克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中应用
t细胞淋巴瘤tcrγ基因重排特征的分析及检测方法优化
Ｔ细胞淋巴瘤ＴＣＲＴ基Ｎ重排特征分析及检测方法的优化摘要研究背景与目的淋巴瘤在组织和细胞形态学方面与高度反应增生性淋巴组织的鉴别诊断十分困难，容易造成误诊。
淋巴瘤病理诊断是临床病理工作的难题之一。
目前国内主要依靠以形态学为主、免疫组化为辅的诊断手段。
随着分子生物学的发展，从基因水平研究和分析诊断疾病的技术不断出现并且日趋成熟，为淋巴瘤诊断提供了有效工具。
淋巴瘤是由单克隆淋巴细胞增生所致，而反应增生性淋巴组织则来自于多克隆淋巴细胞，这是二者的重要区别。
编码免疫球蛋白（Ｉｇ）或Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）的基因经过重排以后，不同克隆之间的重排基因互不相同，因此，基因重排对淋巴瘤的诊断具有特异性价值。
以ＰＣＲ技术为基础的方法以其简便、高效、廉价及适用面广而在淋巴瘤基因重排研究方面越来越受重视。
但不同研究文献中所采用的引物、ＰＣＲ条件、ＰＣＲ产物检测方法等都不尽相同，结果也有差异。
因此，难以找到适于常规临床病理诊断之用的标准程序。
Ｊｕｒｋａｔ细胞是Ｔ细胞淋巴瘤基因重排研究中常用的阳性对照细胞，但有关Ｊｕｒｋａｔ细胞基因重排的详细情况也未见报道。
假基因是Ｉｇ和ＴＣＲ胚系ＤＮＡ中常见的基因，有关假基因参与重排的情况以及在设计引物方面是否应将假基因包括在内也未见有关研究报道。
本实验以ＴＣＲ基因重排为研究对象，通过优化引物选择、ＰＣＲ条件及ＰＣＲ产物的检测方法等，分析Ｔ细胞淋巴瘤基因重排检测的最佳方法。
同时，分析ＴＣＲ基因重排的特点，为进一步研究ＴＣＲ基因重排提供理论和技术支持。
方法１以ＴＣＲｙ基因重排为研究对象，选用通用引物ＴＶＧ、ＶｖＩ及ＴＣＲ７家族特异性引物为工具。
用正交设计实验优化ⅥＩ引物的ＰＣＲ条件。
另选一对ＴＣＲ［ｊ通用引物作为ＴＣＲｙ引物的补充和比较。
２利用ＰＣＲ和测序研究Ｊｕｒｋａｔ细胞基因重排情况，分析ＴＣＲ基因重排的基本特点。
３ＰＣＲ产物检测方法①利用ＴＣＲ通用引物检测淋巴瘤克隆性基因重排阳性率，分别用琼脂糖电泳和ＳＳＣＰ分析ＰＣＲ产物；②将ＰＣＲ产物分别进行直接测序和克隆后测序，分析ＴＣＲ基因重排的特点及探索测序方法在基因重排检测中的应用；⑧分析ＰＣＲ产物中ＤＮＡ的克隆数与ＳＳＣＰ中条带数目的关系。
抗原受体基因重排克隆性分析淋巴瘤辅助诊断技术的发展和应用现状
Ａ Ｇ的种 系（ｅｍｉｅ 或称胚 胎 的（ｍｂ ｏｉ） 型均 由不连 续 的 Ｄ Ａ 片段 组成 ， 括 可变 区（ａｉ ｌ Ｒ ｇｒｌ ） ｎ ｅ ｒ ｎｃ 构 ｙ Ｎ 包 ｖｒ ｂ ａｅ
ｒｇ ｎ ， 、 ｅｉ ｓＶ） 变异 区（ ｉ ｒ ｔ， ） 连 接 区（ｏｎ ｇ Ｊ 和恒定 区（ ｏ ｓ ｎ， ， Ｊ Ｃ 区存在 于 各种 类 型 Ａ Ｇ ｏ ｄｖ ｓｙ Ｄ 、 ｅｉ ｊｉｉ ， ） ｎ ｃｎｔ ｔＣ） Ｖ、、 ａ Ｒ 中， Ｄ 区仅存在 于 ＩＨ 和 Ｔ Ｒ 及 ＾链基 因中。Ａ Ｇ基 因重排是 淋 巴细胞 完成发育分 化成 熟 的正常 生理 而 ｇ Ｃ１ ｙ ３ Ｒ
过 程， 早在 骨髓 淋 巴细胞 分化 阶段 ，Ｒ Ａ Ｇ基 因即发生重 排 ， 形成 Ｖ（ ） 连 续 Ｄ Ａ 片段 （ １ ， 而产生相 应 ＤＪ Ｎ 图 ）从
的抗 原 受体合 成。
基 因 Ｖ、 、 Ｄ Ｊ片段 的数 量愈 多， 产生 的组 合数也愈 多。该 步骤 可 产生许 多不 同的 Ｄ Ａ序 列， Ｎ 从而编 码 出 不 同的蛋 白质 ， 虽然 它们 的差别及 其微 小 ， 却具 有独立特 异性 。基 因重排 过程使种 系 中承载 的相对有 限的 但
李 挺 ， 幼立 祖
（ ． 京 大学 第 一 医 院 病理 科 ， 京 １北 北
Ｃ ｒｅ ｎｖ ｒ ｔ ， Ｓ ｏｎ ｌ Ｕ ｉ ｓ ｙ Ｕ Ａ） ｌ ｅｉ
１０ ３ ；． ｅａｔ ｅｔ ｆ ｅ ａ ｐｔ ｌｇ， ｅＭｅ ｏｉ ｏｐ ａ， ｉ ｄ ａ Ｃ ｌ ｇ ００ ４２ Ｄ ｐｒ ｎ ｍ ｔ ａ ｏｏｙ ｔ ｔ ｄｓ Ｈ ｓｉ ｌＷｅ ｌ ｉ ｌ ｏｌ ｅ ｍ ｏＨ ｏ ｈ ｈ ｈ ｔ ｔ ｌＭｅ ｃ ｅ
遗传 学信息 转变为大量 的基 因片段 ， 而再编码 为 Ｉ和 Ｔ Ｒ分子 的抗原结 合部位 。这 些不连接 片段 的重新 从 ｇ Ｃ 洗牌和连接从 统计学水 平上 阐释 了人体 免疫 系统 发 生的抗 原 受体 的多变性 。据估 计 ， 因重排机 制 可产 生 基
PCR技术在淋巴系统恶性肿瘤患者MRD检测中的应用
国外医学临床生物化学与检验学分册2004年1月第25卷第1期Foreign Medical Sciences.Section of Clin Biochem &Lab Med ,January 2004 ,Vol 25 ,No.1·综述·PCR 技术在淋巴系统恶性肿瘤患者MRD检测中的应用公衍文综述府伟灵审校【摘要】基于PCR 技术检测MRD 的方法多种多样,如共同引物和特异引物PCR , RT2PCR ,ASO2PCR ,SSCP2PCR ,荧光PCR 结合毛细管电泳技术以及定量的竞争PCR 和实时定量PCR(RQ2PCR) 、LightCycle RQ2PCR 等。
各种方法均有其优缺点及适用情况,合理选择才能获得所需的灵敏度和特异性。
【关键词】白血病; 微小残留病; 聚合酶链反应临床治疗达到完全缓解(CR) 后,用传统形态学方法不能检测出的体内残留的微量恶性肿瘤细胞,即微小残留病变(minimal residual disease ,MRD) ,是淋巴系统恶性肿瘤复发和移植治疗失败的根本原因。
MRD 的动态监测为临床建立个体化治疗方案、预后判断、移植疗效观察等所必需。
目前检测MRD 最常用的方法是基于(多参数) 流式细胞技术和PCR 技术的各种方法。
由于PCR 具有灵敏度高、特异性好等优点而应用更为广泛, 各种各样的基于PCR 检测MRD 的技术层出不穷。
本文着重探讨这些方法的特点及应用情况,而方法本身的原理不在本文讨论之列。
抗原受体基因重排的检测正常淋巴细胞抗原受体( IgH、Igκ、TCRγ、TCRδ等) 基因重排是多克隆的,经PCR 扩增后电泳多成片状;淋巴系统恶性肿瘤细胞则为单克隆或寡克隆,电泳呈现单一条带或紧邻的数个条带,因此可将之作为MRD 检测的标志。
1．共同引物和特异引物PCR :目前临床常用来自V 区和J 区的共同保守序列作为扩增重排基因的引物,但存在的一些因素可导致假阴性结果而影响其敏感性。
免疫细胞克隆扩增技术及其在肿瘤治疗中的应用
免疫细胞克隆扩增技术及其在肿瘤治疗中的应用随着医学技术的不断进步，免疫治疗被越来越多的科学家和医生看做是未来治疗癌症的有效手段。
而免疫细胞克隆扩增技术（Immune Cell Clonal Expansion）则是实现免疫治疗的一项核心技术。
本文将会介绍该技术的原理和在肿瘤治疗中的应用。
免疫细胞克隆扩增技术原理作为人体对细胞异常增殖的反应，免疫系统会产生针对癌细胞的攻击。
研究发现，其中的效应T淋巴细胞是实现人类自然免疫的关键。
然而情况并不总是如此理想，因为T细胞可能无法识别肿瘤细胞。
而肿瘤细胞能够通过多种机制逃避T细胞免疫的攻击，从而避免被清除。
为了解决这个问题，科学家们想到使用免疫细胞克隆扩增技术。
这项技术可以从患者体内采集到一群T细胞，然后在实验室进行分离纯化、鉴定、扩增和增殖，得到充足的T细胞，再通过一定的方法引导这些T细胞去攻击癌细胞。
这样就可以进行个体化肿瘤免疫治疗，而不需要使用传统的放射治疗、化学治疗等疗法。
具体地，免疫细胞克隆扩增技术包括以下几个步骤：1.采集样品：从患者体内采集外周血、腫瘤、脂肪等组织样品。
2.纯化、鉴定：使用流式细胞术（FACS）或磁珠分选等方法来纯化出患者体内的T细胞，并对这些T细胞进行鉴定。
3.合成：将患者体内T细胞的表面上的抗原（Peptide）与一种分子（MHC分子）结合，从而制成一种复合物。
接着，将复合物放入细胞培养基中培养。
4.扩增和增殖：通过将上述合成的Peptide-MHC复合物与刺激T细胞的物质一同作用，促使T细胞内的免疫元件活跃起来，不断增殖。
经过若干次的增殖和筛选之后，得到大批能够针对某抗原发生反应的T细胞。
5.治疗：将扩增和增殖出的T细胞注入患者体内进行治疗。
免疫细胞克隆扩增技术在肿瘤治疗中的应用肿瘤是一类常见的疾病，目前治愈率较低，因此免疫细胞克隆扩增技术被广泛应用于肿瘤的治疗。
目前，免疫细胞克隆扩增技术在肿瘤治疗方面被广泛应用，特别是对于晚期肿瘤、难治性肿瘤和复发转移性肿瘤都有较好的效果。
淋巴瘤基因克隆性重排检测
淋巴瘤应用基因重排检测进行辅助/鉴别诊断的方案
注意事项
▪ 检测到克隆性重排未必一定发生恶性病变 某些良性增生也可呈克隆性重排，如CD8+T细胞淋巴增 生性病变、良性单克隆性丙种球蛋白病、皮肤淋巴瘤样 丘疹病、免疫缺陷患者严重的EB病毒感染等；
