液相色谱的分离机理及色谱柱

特点：
无需各组份都被检出、洗脱 需要标样，需要内标样 结果与进样体积无关
内标法定量（四）
对内标物的要求
化学结构与待测组分相似(同系物、异构体) 在样品中不存在 不与样品中组份发生任何化学反应 保留值与待测组分接近 浓度（响应值）与待测组分相当 其色谱峰与其他色谱峰分离好
峰面积百分比法定量
Ai 公式：C % = ×100% ∑ Ai
00 .0 00 .0 00 .5 10 .0 10 .5 20 .0 20 30 .5 .0 30 .5 40 40 .0 .5 50 .0 50 .5 60 .0 60 .5 70 .0
Mu s in te
Mu s in te
Mu s in te
5,000 4,000
响应值 ( 峰面积 )
3,000 2,000 1,000 0
液相色谱的分离机理及色谱柱
选HPLC参数时的基本考虑
溶解度 - 选择流动相的条件 分子量 - 在样品预处理或GPC分析时有用 样品的基质 - 考虑如何前处理 在基质中样品的含量 检测特性 - 有否紫外吸收? 荧光? 找出样品中不同组份之间的差异
摸索条件的重要线索
极性问题
溶剂 极 性
水 甲醇 异丙醇 乙腈 CNH2 THF ROH 乙酸乙酯 RCN 醛/酮 CH2Cl2 N(R)2 NO2 CHCl3 NH3X/ArOH/RCOOH
Beer's Law - BEER定律
光能量∶
P0 = 透过溶剂的光能量 P = 透过样品的光能量
A
B
光通量(透过率%)∶T=P/P0 吸光度∶ A = -log(T)= log(P0/P) 吸光度 = 单位吸光度 × 流动池长度 × 溶液浓度
即∶ A = abc
* 吸光度 AU 透过率 % * * * * 浓度 * * * * * 浓度
注意∶最小检测限不是一个单纯的检测器指标。它实际上是 评价整个色谱系统的指标，包括了色谱系统、分离机理、色 谱柱在内的综合性指标，信噪比亦如此
紫外-可见光检测器
基于样品池(S)中的样品对光产生吸收，有信号 差
如是可变波长检测器，还有分光系统(光珊) 流动池 光电二极管 灯 R
S
样品入口 Hg Zn Cd D2 254 214 229 可可
30 20 10 0
0
50
100 样样样 样
150
200
250
内标法定量（三）
计算公式：
校正因子∶RF( X i ) = 内标样响应值R( I .S ) × 标样浓度C ( X i ) 标样响应值R( X i ) 样品峰面积Ai 内标峰面积Ai.s.
未知组分的浓度∶Ci = RF( X i ) ×
1 .2 0
1 .0 0
0 .8 0
P ro p y lP a ra b e n
0 .6 0
0 .4 0
0 .2 0
0 .0 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0 4 .0 0 4 .5 0 5 .0 0 5 .5 0 6 .0 0
50 40
M in u te s
标准曲线
标样峰面积 内标样峰面积
非 极性
己烷 卤代烷烃 烷烃
COOCH 3
CH3
样 品的 能团 官
液相色谱的分离机理
正相 反相 体积排除 离子交换 其他
不同的分离模式是不同的机理
吸附色谱的分离机理
• 随着样品在固定 相上的吸附能力 由大到小 • 在色谱柱上的保 留由长到短
吸附色谱多为“正相色谱”，即固 定相的极性大于流动相的极性
同紫外检测器灵敏度有关的因素
信号强度(S)
从BEER定律可看出
样品的种类 样品浓度及进样的体积 检测池的长度
1AU
噪音 .25AU 10% 1%
所使用的波长，检测器的 时间常数
噪音(N)
流动相 所使用的波长，灯的能量 检测器的时间常数 非检测器因素 - 电噪音，泵脉动等
S/N = 1/0.1=10 S/N = 0.25/0.01 = 25
标准曲线
0
50
100 150 样 样 样样
200
250
外标法定量（三）
计算公式
校正因子∶RF( X i ) 标样浓度C ( X i ) = 标样响应值R ( X i )
未知组分的浓度∶Ci = RF( X i ) × 样品响应值Ai
特点
无需各组份都被检出、洗脱 需要标样 标样及样品测定的条件要一致 进样体积要准确
吸附色谱概述
分离基于样品的极性差异。 洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的 先被洗脱 常用的流动相∶
非极性有机溶剂，如己烷 乙酸等为添加剂
常用固定相∶
硅胶、氧化铝等。
分配色谱的分离机理
(A)正相分配
低极性化合物 高极性化合物 非极性端 极性端
(B)反相分配
分配色谱多为“反相色谱”，即固 定相的极性小于流动相的极性
紫外检测器的溶剂影响
不同种类溶剂有其截 止波长 溶剂的质量好坏对其 截止波长有影响 为何溶剂质量不好?
