木瓜蛋白酶的固定化

•共价结合吸附固定木瓜蛋白酶
食品酶学 研究生课件
在使用金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶时， 固定化反应条件温和，对酶的高级结构 影响小，酶活回收高；固定化酶的热稳定性明显 提高；载体的载酶量大；载体的再生、酶的固定 化过程操作简单；固定化酶及载体可多次重复利 用
1.载体的制备 2.酶的固定化 3.酶活的测定 4.载 体吸附Gu2+ 的量对固定化酶的影响 5.固定化时间 的影响 6.pH 对固定化酶的影响 7.给酶量对固定 化酶的影响 8.固定化酶的性质
固定化酶
通过物理或化学 法将酶束缚在一 定的空间，使酶 只能在此区间进 行催化反应，反 应结束后，能迅 速与底物和产物 分开，实现重复 使用。
•固定化酶的特点
易与反应液分开
食品酶学 研究生课件
可反复使用，降低成本
优点
酶的稳定性提高
较易控制终止酶反应的进程
产物纯化简便
•固定化酶的特点
酶活力有损失
胞内酶必须经过酶的分离 手续
•交联法
原理：依靠双功能基团试剂，使酶蛋白分子间发生交联，凝集成网 状结构，从而成为不溶性酶。
特点：反应条件剧烈、酶活力低、颗粒较细，一般不能单独使用， 常常和包埋法、吸附法等联合使用。
常用双功能基团为：戊二醛
-CHO-(CH2)3-CHO
•举例：木瓜蛋白酶的固定
固定方法
食品酶学 研究生课件
一、微孔淀粉 ——海藻酸钠 固定化木瓜蛋 白酶
结果总结 实验结果分析 实验步骤
利用金属螯合配体与蛋白质相 结合的原理，选用磁性琼脂糖亚氨基二乙酸（IDA）-Gu2+ 做 为金属螯合载体，定向固定木 瓜蛋白酶。
实验原理
取螯采合用载反体相，悬加浮入包木埋瓜法蛋制白备酶，室利温用下原子吸收分 振荡光4光h，度用法P测BS定洗上涤清数G次u2至+ 浓上度清，中计检算测载不体到吸 酶活附，Gu即2+得的固量定。化的木瓜蛋白酶
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——木瓜蛋白酶的固定
万丽花 201源自文库.11.4
主要内容
食品酶学 研究生课件
1
固定化酶的介绍
2
固定化酶的特点
3
酶固定化的方法
4 举例：木瓜蛋白酶的固定及性质研究
•固定化酶的介绍
食品酶学 研究生课件
原因1
酶对热、酸、碱 等有机溶剂均不 稳定，即使在酶 反应的最适环境 中，也易失活。
原因2
酶一般以溶于水的 状态作用于底物， 因此，当反应结束 时，一般难以回收 ，也难以从产物中 除尽，又由于酶仅 能使用一次，因此 ，使得产物纯度不 够，且造成很大的 浪费。
（包埋法固定）
二、金属螯合 载体定向固定 化木瓜蛋白酶
（载体吸附—— 共价结合）
食品酶学 研究生课件
包埋法固定木瓜蛋白酶
一种新型的变性淀粉，具有较大的比孔容和 比表面积，可以吸附很多种功能性物质
采用微孔淀粉——海藻酸钠包埋法固定
凝胶剂
木瓜蛋白酶，探讨固定化条件、固定化
木瓜蛋白酶及游离酶的酶学性质。
常见载体为： DEAE纤维素（二乙氨基已基纤维素）、 TEAE纤维素（三 乙基氨基乙基纤维素）、DEAE葡聚糖凝胶
特点：操作简便，酶分子结构及活性中心不变
•载体吸附---物理吸附法
活性碳
E
吸附
惰性载体 硅胶
（不溶于水） 石英
E E
硅藻土 E
特点：操作简单，吸附力弱；pH 、T、 底物浓度变 化时，会导致酶从载体上部分或全部脱落。
实验结果：
2、不同浓度的海藻酸钠对酶活力的影响：