▪ 检测不到克隆性重排也不能排除恶性病变 某些明确恶性病变的免疫缺陷患者中偶尔检测不到克隆 性重排，NK/T细胞淋巴瘤中IG和TCR基因呈胚系结构， 即也无克隆性重排。
▪ 辅助诊断：少见类型淋巴瘤，如肝脾T细胞淋巴瘤 ▪ 亚类分析：明确是B淋巴恶性增殖还是T细胞恶性增殖 ▪ 区分同一患者两种淋巴细胞恶性肿瘤，包括复发与继发淋巴瘤 ▪ 微小残留病灶监测，评估治疗效果或复发风险（NGS方法） ▪ 细胞免疫治疗监测，监测回输T细胞增殖状况和淋巴组织来源肿
瘤细胞清除效果（NGS）
淋巴瘤基因克隆性重排和 IGHV体细胞超突变检测
血液肿瘤（常规肿瘤）检测方案-
MICM综合分子检测(旌准方案)
形态学
（Morphology）
分子生物学
（Molecular） • 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) • 毛细管凝胶电泳(CE) • 荧光实时定量 PCR(RTQT-PCR) • 一代测序(Sanger) • 二代测序(NGS)
胞
B-Cell Receptors (BCR) /Immunoglobulins (Ig) T-Cell Receptor (TCR)
蛋白
Ig重链 Ig轻链 Ig轻链
基因
IGH IGK IGL
染色体定 位
14q32 2p12 22q11
蛋白
TCRα TCRβ TCRγ TCRδ
基因 染色体定 位
TRA 14q11
PCR和FISH技术在子宫颈淋巴瘤与淋巴瘤样病变诊断和鉴别诊断中的作用
PCR和FISH技术在子宫颈淋巴瘤与淋巴瘤样病变诊断和鉴别诊断中的作用摘要】目的分析子宫颈淋巴瘤样病变与淋巴瘤临床分别采用PCR、FISH技术诊断、鉴别的效果。
方法对我院2015.1-2017.9期间收治的5例子宫颈淋巴瘤样病变、8例原发性子宫颈弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者回顾性分析，观察患者临床分别以FISH检查、PCR-IgH重排检测诊断情况。
结果 DLBCL者均发生IgH基因重排，同时间期FISH检测IgH 、bcl-6基因断裂，bcl-2 、myc基因未断裂；子宫颈淋巴瘤样病变PCR—IgH检测， 2例出现单克隆重排；间期 FISH检测无IgH、bcl-2、myc、bcl-6基因断裂，1例myc 基因多拷贝现象。
结论 FISH 检测能帮助临床鉴别、诊断子宫颈淋巴瘤样病变、淋巴瘤疾病，可临床推广应用。
【关键词】FISH；淋巴瘤；PCR；淋巴瘤样病变淋巴瘤是临床较见为常见的疾病类型，但原发性子宫颈淋巴瘤发病率较低，相关数据统计显示其发病率仅为非霍奇金淋巴瘤的0.5%，目前原发性瘤体免疫表型以B细胞多见，其中DLBCL为发病率最高原发性淋巴瘤疾病[1]。
子宫颈淋巴瘤样病变是病理特征表现受良性炎症刺激淋巴组织增生主线增生的一种疾病，由于疾病临床在活检中有B细胞浸润情况，导致临床时容易出现误诊，将淋巴瘤样病变与淋巴瘤混淆[2]。
本文观察子宫颈淋巴瘤样病变与淋巴瘤者临床分别以PCR、FISH技术诊断、鉴别的情况，旨在为后期临床疾病诊断提供依据。
1资料与方法1.1一般资料对2015.1-2017.9期间收治的5例子宫颈淋巴瘤样病变、8例原发性子宫颈弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者回顾性分析，患者入院后取活检标本、附件切除标本行PCR、FISH检测，患者年龄区间37～70岁，平均（52.9±4.3）岁。
1.2方法PCR—IgH检测选择半巢式 PCR 方法，将两组引物分别扩增到IgH基因的CDR III 和 CDR II 区，第一轮引物为FR2A 或 FR3A和LJH ，第二轮引物为FR3A 和V LJH或FR2A.其中FR3A 片段大小为 80～120 bp，FR2A为240～280bp，阳性对照为淋巴瘤组织标本DNA（有单克隆性重排），阴性对照组为无模板DNA的PCR扩增产物、增生淋巴结组织DNA。
T细胞性淋巴瘤诊断中TCR基因重排检测的应用
T细胞性淋巴瘤诊断中TCR基因重排检测的应用潘鑫艳;杨长绍;黎贵芸;杨举伦;王丽【摘要】目的：探讨T细胞受体( T cell receptors, TCR)基因重排检测对T细胞性淋巴瘤诊断的价值。
方法收集T细胞性淋巴瘤30例和淋巴反应性增生组织30例,提取DNA,应用BIOMED-2引物系统中的56条引物进行PCR扩增,核酸分子异源双链凝胶电泳分析结果。
结果30例T细胞性淋巴瘤标本中TCRβ、TCRγ、TCRδ的检出率分别为83．3%(25/30)、93．3%(28/30)、13．3%(4/30),三者联合检测的检出率为96．7%(29/30),30例淋巴反应性增生组织中均未检测出TCR 基因重排。
结论利用BIOMED-2引物系统检测TCR 基因重排可作为T细胞性淋巴瘤的辅助诊断工具。
%Purpose To discuss the TCR gene rearrangements in the diagnosis of T-cell lymphomas. Methods Formalin-fixed and paraffin-embedded samples including 30 cases of T-cell lymphomas and 30 cases of reactive lymphoid hyperplasia were chosen for ex-tracting genomic DNA and PCR amplification using 56 BIOMED-2 primers. PCR products were analyzed by heteroduplex and polyacryl-amide gel electrophoresis. Results In all 30 cases of T-cell lymphomas, 25 cases (83. 3%) showed TCRβ gene monoclonal rear-ran gements, 28 cases (93. 3%) of TCRγ gene monoclonal rearrangements, 4 cases (13. 3%) of TCRδ gene monoclonal rearrange-ments. 29 cases (96. 7%) with TCRβ+TCRγ+TCRδ gene monoclonal rearrangements were detected. but no clonal TCR gene rear-rangements were found in 30 cases of reactive lymphoid hyperplasia. Conclusions The detection of TCR gene rearrangements using BIOMED-2 primers is a useful assistant method for the diagnosis of T-cell lymphomas.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】4页(P400-403)【关键词】T细胞性淋巴瘤;基因重排;BIOMED-2;TCR基因【作者】潘鑫艳;杨长绍;黎贵芸;杨举伦;王丽【作者单位】成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032【正文语种】中文【中图分类】R733.4非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)包括B细胞性淋巴瘤(B-cell lymphoma)和T细胞性淋巴瘤(T-cell lymphoma)，因T细胞性淋巴瘤种类繁多，分类复杂，病理诊断较难。
女性患者下生殖道淋巴组织高度反应性增生(淋巴瘤样病变)：一种具有免疫球蛋白重链克隆性基因重排的良
者 的传染病史 ， 新鲜组织 未经 固定 传染性极 强 ， 冷冻操 作时
要 养 成 戴 手 套 的 习惯 。遇 到 肝 炎 或 梅 毒 患 者 的标 本 时 ， 冷 在
透性好 ， 但极易挥发且有 异味 ， 应用 时要 随时盖 紧容 器。我 们建议使用 ９ ％ 乙醇 固定 １～２ ｍ ｎ 固定 时 间短 ， 果 甚 ５ ｉ， 效
［ 骆 新 兰 ． 冻 切 片常 见 问题 探 讨 ［ ］ 临床 与 实 验 病 理 学 杂 志 ， ４］ 冷 Ｊ．
１９ ，５ ４ ：７ ． ９ ９ １ （ ） ２３
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国外期刊文摘 ・
女 性 患 者 下 生 殖 道 淋 巴组 织 高 度 反 应 性 增 生 （ 巴 瘤 样 病 变 ） 一 淋 ： 种具 有 免 疫 球 蛋 白重 链 克 隆 性 基 因重排 的 良性 病 变
［ ］ 陈乐真． ３ 手术 中 病 理 诊 断 ［ ］ 北 京 ： 民军 医 出版 社 ，９ ４ Ｍ ， 人 １９ ：