含紫外吸收的杂质 溶解在其中的氧气 缓冲液溶质的紫外吸 收
乙 腈
甲 醇
200
220
240
260
示差折光检测器
Differential Refractive Index Detector
No sample
20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗
色谱柱的存放
存放前的处理
除去杂质、盐
合适的存放溶剂 避免色谱柱床的干枯 避免机械震动 防止细菌生长 注意存放的温度
在线的保护装置
给色谱柱提供物理的保护
除去样品及流动相中的颗粒
给色谱柱提供化学的保护
防止分析柱被化学污染
装置
在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱
固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响
缺点∶
pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同
体积排除色谱的分离机理
Gel Filtration/Size Exclusion/Gel Permeation
凝胶色谱概述
凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC） 分离基于分子在溶液中的体积大小 洗脱次序：大分子先被洗脱 流动相不参与分离，只起溶剂作用 分离效率低 色谱行为容易预测
色谱柱的使用及保养
流动相的转换
特别是GPC柱
流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
色谱柱的清洗
对所做的样品要有充分的了解
用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗
硅胶柱的一般方法
先用甲醇洗去极性杂质 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化
键合相柱(烷基)的一般方法
如不用梯度：分离不理想
梯度条件的优化
压力曲线 梯度曲线
检测器
对检测器的要求
高灵敏度 可重现的设置 合适的带宽 快速或可变的时间常数 宽的线性响应 容易使用及保养 自我诊断功能
检测器的种类
996
电化学
示差折光 光电二极管矩阵 其他∶ 放射性、 其他 ∶ 放射性 、 质谱 热能、 热能 、 LALLS 蒸发质量、 蒸发质量 、 粘度 可调波长紫外/ 可调波长紫外 / 可见
即所谓：
保留时间相同，可能是同样的组份 保留时间不同，肯定不是同样的组份
用保留时间定性
用“标样”的保留值定出被测组份的位 置
0.40 0.35
Ethylparaben
0.30
Propylparaben
0.25
AU
0.20
Uracil
0.15
0.10
0.05
0.00 0.00
0.50
1.00
1.50
样品浓度
定量校正曲线
曲线A：
因在零浓度时仍有色谱峰， 可能有杂质未分开
B C A D
曲线B：
在此浓度内，检测器的响应 值是非线性的
曲线C：
可接受的理想状态，实际情 况应是∶其延长线到零点
曲线D：
表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也 可能 是样品制备时的损失
高效液相色谱仪的使用、保养 及注意事项
GPC的校正
分子量大于V0 或小于Vt 的分子 不能分离
液相色谱柱及分离机理的关系
从色谱方法上分
正相 / 反相 离子交换 分子体积排除 亲合
从柱子类型上分
分配 / 吸附 离子交换 凝胶 亲合
液相色谱的方法开发
（二）梯度方法
梯度洗脱的特点
优点
单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高
缺点
仪器设备要求高 不适合某些检测方式 柱需再生 定量分析的重复性较低
内标法定量（一）
配制一系列浓度的标样，其中加有内标 + 储存内标样 储存标样 样
工作标样
0
1
增加溶质的浓度 内标样浓度不变
2
3
4
内标法定量（二）
1 .8 0
M e th y lP a ra b e n
1 .6 0
实际色谱图
v o lts
1 .4 0
E th y lP a ra b e n B u ty lP a ra b e n
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
Minutes
进一步的确认
标准加入 同时用其他方法
其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色 谱柱） 其他检测器
PDA，光谱图比较、谱库检索 MS，质谱图解析、谱库检索
其他仪器方法
定量分析的具体内容
确定样品的类型，主要成分/痕量成分 使分析条件的分离度（R）大于：1.5 色谱峰的定性，峰一致性测定 检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围 用标样建立标准曲线 检查方法的准确度及精确度 用标样定期检查方法
分配色谱概述
反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 常用的流动相：
有机溶剂如甲醇、乙腈，水 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法
常用固定相：
碳十八、碳八、胺基等基团 反相色谱固定相多为键合相?
