( 9 : & ’ ( ( ( ) *中 加 入 ’ ) *0 24 2* 糖 原 7 . 6 H I J 4 K 8 ) *0 23 L , # M7 N O 及C 置于 QD 用D / G ( : & ’ ’ > P ( ( ? 保存 ’ < > ?下 ’ C( ( ( ( ; ( S ) * 3* @ 5 6 ) *纯酒精 < R 4离心 C 2@ 8 冷 酒 精 洗 沉 淀 物; 沉 淀 晾 干< 用’ 置于QD > ?下 ’ C( ( ( ( < ( ( ( ?冰 4离 心 ’ 2@ 8 ) * ! ! O0 T 溶 解< 箱中备用 E 取上述 制备的 探针 ’ 在’ ’ G C$ < G 1 S 5 F 法制备的 , ) * . 标记探针的电泳及其产量测 定 琼脂凝胶中于 / 紫 外 灯 下 观 察 照 像E按 F ( < J I R K公 司 的 , .标记和检测试剂盒 U 电泳 ’ R 提供的方案测定 $ 7 W / C C 0 > / 0 ’ X 0 1 : * J V 5 F 法制备的 , . 标记探针的产量 E