５．
觉与石蜡切片反差不大 ， 这样 的切 片才是 一张合格的冷冻切
片， 只有 这 样 的切 片 才 能 为 快 速 而 准 确 的诊 断 提供 保 障 。 ３８ 关于消毒及清洁 ． 病 理 科 在 预 约 冷 冻 时 一 定 要 了 解 患
８１ ．
习惯 ， 以便 总 结 经 验 。镜 下 观 察 胞 质 与 胞 核 应 红 蓝 对 比鲜 明， 细胞 无 明 显 收 缩 ， 织 无 人 为 裂 隙 ， 有 或 极 少 形 成 冰 组 没 晶， 刀痕 少 ， 要 观 察 的 肿 瘤 或 组 织 结 构 能 较 完 整 地 呈 现 ， 主 感
临床 与实验病理 学杂志
ＪＣｉ ｘ ａｈｌ ００Ｊｎ ２ （ ） ｌ Ｅｐ Ｐ ｔｏ ｎ ２ １ ａ ；６ １
IgH基因单克隆重排检测及其在B细胞性非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用
IgH基因单克隆重排检测及其在B细胞性非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用李银珍;王芳;邵琼;张旭;邓玲;汤涛;张晓;吴秋良【摘要】AIM: To establish a reliable and feasible protocol for detection of monoclonal immunoglobulin heavy chain (IgH) gene rearrangements for routine diagnosis of B - cell non - Hodgkin lymphoma ( B - NHL). METH-ODS : Using the primer combinations of FR2, FR3, LJH and VLJH, modetube A + tube B, and semi - nested PCR, the monoclonal IgH gene rearrangements in 121 cases of B - NHL, 58 cases of T - cell non - Hodgkin lymphoma ( T - NHL) and 19 cases of reactive lymphoid hyperplasia were detected. The differences of clonality detection rate between B - NHLgroup and T - NHL group, B - NHL group and reactive lymphoid hyperplasia group, and between the use of FR2, FR3 and FR2 + FR3primers were analyzed. RESULTS: The clonality detection rates of B - NHL, T - NHL and reactive lymphoid hyperplasia were 81% (96/118), 4% (2/54)and 0% (0/19). There were remarkable differences between B - NHL group and T - NHL group, B - NHL group and reactive lymphoid hyperplasiagroup in monoclonal IgH gene rearrangements ( P < 0. 05 ) . In B - NHL group, monoclonality was found in 58% of the cases using primer FR2, 55% using FR3 , andrn81% using the combination of both primers, with significant differences (P <0. 05) . CONCLUSION: Using the primer combinations of FR2, FR3 , LJH and VLJH, detection of paraffin - embedded tissues, the method of tube A + tube B mode and semi -nested PCR for determining monoclonal IgH gene rearrangements is feasible and reliable, and the clonality de-tection rate is high enough for clinical diagnosis of B - NHL.%目的:建立准确可靠、操作性强、适用于临床实际工作的免疫球蛋白重链(immunoglobulin heavy chain,IgH)基因单克隆重排检测方法,用于B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin lymphoma,B-NHL)的辅助诊断.方法:采用骨架区(framework region,FR)引物FR2、FR3和重链连接区(joining region of heavy chain,JH)引物LJH、VLJH组合、A管+B管模式、半巢式聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法对121例B-NHL、58例T细胞性非霍奇金淋巴瘤(T-cell non-Hodgkin lymphoma,T-NHL)和19例淋巴结反应性增生的石蜡组织进行IgH基因单克隆重排检测,分析IgH基因单克隆重排检出率在B-NHL组、T-NHL组和淋巴结反应性增生组中的差异,以及B-NHL中联合应用FR2和FR3与单独应用FR2、FR3之间IgH基因单克隆重排检出率的差异.结果:118例成功检测的B-NHL中,IgH基因单克隆重排检出率为81%(96/118);54例成功检测的T-NHL中,IgH基因单克隆重排检出率为4%(2/54);19例成功检测的淋巴结反应性增生中未检出IgH基因单克隆重排.B-NHL组与T-NHL组、淋巴结反应性增生组相比,IgH基因单克隆重排检出率差异具有显著性(P<0.05).B-NHL中,FR2基因单克隆重排检出率为58%(68/118),FR3基因单克隆重排检出率为55%(65/118),联合应用FR2和FR3,IgH基因单克隆重排检出率为81%(96/118),联合应用FR2和FR3与单独应用FR2、FR3的检出率有显著差异(P<0.05).结论:采用FR2、FR3、LJH及VLJH引物组合、A管+B管模式和半巢式PCR法进行石蜡组织IgH基因单克隆重排检测,简单易行,结果准确可靠,阳性率较高,可用于临床B-NHL的辅助诊断.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2012(028)011【总页数】5页(P1994-1998)【关键词】淋巴瘤;免疫球蛋白;基因重排【作者】李银珍;王芳;邵琼;张旭;邓玲;汤涛;张晓;吴秋良【作者单位】华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心病理科,广东,广州,510060【正文语种】中文【中图分类】R733.4免疫球蛋白重链(immunoglobulin heavy chain，IgH)基因单克隆重排是B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B－cell non－Hodgkin lymphoma，B－NHL)的重要特征，国内外病理界已达成一致共识:应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术检测IgH基因单克隆重排可以辅助诊断BNHL[1－3]。
基因组学技术在肿瘤诊断和预后中的应用
基因组学技术在肿瘤诊断和预后中的应用随着科技的不断进步和研究的深入，基因组学技术在肿瘤诊断和预后中扮演着越来越重要的角色。
本文将探讨基因组学技术在肿瘤学领域的应用，并分析其对肿瘤诊断和患者预后评估的重要性。
一、引言肿瘤诊断和预后评估是肿瘤学领域的核心问题，准确的诊断和及时的预后评估对于患者的治疗和生存率至关重要。
传统的肿瘤诊断方法主要依靠组织病理学分析和影像学检查，然而，它们在一些方面存在着局限性。
近年来，基因组学技术的迅速发展为肿瘤诊断和预后带来了新的机遇。
二、基因组学技术在肿瘤诊断中的应用1. 基因突变检测基因突变是肿瘤发生和发展的重要因素。
基因组学技术可以帮助鉴定与肿瘤相关的突变，并提供更准确的诊断依据。
例如，通过测序技术可以检测到肿瘤细胞中的基因突变情况，从而确定特定靶向治疗的可行性。
2. 基因表达分析基因表达的异常与肿瘤的产生相关联。
通过基因组学技术，可以测定肿瘤细胞中的基因表达模式，并与正常细胞进行比较。