键合相色谱柱
以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、 碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点∶
特点：
各组分要全部流出、全部被检测，并对检测 器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做 到这点 与进样量无关 不需标样 简单
可接收的检测范围
校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范 围内有效，高或低于这些点都可能引起 计算错误
问题 线性
范围 检测 望的 所希
问题 敏度 灵
检测器响应
最高浓度标样
最低浓度标样
紫外灯的保养：
在分析前、柱平衡得差不多时，打开 检测器；在分析完成后，马上关闭检 测器。
在线过滤器
防止颗粒在色谱柱头累积 优点：基本不影响柱效
保护柱
可避免化学污染。
色谱泵的保养
流动相要过滤 常用缓冲液时，停泵前要用水冲洗，并用水冲 洗柱塞杆清洗孔 拧紧排液阀时，不要太用力，以不渗液为准 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性如不 互溶，要用一种中间溶剂过渡，要防止沉淀 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样 品的交叉污染；
痕量分析
如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要：
分析前浓缩样品 选择高灵敏度检测器 用衍生法
使色谱体系最优化
使用短的微径柱（减少样品的稀释） 使用高效色谱柱 使k'值尽可能小 增加进样体积和浓度 使用低流速（N增加） 采用梯度淋洗
常用的定量方法
峰面积百分比法
由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用
S R
LAMP
LED or Incandescent
With sample
S R
To Amplifier
示差检测器的注意事项
不能做梯度实验 最大的池耐压是 100 psi 流速范围是 0.3 - 10 ml/min.
液相色谱的定性及定量技术
色谱峰源自文库性
鉴别每个色谱峰
通过比较保留值(通常是保留时间)的方法， 找到各色谱峰所对应的组份 大多数情况下用比较保留时间来定性
05 .1
05 .1
00 .1
00 .1
05 .0
05 .0
00 .0 00 .0 00 .5 10 .0 10 .5 20 .0 20 .5 30 .0 30 .5 40 .0 40 .5 50 .0 50 .5 60 .0 60 .5 70 .0
00 .0 00 .0 00 .5 10 10 .0 .5 20 .0 20 30 .5 .0 30 .5 40 40 .0 .5 50 .0 50 .5 60 .0 60 .5 70 .0
脉冲安培
荧光
电导
固定波长紫外 可编程紫外 / 可见 可编程紫外/
衡量检测器的指标
灵敏度∶ S = △R / △Q
△R是检测器响应值的增量 △Q是样品量的增量
噪音∶ 没有样品时检测器的最大输出信号 漂移∶ 检测器在一段时间内响应值的变化 线性动态范围∶最大线性相应与最小检出限之比 最小检测限∶样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度 信噪比∶S/N
外标法
在液相色谱中用的最多
内标法
准确，但是麻烦 在标准方法中用的最多
外标法定量
配制一系列已知浓度的标样
储存标样
工作标样
0
1
增加溶质的浓度
2
3
4
外标法定量（二）
00 .3
00 .3
00 .3
实际色谱图
05 .2 00 .2 05 .1 00 .1 05 .0
05 .2
05 .2
00 .2
00 .2