随着海藻酸钠浓度的增加，包埋木瓜蛋白酶的量会逐渐增加，但继续 加大海藻酸钠浓度就会使表面密度不断加大，底物运动扩散更加困难， 降低酶活。木瓜蛋白酶固定化的最适海藻酸钠浓度为3％。
实验结果：
3、不同浓度的GaG12溶液对固定化木瓜蛋白酶活力的影响
当CaC12 浓度为5．5％时酶活最高。一般情况下凝胶强度与钙离子浓 度成正比，但由于有微孔淀粉的存在使钙离子对木瓜蛋白酶的抑制作 用发生变化，但总体上酶活是先升高后降低的。
原理：酶蛋白上非活性必需基团（氨基酸残基）与载体通过共价键形成 不可逆的联结。 载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺衍生物 优点：结合牢固，酶不易脱落，稳定性好。 缺点：载体需活化，操作复杂，反应条件剧烈
E E
E 载体 E
E E
•载体吸附---离子结合法
原理：酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固体载体由于离子效应， 将酶固定在离子交换基团的非水溶性载体上。
实验结果分析
1、载体吸附Gu2+ 的量对固定化酶的影响:
当Gu2+载体﹤1.5×10-2mol/g 时，酶 活随给Gu2+量的增加而增加，这是因为 琼脂糖IDA只有在结合了Gu2+后才能以 配位作用固定酶，随给Gu2+量的增加载 体表面固定木瓜蛋白酶的位点增多，导 致载酶量增加而引起酶活上升；当Gu2+ 载体﹥ 1.5×10-2mol/g时，载体表面 的IDA 逐渐被Gu2+饱和至过饱和，载体 的载酶量达到最大值，但被琼脂糖IDA 载体过量吸附的Gu2+在随后的酶反应过 程中溢出至溶液中抑制了木瓜蛋白酶的 活性，使得酶活随Gu2+量的增加而减少。
验
究
最佳制备条件为微孔淀粉浓度4％，海藻酸钠浓度3％，
CaC12浓度5.5％。固定化木瓜蛋白酶的最适pH值为5.7，
最适温度72℃。
实验结果：
1、不同浓度的微孔淀粉对酶活力的影响：
木瓜蛋白酶固定化的最适微孔淀粉浓度为4％。随着微孔淀粉浓度的 增加，吸附木瓜蛋白酶的量会逐渐增加，但继续加大微孔淀粉浓 度．就会使底物运动扩散更加困难，降低酶活。
缺点
食品酶学 研究生课件
增加了生产的成本， 工厂初始投资大
与完整菌体相比不适于多酶反应
只能用于可溶性底物
•酶固定化的方法
格子型
•包埋法
微胶囊型
•交联法
共价结合法
•载体结合法
离子结合法
物理吸附法
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一定方式
分离的酶
载体
固定
•包埋法---格子型
原理：将酶包埋在聚合物的凝胶格子中 常用凝胶为：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、 角叉菜胶
食品酶学 研究生课件
E
E
E
E
•包埋法---微胶囊型
原理：以半透性的有机高聚物薄膜包围含有酶分子的液滴，在有机溶剂 中，含酶水溶液的液滴界面处，发生界面凝集作用，形成半透性膜，使 酶被包裹于其中，阻止了酶的漏失。
微囊直径一般为m-几百m的小珠 特点：小分子底物能通过膜与酶接触，产物也可释放出来。
•载体吸附---共价结合法
•游离木瓜蛋白酶 活力的测定
条件优化： •不同浓度的微孔淀
•固定化木瓜蛋白 酶的制备
实验设计
粉对酶活力的影响
•不同浓度的海藻酸 钠对酶活力的影响
•固定化酶活力测
•不同浓度的GaG1溶
定
实验步骤
液对固定化木瓜蛋
白酶活力的影响
•固定化酶制备条 件的优化
实验结果
•固定化木瓜蛋白酶 制备条件的正交试
•固定化酶性质研