这样可以发现异常基因表达，并据此诊断不同类型的肿瘤。
三、基因组学技术在肿瘤预后中的应用1. 个性化治疗选择基因组学技术可以帮助确定肿瘤的分子亚型，从而指导个体化治疗方案的选择。
通过对患者肿瘤样本的基因组分析，可以预测特定治疗方法的疗效，并避免对无效治疗的浪费。
2. 预测预后基因组学技术可以分析肿瘤细胞中的多种基因变化，并据此评估患者的预后情况。
通过对大量病例数据的统计分析，可以建立预后模型，预测患者的存活率和复发率等重要指标。
四、技术挑战和前景展望基因组学技术在肿瘤诊断和预后中的应用面临着一些技术挑战。
首先，高通量测序技术的精准性和可靠性仍然需要提高。
其次，大规模数据的分析和处理需要更加高效的算法和计算平台。
然而，尽管存在一些挑战，基因组学技术在肿瘤学领域的应用前景依然广阔。
随着技术的不断发展，基因组学技术将成为肿瘤诊断和预后评估的重要工具。
结论基因组学技术在肿瘤学领域的应用已经取得了显著的进展，并在肿瘤诊断和患者预后评估上发挥着重要作用。
淋巴瘤基因克隆性重排检测
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IGH, IGK, TRB , TRG IGHV
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IGHV SHM的检测
结合 Leader 和 FR1 区域的引物在 5’端连接有通用的测序片段，这种设计，配合 JH 反向测序引物，能 够实现 PCR 扩增产物的双向测序。目前，欧洲慢性淋巴细胞性白血病研究机构（European Research Initiative on CLL，ERIC）的指南即使用双向测序判断 IGH V区体细胞超突变（Somatic Hypermutation， SHM）状态。
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基于PCR检测技术，简便、快 速、成本较低，所需DNA量少， 对DNA质量要求不高。灵敏度 高于10%，需配制胶，安全清 洁性较差。
基于PCR-毛细管电泳检测技术， 敏感性高，检测周期较长，结 果更加直观可靠
目前市场最被接受的检测方法。 灵敏度无法满足MRD要求，难 以定量和得到序列。
目前市场最被接受的检测方法。 灵敏度无法满足MRD要求，难 以定量和得到序列。
IGH, IGK, IGL, TRB ,TRD, TRG（BIOMED-2方案，唯一授权） IGHV（依据ERIC指南）
新兴技术，更高灵敏度（10-6），更 高分辨率，更高的通量，更广泛的 应用。但成本高，仪器贵，操作复 杂，时间长。
1-5年
9.2-18.9年
OS
3.2-10年
17.9-25.8年
预后
不良
良好
PFS：无进展生存期（Progression free survival） OS：总生存期（Overall survival）
IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤中的的诊断价值
IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤中的的诊断价值目的：探讨IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤的中的诊断价值。
方法：用PCR凝胶电泳检测B细胞非霍奇金淋巴瘤中IgH基因克隆性重排。
结果：43例B细胞非霍奇金淋巴瘤中，39例用FR3A引物检测阳性，阳性率90.7%；22例用FR2A引物检测阳性，阳性率55.2%；FR3A或者FR2A引物联合检测的总阳性率为90.7%。
结论：PCR凝胶电泳技术检测IgH基因克隆重排对B细胞非霍奇金淋巴瘤的诊断有重要的辅助价值。
标签：B细胞非霍奇金淋巴瘤IgH基因克隆重排淋巴瘤作为我国常见恶性肿瘤之一，从分子病理学和分子遗传学水平来探讨相关基因的特征和发病机制，以期建立相应的分子标记，进一步协助诊断、判断预后[1-2]。
淋巴瘤组织学形态多样，免疫组化染色可鉴定淋巴瘤的类型，但无法解决良恶性鉴别难题。
近年来，国外用分子生物学技术证实，细胞增殖的单克隆性可协助肿瘤的诊断。
本研究应用PC R方法检测B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中免疫球蛋白重链（IgH）基因重排情况，探讨其在淋巴瘤诊断中的价值。
胚系状态下，IgH基因由可变区（V）、多变区（D）、连接区（J ）、恒定区（C）构成。
这些区域在染色体上分布是不连续，片断之间可有长度不等的插入序列将其分开，当淋巴细胞发育到一定阶段，在重组酶的作用下，重新排列组合构成一个有结构的基因，即所谓的基因重排。
正常B淋巴细胞免疫球蛋白重链（IgH ）基因重排为多克隆性，而恶性B细胞肿瘤表现为单克隆性。
因此，这种单克隆IgH 基因重排可用于B细胞淋巴瘤的诊断，对鉴别良、恶性淋巴细胞增生有重要的参考价值[3-5]。
1. 材料与方法1.1. 标本来源收集浙江大学附属医院，温州医学院2010-2013年间诊断的B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）石蜡标本43例，男性24例，女性19例，年龄17-75岁，平均年龄为52岁。
其中弥漫大B淋巴瘤（DLBCL ）30例，滤泡性淋巴瘤（FL）4例，粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）4例，套细胞淋巴瘤（MCL）3例，小细胞淋巴瘤（SLL/CLL）2例。
IgH重排在B-细胞淋巴瘤诊断和治疗中的临床意义
优化 Ｂｏ ｄ２引物 Ｐ Ｒ技术检测 ３ ｉ ｍｅ－ Ｃ ６例 中 ２ ６例 ＩＨ重排 阳 ｇ 性（ ５２ ７ ． ％） 以 Ｂｏ ｄ 引物联合 检测 ＩＨ Ｆ Ｉ 及 Ｆ ｌ ， ｉ ｍｅ 为 ｇ Ｒ Ｉ ＲＵ 区 检测率 达 到 ８ ．％ ， Ｆ 及 Ｆ 区 的 分 别 检 测 率 为 ６１ 而 Ｒ１ Ｉ ＲＵ ｌ ９ ％ 、０ ， ０ ７ ％ 研究者认 为优 化 Ｂｏ ｅ － ｉ ｄ２引物 技术 用 于固定 的 ｍ 钙化骨髓标本检测 ＩＨ重排 更为理 想。各种 改进 的 Ｐ Ｒ方 ｇ Ｃ 法有 ： １ Ｐ Ｒ Ｓ Ｃ （ （ ） Ｃ ．Ｓ Ｐ 单链 构象多态 性分 析 ） （ ） ； ２ 巢式 Ｐ Ｒ， Ｃ 半巢式 Ｐ Ｒ；３ Ｐ Ｒ Ｇ （ ｅｅｃ ｎ ｙｉ ｏ Ｐ Ｒ） （ ） Ｔ Ｃ （ ） Ｃ －Ｓ ｇｎ ｓａ ａａ ｓ ｆ Ｃ ；４ Ｒ － ｎ ｌ ｓ Ｐ Ｒ（ Ｃ 反转录 Ｐ Ｒ） （ ）ｅ －ｍｅ Ｃ 。而 目前常用 的是巢式 Ｃ ；５ ｒａ ｔ Ｒ ｌ ｉ Ｐ Ｐ Ｒ、 Ｃ 半巢式 Ｐ Ｒ、 ａ ｔ Ｃ Ｒ －Ｃ （ Ｃ ｒｌ ｉ Ｐ Ｒ、 ＴＰ Ｒ 反转 录 Ｐ Ｒ） ｅ －ｍｅ Ｃ 。
恶性淋 巴瘤 是常 见 恶性 肿瘤 ， 其发 病率 有 逐 年升高 趋 势， 非霍奇金淋 巴瘤 （ Ｈ ） Ｎ Ｌ 组织 学形态 多样 ， 态学结 合免 形
技 术 检 测 ＩＨ基 因重 排 用 于 ＢＮ ｇ － ＨＬ的辅 助 诊 断 。Ｐ Ｒ技 术 Ｃ
的基本 工作原理是 以拟 扩增 的 Ｄ Ａ分子 为模 板 ， Ｎ 以一 对分 别与模板 ５’ 末端和 ３ 末 端相互 补 的寡核苷 酸片段 为 引物 ， ’ 在 Ｄ Ａ聚合酶 的作 用下 ， 照半保 留复 制 的机 制沿 着模 板 Ｎ 按 链延伸直至完成新 的 Ｄ Ａ合成 ， 复这一过程 ， Ｎ 重 即可 使 目的 Ｄ Ａ片段得 到扩增 ， Ｎ 将扩 增产 物加入琼脂糖凝胶电泳槽孔 中 进行电泳 ， 紫 外灯 下 利用 凝胶 成 像分 析 系统 成像 观 察结 在
基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用
基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用【关键词】淋巴瘤Detection and clinical significance of gene rearrangements in diagnosis of lymphomas【Abstract】 AIM: To establish a way to detect the gene rearrangements of IgH and TCR and to assess the application of the detection technique in the diagnosis of malignant lymphoma. METHODS: Fiftythree cases of malignant lymphoma and 20 cases of reactive lymphoid hyperplasia were chosen for making tissue sections. Genomic DNA was extracted， and amplified via PCR. The products were resolved on denaturing polyacrylamide gels and visualized through silver staining. RESULTS: Gene rearrangements of IgH and TCR were negative in 20 cases of reactive lymphoid hyperplasia. In all of 18 cases of T cellnonHodgkins lymphoma (TNHL)， gene rearrangement of TCR γ was found in 12 cases and that of TCR β was found in 3 cases， and IgH gene rearrangement was not found. IgH gene rearrangement was found in 28 cases out of 32 cases of B cellNHL (BNHL)，in 2 cases of which gene rearrangements of TCR γ and IgH were both found. There was IgH gene rearrangement in 3 cases of suspected lymphomas. There was a remarkable difference between NHL group and benign group in gene rearrangment (P<0.05). CONCLUSION: The detection of gene rearrangements of IgH and TCR by PCR can be a kind of subsidiary means to diagnose the lymphoproliferative disease. Particularly， the clonality showed in the formalinfixed and paraffinembedded samples may be useful in the retrospective researches.【Keywords】 lymphoma; gene rearrangement; polymerase chain reaction; neoplasm【摘要】目的：建立基于克隆性分析技术的B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，探讨B淋巴细胞免疫球蛋白及T淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊断中的应用. 方法：从组织蜡块中切取组织片5~10张，提取基因组DNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果. 结果：20例良性淋巴组织反应性增生病例中，淋巴细胞IgH及TCR基因重排均为阴性；18例T细胞非何杰金氏淋巴瘤中TCRγ基因重排12例，TCRβ基因重排3例，未见有IgH基因重排；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性，有2例TCRγ和IgH基因重排均阳性；3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排；IgH及TCR基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间，差异有显著意义(P<0.05). 结论：应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段，且适用于石蜡标本以进行回顾性研究.【关键词】淋巴瘤；基因重排；聚合酶链反应；肿瘤0引言恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤，主要发生于淋巴器官和淋巴组织. 根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏病（Hodgkins disease， HD）及非何杰金恶性淋巴瘤（nonHodgkins malignant lymphoma， NHL），淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE和免疫组化很难明确性质，另外NHL由于种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难.淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，其抗原受体(Ig和TCR)基因通过基因重排而形成有功能的基因. 一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记. 一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化，即可呈现特异的基因重排［1］. 因此，对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性疾病的诊断. 此研究拟应用这一手段，探讨淋巴组织增生性病变的性质，并对该技术在恶性淋巴瘤中的诊断价值进行探讨.1材料和方法1.1材料53例恶性淋巴瘤标本均来自第四军医大学唐都医院病理科（1995~2005）. 其中男性29例（55%），女性24例（45%）；年龄12~76岁，平均年龄44.2岁. 所有标本均为福尔马林固定、石蜡包埋组织. 其中B细胞非何杰金淋巴瘤32例，T细胞非何杰金淋巴瘤18例，未能定性的淋巴组织增生性病变3例. 20例良性淋巴组织反应性增生病例作为阴性对照. 所有淋巴瘤病例均在取PCR 模板前经临床病理HE和免疫组化标记（B细胞: CD20，CD79α; T细胞: CD3，CD45RO）证实，以确定为相应病例且所取部位确为病变部位，包含有需检测的部分. 3例未能定性的淋巴组织增生性病变怀疑为BNHL(免疫组化标记CD79α阳性)，但诊断仍未明确.1.2方法1.2.1石蜡包埋组织DNA的提取每例标本制备厚度为4 μm的切片6张，贴于载玻片上，常规烤片、二甲苯脱蜡、乙醇冲洗，切片自然干燥. 用无菌双面刀片将组织刮入1.5 mL的离心管中，按以前的方法［2-3］提取基因组DNA.1.2.2引物合成引物序列由上海生工生物工程技术公司合成. 引物序列为: β球蛋白基因内对照PC03：ACACAACTGTGTTCACTAGC， PC04：CAACTTCATCCACGTTCACC；免疫球蛋白基因重排(IgH) FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT， LJH： TGAGGAGACGGTGACC，VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG；T细胞受体基因重排(TCR β链和γ链)Db1: CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC， Jb2:AGCACTGTGAGCCTGGTGCC，TVG: AGGGTTGTGTTGGAATCAGG， TJX: CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC，Vγ11: TCTGGAGTCTATTACTGTGC，Vγ101: CTCACACTCTCACTTC，Jγ12:CAAGTGTTG TTCCACTGCC， Jp12: GTTACTATGAGCTAGTCC.1.2.3PCR扩增及循环条件PCR扩增在PT200型热循环仪（MJ Research）上进行. 反应体系为25 μL，含10 mmol/L dNTP（Gibco BRL）2 μL，10×缓冲液2.5 μL，50 mmol/L MgCl2 0.75 μL，Taq DNA聚合酶（Gibco BRL） 1 U，20 pmol/L引物1 μL，DNA样品1~5 μL. IgH基因采用半巢氏PCR扩增: 第一轮引物为FR3A和LJH，95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，62℃退火50 s，72℃延伸40 s，共30个循环; 最后72℃延伸10 min. 扩增产物经1∶100稀释后取1 μL进行第二轮扩增，引物为FR3A和VLJH，95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s，共30个循环; 最后72℃延伸10 min. FR 3A与VLJH扩增产物为100～120 bp.TCRβ和TCRγ采用40个循环，其中TCRγ引物为Vγ11，Vγ101和Jγ12或Vγ11，Vγ101和Jp12的混合物. 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，56℃退火50 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min. TCRβ扩增产物为65～85 bp. TCRγ各组扩增产物在70～200 bp不等.β球蛋白基因引物作为内对照进行扩赠，共40个循环. 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min. 产物长度为110 bp.1.2.4电泳及结果观察琼脂糖凝胶（20 g/L）电泳评价扩增效果后，将3 μL产物和等体积的上样缓冲液［4］（990 mL/L甲酰胺，1 g/L溴酚蓝，1 g/L二甲苯青）混匀后加到厚度为0.8 mm的聚丙烯酰胺凝胶（100 g/L，含尿素8mol/L），应用miniVE系统（AmershamPharmacia Biotech）泳动8 h（80 V）.取出后按以前的方法［2］银染，分别用UVP凝胶分析系统（UVP， Cambridge，UK）和光学照相记录数据，根据IgH及TCR相应阳性位置判断结果.1.2.5结果判定阳性结果判定标准：①PCR扩增电泳条带清晰，宽度不大于1 mm，边缘锐利；②片段大小与预计范围相符，与期望值相差不超过5 bp；③若出现期望值大小之外的其他条带或期望值内出现两条或以上可接受的条带，应判定为重排阴性.统计学处理：采用SPSS 10.0统计分析软件对组间率的差别进行χ2检验，以P<0.05为有统计学意义.2结果2.1组织学观察和免疫组织化学结果32例B细胞非何杰金淋巴瘤免疫组化证实CD20和(或)CD79α阳性， CD3和CD45RO阴性（图1）; 18例T细胞非何杰金淋巴瘤免疫组化证实CD3和(或)CD45RO阳性， CD20和CD79α阴性（图2），支持原来的诊断和分型. 3例未能定性的淋巴组织增生性病变免疫组化标记CD79α阳性， CD3和CD45RO阴性，怀疑为BNHL. 20例良性淋巴组织反应性增生病例CD20，CD79α，CD3，CD45RO均有不同程度的阳性表达.A: CD79а； B: CD20.图1BNHL组织中CD79а和CD20阳性表达（略）A: CD45RO； B: CD3.图2TNHL组织中CD45RO和CD3阳性表达（略）2.2基因重排检测结果2.2.1石蜡组织标本DNA检测PC03，PC04引物对良性增生的淋巴组织以及淋巴瘤组织DNA进行扩增，均见110 bp大小的β球蛋白特异条带（图3）.右侧泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：实验组TNHL. 黄色箭头为110 bp涌动位置;2：实验组BNHL；3：阳性对照TNHL（已知TCRγ重排阳性）；4：阳性对照BNHL（已知IgH重排阳性）；5：反应性增生淋巴组织作为阴性对照.图3PC03/PC04引物PCR扩增结果电泳图（略）2.2.2良性淋巴组织反应性增生病例结果20例良性淋巴组织反应性增生病变组织B细胞和T细胞抗原受体重排均为阴性（图4）.2.2.3阳性对照T，B淋巴瘤检测结果B细胞淋巴瘤阳性对照标本组织B细胞Ig重排阳性（图5）. T细胞淋巴瘤阳性对照标本组织T细胞TCRγ1重排阳性（图6）.右侧泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：IgH FR3A/LJH， FR3A/VLJH引物扩增产物；2：TCRβDb1/Jb2引物扩增产物；3：TCRγ1 TVG/TJX引物扩增产物；4：TCRγ2 Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物； 5：TCRγ3Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物. 黄色箭头为110 bp涌动位置.图4良性淋巴组织反应性增生病例PCR扩增结果电泳图（略）左侧泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：内对照PC03/PC04引物扩增产物；2：IgH FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物；3：TCRβDb1/Jb2引物扩增产物； 4：TCRγ1 TVG/TJX引物扩增产物； 5：TCRγ2 Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物；6：TCRγ3 Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；7：阴性对照FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物. 黄色箭头为110 bp涌动位置.图5阳性对照BNHL PCR扩增结果电泳图（略）2.2.4淋巴瘤组织检测结果18例T细胞淋巴瘤中TCRγ基因重排为12例，TCRβ基因重排为3例， TCR基因重排阳性率83.3%，与良性组（TCR基因重排均阴性）相比，差异有显著意义(χ2=15.10， P<0.05)；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性，其中2例TCRγ基因重排也阳性，基因重排阳性率87.5%，与良性组（IgH基因重排均阴性）相比，差异有显著意义(χ2=25.30， P<0.05).中间泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：TCRβDb1/Jb2引物扩增产物； 2：TCRγ3 Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；3：TCRγ2Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物；4：TCRγ1 TVG/TJX与内对照PC03/PC04引物扩增产物；5：阴性对照TCRγ1 TVG/TJX与内对照PC03/PC04引物扩增产物；6：阴性对照TCRγ2 Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物； 7：阴性对照TCRγ3Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；8：IgH FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物. 黄色箭头为110 bp涌动位置，红色箭头为190 bp涌动位置，红色箭头为80 bp涌动位置.图6阳性对照TNHL PCR扩增结果电泳图（略）2.2.5未确诊病例检测结果3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排，经FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物采用半巢氏PCR扩增后出现95 bp大小IgH阳性条带.3讨论恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤，主要发生于淋巴器官和淋巴组织. 淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE染色和免疫组化方法很难明确性质，另外NHL种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难［5］.干细胞在向淋巴细胞分化过程中， Ig重链基因(IgH)和T细胞受体(TCR)基因的可变区(V)和结合区(J)基因会发生重排［6］. 基因重排过程是一个正常的过程，正常淋巴细胞在发育中是多克隆性质，但淋巴造血系统肿瘤所具有的是单克隆性重排，也就是全部肿瘤细胞具有一个相同的免疫球蛋白或TCR 基因重排，即表现为重排基因为单一模式，这对研究淋巴细胞恶变的机制和解决临床的诊断问题都十分重要［6］. 检测单克隆性免疫球蛋白和T细胞受体基因有助于鉴别淋巴系统的肿瘤性和反应性增生，并确定细胞的来源.本研究中18例T细胞淋巴瘤中TCRγ基因重排为12例，TCRβ基因重排为3例， TCR基因重排阳性率83.3%，与Diss等［7］报道的T 细胞淋巴瘤78.2%的检出率相近. 而良性淋巴组织未见克隆性条带， TCR基因重排检出率在TNHL及良性淋巴结反应性增生之间相比，差异有显著意义(P<0.05). 说明TCR基因引物对T细胞性NHL的克隆性确定有重要价值. 32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性，基因重排阳性率87.5%，与Kros等［8］报道的B细胞淋巴瘤77%的检出率以及国内王萍等［9］报道的B细胞淋巴瘤72 %的检出率相近. 而TNHL及反应性增生均未见IgH克隆性基因重排， IgH基因重排检出率在BNHL及良性淋巴结反应性增生之间相比，差异有显著意义(P<0.05). 说明IgH基因引物对B细胞性NHL的克隆性和细胞源性确定有重要价值，可用于淋巴瘤的诊断和分型.B淋巴细胞产生的抗原受体分子Ig和T淋巴细胞产生的抗原受体分子TCR，其编码基因在细胞的分化过程中均发生重排. 一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记. 大量的实验已证实，淋巴细胞肿瘤源于单克隆性增生. 我们利用特定的引物对其基因进行扩增，当将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，多克隆淋巴细胞将产生一片弥漫带（见于反应性增生），而单克隆性增殖的淋巴组织则出现一明显条带（见于恶性淋巴瘤）.因此对于淋巴瘤的诊断，首先应依靠形态学检查，并辅以免疫组化结果，对于仍不能明确诊断一小部分病例得，可行基因重排检测，在本研究中有3例较难诊断病例，由于病理HE切片、免疫组化均不能做出明确诊断，通过运用PCR技术对其进行基因重排检测，有IgH的特异性重排条带，提示基因重排的检测对于识别此类交界性及淋巴瘤的早期发现可能具有重要价值.参考文献［1］ Garcia MJ， Delgado BM， Granizo JJ， et al. IgH，TCRγ and TCRβ gene rearrangement in 80 B and Tcell NonHodgkins lymphomas: Study of the association between proliferation and the socalled “A berrant” patterns［J］. Diag Mol Pathol， 2001， 10(2): 69-77.［2］王淑芳，苏勤，朱少君，等．多发性子宫平滑肌瘤的克隆性［J］．中华病理学杂志，2002， 31:107-111.［3］朱少君，苏勤，王淑芳，等. 女性外阴尖锐湿疣的克隆性［J］. 诊断病理学杂志， 2003， 10:81-84.［4］ Lucas DR， Shroyer KR， McCarthy PJ， et al. Desmoid tumor is a clonal cellular proliferation: PCR amplification of HUMARA for analysis of patterns of Xchromosome inactivation［J］. Am J SurgPathol， 1997， 21:306-312.［5］高子芬，潘增刚，裴斐，译. 女性生殖系统. 见: Juan Rosai，ed. 回允中，主译. 阿克曼外科病理学［M］. 8版. 沈阳: 辽宁教育出版社，1999. 1319.［6］朱平. 现代血液肿瘤诊断治疗学［M］ . 北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998:24-41.［7］ Diss TC， Watts M， Pan LX， et al. The polymerase chain reaction in the demonstration of monoclonality in T cell lymphomas［J］. J Clin Pathol， 1995， 48:1045-1050.［8］ Kros JM， Bagdi EK， Zheng P， et al. Analysis of immunoglobulin H gene rearrangement by polymerase chain reaction in primary central nervous system lymphoma［J］. J Neurosurg， 2002，97:1390-1396.［9］王萍，王瑞年，卢健，等. 非霍奇金淋巴瘤的IgH和TCRδ基因重排［J］. 临床与实验病理学杂志， 2002，18: 21-23.。
TCR重排
TCR重排一、临床意义：近年来小儿急性淋巴细胞白血病的发生日趋增多, 并且在成年人的发病率也呈增长的趋势, 虽然部分患者经过化疗或干细胞移植, 能够达到临床或血液学的完全缓解( Complete Remission, CR) , 但白血病微小残留病(Minimal Residual Disease, MRD) 导致白血病复发的问题一直困扰着医务人员。
目前检测MRD 的手段很多, 如流式细胞仪检测白血病细胞、RT-PCR 检测白血病基因等方法, 其中白血病基因检测具有灵敏度高的特点具有很高的参考价值。
然而淋巴细胞白血病因为不具有高特异性的白血病基因, 所以在MRD 的监测上比较困难。
1、TCR基因重排技术是检测淋巴细胞克隆性增生的金标准，应用于恶性淋巴瘤的早期诊断和鉴别诊断有重大意义，特别是对于经常规HE、免疫组化检测仍不能确诊的病例有较好的用途和前景。
非霍奇金淋巴瘤是发生于单一亲本细胞的单克隆恶性增殖，瘤细胞的基因重排高度一致。
而正常淋巴组织和良性淋巴组织增生性疾病呈多克隆性，因此可作为非霍奇金淋巴瘤的基因标志。
TCRγ或TCRβ基因重排常作为T 细胞淋巴瘤的基因标志，阳性率可达70%～80%。
为非霍奇金淋巴瘤的诊断、分型及评估预后提供参考依据。
由此可见TCR 基因重排是淋巴细胞恶性增生的特异性标志。
2、我们通过对T 细胞受体(Tcell receptor , TCR) 检测以及它们在监测MRD 中的临床意义的研究, 观察到这种TCR基因重排的检测持续阳性的患者, 更容易导致白血病的早期复发。
因而在ALL 病程中对TCR基因重排进行动态监测, 极大的提高MRD 检出的特异性和敏感性,对ALL患儿的预后、复发的判断及制定相应的个体化治疗方案有重要的指导意义,可以使患儿最大程度的长期无病生存,减少化疗所致的远期不良反应。
二、检测方法：1、S outhern杂交技术（印迹杂交）优点是稳定、可靠, 被称为基因重排的金标准,缺点是成本较高, 需要较多新鲜组织、操作复杂和费时, 且国内收费标准较低, 无法广泛应用于淋巴瘤的鉴别诊断。
基因重排技术在皮肤淋巴增生性疾病中的应用
【 ｅ ｏｄ 】 Ｌ ｍ ｈ ｍ ；Ｒ ｃｐｏ； ｅｅ ｅｒ ｎｅ ｅｔ Ｋ ｙｗ ｒｓ ｙ ｐ ｏ ａ ｅｅｔ Ｇ ｎ ；Ｒ ａｒ ｇｍ ｎ ｒ ａ
ｌ 基 因重 排原理
中的多 基 因 片段 。单 一 基 因 片 段 经 过 选 择 性 编 码 ， 并 由 Ｄ Ａ重排 组 成 功能 性 基 因 。在 Ｂ淋 巴 细 胞 分 Ｎ 化期间， 重链 基 因首选 组 合 ， 若在 一 染 色体 上 重 排 成 功 ， 另一染 色体 上基 因片 段 的重 排 即被 抑 制 ． 则 同时 激 发轻链 ｖ区基 因重排 ； 若重 链 基 因重排 失 败 ， 试 则 图在第 ２个 染 色 体 上 进行 成 功 的重 排 （ 等 位 基 因 即 排除 现象 ）２ Ｌ ］
型 特 征 和 受 体 基 因重排 方 式 。 受 体基 因重排 克 隆性 分析 技 术 为 解 决这 些 问题 提 供 了一 条 途 径 ， 为 辅 助诊 断 的 重要 手段 成
【 关键词 】 淋 巴瘤； 受体 ； 因； 基 重排
中 图 分 类 号 ： ３３ ２ １Ｒ ５ ４ Ｒ ６ ． ： ５７ ． 文献标识码 ： Ａ ｄ ｉ１． ９９ ｊｉ ｎ １０ — ３０ ２ １ ．４ ０ ８ ｏ ： ３ ６／．ｓ ．０ ２ １ １．０ ２ ０ ．０ ０ ｓ
１２ Ｔ Ｒ基 因重排 ． Ｃ Ｔ Ｒ 基 因重 排 是 指 Ｔ细 胞 的 Ｃ
基 因重 排 过 程 是 一 个 正 常 的 过 程 ， 常 淋 巴细 正 胞 在 发育 中是 多克 隆性 质 ， 淋 巴造 血 系 统 肿 瘤 所 但 具有 的是 单 克 隆性 重 排 ， 就 是 全 部 肿 瘤 细 胞 具 有 也 个 相 同的免 疫 球 蛋 白或 Ｔ细 胞 受体 基 因重 排 ． 这
κ基因重排在霍奇金淋巴瘤H-RS细胞性质中的研究
Ｐ Ｒ ｅｕｔ （ ）ＶｃＪ ａ ｄ “ Ｊ ４ ｅｅｒａｒｎｅ ｎｓｗ ｒ ｂｅｖｄ ｉ ｔｅｓｍ ａｅｏ Ｈｏｇｉ Ｃ ．Ｒ ｓｌ １ ＿ Ｉ ｎ Ｖ ／ ｄ ｓ ３ ｄ ／ ２ ｇｎ ｅｒ ｇｍｅｔ ｅｅｏ ｓｒｅ ｎ ｈ ａ ｅｃｓ ｆ ｄ ｋｎＳ ａ
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淋 巴细 胞 的相 关 性 进 行 研 究 。方 法 ： 用 直接 原 位 Ｐ Ｒ 法 ． 生 物 素 标 记 的 Ｖ，Ｊ 、 Ｊ 、 ． 、 采 Ｃ ５一 Ｖ Ｖｄ ／ ／ Ｖ
Ｊ 、 、 Ｊ 等 ６对 Ｋ家族特异 性 引物对 ３例 霍 奇金淋 巴瘤 组织 Ｈ Ｒ Ｓ细胞 的 Ｋ轻链基 因重排 ｖ／ Ｖ Ｋ ／— 情 况进行检 测 。结果 ： １ １例结 节硬 化 型霍 奇金 淋 巴瘤 （ Ｓ Ｌ 组 织 中， 分 Ｈ／ — （） ＮＨ ） 部 Ｒ Ｓ细胞重 复 出现 Ｖ ／ 。Ｊ 基 因重排 ， 亦有部 分 Ｈ／ ． Ｒ Ｓ细胞 重复 出现 Ｖ ／ Ｈ 基 因重排 ， 阳性信 号分别 重复 出现 于其 周 围部分 背景 Ｊ。 ： 且 淋 巴细胞核 内 ． 少数 Ｈ／ ． Ｒ Ｓ细胞 未检 测 出 Ｋ基 因重排 ； ２ ２例 混合 细胞 型霍 奇金淋 巴瘤 （ Ｈ ） 织 中， （） ＭＣ Ｌ 组 所有 Ｈ Ｒ Ｓ细胞均 未检 测 出 Ｋ轻链 基 因重排 。 ／— 结论 ：１ 本例 Ｎ ＨＬ的 Ｈ／ — （） Ｓ Ｒ Ｓ细胞可 能为 多克 隆性 增生 ， 且 Ｈ Ｒ Ｓ细 胞 与 其 周 围 部 分 背 景 淋 巴 细 胞 间 可 能 存 在 克 隆相 关 性 ， 即 可 能 来 自 同一 个 Ｂ 细 胞 克 隆 ； ２ ２例 ／— （）
克隆性分析的临床应用
克隆性分析的临床应用克隆性分析（clonality analysis）是一种用于检测疾病中克隆细胞的方法。
克隆细胞是指具有相同基因组的细胞群体，其来源可以是肿瘤细胞、免疫细胞等。
在临床上，克隆性分析广泛应用于疾病的诊断、治疗和监测等领域。
本文将详细介绍克隆性分析在不同疾病中的应用，并提供丰富的举例。
一、重要疾病的克隆性分析应用1. 肿瘤（tumor）: 克隆性分析在肿瘤的诊断和预后评估中发挥着重要作用。
例如，在恶性淋巴瘤（malignant lymphoma）中，通过分析肿瘤细胞克隆性，可以确定病情的严重程度、预测患者的生存期和制定个体化的治疗方案。
克隆性分析可通过核酸序列分析、蛋白质表达等方法进行，例如PCR（聚合酶链反应）和IHC（免疫组织化学）等。
2. 免疫系统疾病（immunologic disorders）: 免疫系统疾病包括自身免疫性疾病和免疫缺陷疾病。
克隆性分析在诊断和治疗这些疾病时发挥重要作用。
例如，在T细胞受体（TCR）基因变异的免疫疾病中，通过分析TCR的克隆性，可以确定病变累及的克隆细胞数量、监测疾病进展和评估治疗效果。
3. 移植排斥反应（transplant rejection）: 克隆性分析可用于监测移植器官排斥反应。
例如，在肾移植中，通过分析克隆性标记物，如HLA（人类白细胞抗原）等，可以检测移植器官中是否存在排斥反应，以便及时调整免疫抑制药物的剂量和方案。
二、克隆性分析方法1. 基于DNA的克隆性分析方法：这些方法利用DNA序列的差异来鉴定克隆细胞。
最常用的方法是PCR。
可以通过PCR 扩增某个基因的特定区域，然后通过比较PCR产物的序列或片段长度来分析克隆性。
DNA序列的差异可以来自于基因重排、染色体异常等。
2. 基于蛋白质的克隆性分析方法：这些方法通过分析蛋白质表达的差异来判断克隆细胞。
最常用的方法是免疫组织化学（IHC），通过染色或荧光标记特定抗体，来检测克隆细胞中蛋白质的表达情况。
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淋巴瘤中基因重排形式 ——克隆性重排
不同的淋巴细胞 相同的重排形式 淋巴细胞单克隆性增生
淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标
克隆性重排的检测方法
• Southern 杂交 • PCR法
Southern 杂交
特异性探针： 胚系的特征性片段外 另一不同大小的片段
• 优点： 敏感性较高 可靠性高
诊断与鉴别诊断 谱系确定 分期 克隆相关性判断
（1）形态和IHC不能得出肯定结论的淋巴组织增生性病变
胃肠道、肺、涎腺、甲状腺、眼眶等部位的MALT淋巴瘤 滤泡性淋巴瘤、皮肤淋巴瘤和T细胞淋巴瘤 形态不典型，缺乏特异性标记
CP2170, 66M, 胃黏膜活检 CP2171, 43F, 左腮腺肿块
明显的浆样分化细胞
-+-+- +
CP2170 ： FR1 (+), FR2(+), FR3(+) 诊断： （胃）小B细胞淋巴瘤，倾向MALT边缘区B细胞淋巴瘤 CP2171： FR1 (+), FR2(+), FR3(-) 诊断：（左腮腺）符合MALT边缘区B细胞淋巴瘤
（2） 形态和免疫组化均可考虑为淋巴瘤 但部位少见或发病年龄不典型 基因重排克隆性分析可增加诊断的依据
引物的选择原则
引物位置：PCR产物长度<300bp (最好在100－300bp） 离连接区的距离>10-15bp
引物本身的长度<25bp 精确地将所有VDJ基因片段捡出 家族性引物或通用引物 不同的组合具有互补性，提高阳性率 引物数目和同源性之间平衡
BMH4－CT983936的欧洲BIOMED－2 协作研究
对照的设立
FR2 FR3A TCRG1 TCRG2 TCRB1 TCRB2
- + - + -+ - + - +- +
• 阳性对照 • 阴性对照
•内对照: 3个病例的内对照b-actin均为阳性
对照的设立
－＋－＋－＋－＋－＋－＋
2007-01-04 control and 1
克隆性基因重排的应用
多克隆性： 无特异性条带，弥散带或梯状带
2. 毛细管电泳基因扫描（genescan）
单克隆性细胞产生一个或两个尖的峰，多克隆为多个小峰，呈Gaussian分布。 （本课题组曾用两种方法分析180管皮肤淋巴瘤的TCR基因重排，两者的符合 率为96.7%, 在TCRB用genescan方法稍敏感，在TCRD用PAGE更特异。）
克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的应用
NCCN NHL Lymphoma Guidelines
Evaluation of the Suspicious Lymph Node
Clinically Suspicious LN
Carcinoma v. Lymphoma
Suspect Lymphoma
FNA With Flow Cytometry
该协作研究由47个研究所组成7个网络和一个病理panel。它由 分子生物学、免疫学、血液学、病理学等领域的专家。
1998.6-2002.7， 12次国际性会议。
主要目的： （1）开发和标准化PCR实验操作和PCR引物 （2） 评价和应用该标准化方法
设计了一套完整的引物和方法用于IG和TCR基因重排的 克隆性分析，共有14管97对引物
Carcinoma
Workup for Primary
CLL Suspect Lymphoma, Negative or
Non-diagnostic
FISH
Biopsy
Morphology with IHC
If necessary, Molecular Dx Cytogenetics/
FISH （5-10%）
IG和TCR基因结构及重排过程
胚 胚系系
D-J重排
V-D-J重排
转录与拼接
可变区
恒定区
各区片段数多 重排的多样性 抗体多样性
IGH IGK IGL TCRA TCRB TCRG TCRD
V
66 433846来自4768
D
27 76
56
54
67
9
8
J
6
5
5
61
13
5
4
淋巴细胞发育过程中基因重排顺序
• IG: H重排κ: IgH/κ κ缺失 λ： IgH/λ
• 缺点： DNA量多（10ug) 新鲜组织 操作复杂 时间长、成本高 放射性同位素
逐渐被PCR方法替代．
PCR法
原理: VDJ重排 后相互靠拢，用适当的引物可扩增 出重排片段
新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本， 不受DNA片段的影响，仅需要少量的DNA， 时间短，敏感性高，
是目前最常用的克隆性重排的检测方法。
IGH（A,B,C,D,E 5管） IGK（A，B 2管） IGL（1管） TCRB（A，B，C 3管） TCRG（A，B 2管） TCRD(1 管)
Van Dongen JJM et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the Biomed-2 concerted action BMH4-C98-3936 Leukemia 2003;17:2257-2317
所有引物采用相同的扩增条件和检测方法，并具有 很高的敏感性和特异性，
已被推荐为可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析的 标准方法，试剂已商品化
PCR产物分析方法
• 聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)-异源双链分析
+-
克隆性重排判断基本原则：
• 条带在期望的碱基大小范围内；一条或两条 • 带宽不超过1mm, • 边缘整齐；
Diagnosis
Treatment
Staging and Treatment
分子和细胞遗传学异常
• 抗原受体基因的克隆性重排 • 与类型相关的染色体异常
简要原理 检测方法 应用和策略 注意事项
淋巴细胞表面受体
IG： IGH （14q32) IGL (2q12) (22q11)
TCR: TCRα 14q11 TCRβ 7q32 TCRγ 7p15 TCRδ 14q11.2