脂质体转染
脂质体转染
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。
电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。
但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
一、实验材料1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基+ 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）3、溶液2：X ul 无血清培养基+ 4 ug 质粒per well（总体积250 ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
脂质体转染实验步骤脂质体（LR）试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。
它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。
转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。
先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。
因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
1、操作步骤（方法一）：（1）：取6孔培养板，向每孔中加入2ml含（1-2） x 10^5个细胞的培养基，37℃、18% CO2培养基40%-60%汇合时。
（2）转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液（为转染1个空细胞所用的量）。
A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100ul。
B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100ul。
轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
（3）转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养基。
（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。
（5）其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。
（6）注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤（方法二）：●∙∙∙∙∙∙∙ 将细胞以5 x 10^5个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。
●∙∙∙∙∙∙∙ 在试管中配制DNA-脂质体复合物。
脂质体转染实验原理与操作步骤总(精)
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次摘要:细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
找产品,上生物帮 >> >>细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。
它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。
转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。
用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。
因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。
细胞种类:COS-7、 BHK 、 NIH3T3、 Hela 和 Jurkat 等任何一种细胞均可作为受体细胞。
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染原理及操作步骤脂质体转染是一种常用的基因传递技术，用于将外源的核酸（例如DNA、RNA）转入细胞内。
脂质体是由人工合成的类似于细胞膜的双层脂质膜组成，具有较好的生物相容性和可降解性，因此可以用来包裹并传递外源核酸进入目标细胞内。
本文将详细介绍脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体由两个疏水性脂质尾部和一个亲水性脂质头部组成，形成类似生物细胞膜的双层结构。
这种双层结构使得脂质体可以包裹水溶性的外源核酸，并形成脂质体-核酸复合物。
当复合物与细胞膜接触时，由于脂质体的类似性，这些复合物可以与细胞膜融合，并释放外源核酸进入细胞。
然而，简单地将脂质体-核酸复合物添加到细胞培养基中并不能有效地将外源核酸转入细胞内。
为了提高转染效率，常常需要使用电穿孔或钙磷共沉淀等方法，以增加细胞膜的通透性。
操作步骤：1.准备工作：-完整的脂质体转染试剂盒。
-DNA或RNA溶液。
-靶细胞。
-无菌操作条件下的实验室。
2.重组脂质体的合成：-按照试剂盒说明将脂质体复合物合成。
-使用无菌的工具和试剂。
3.核酸引物的制备：-将外源DNA或RNA与引物混合，使其形成核酸复合物。
4.细胞处理：-将培养皿中的细胞进行冲洗，去除培养基。
-将适量的细胞培养基添加到培养皿中，以保证细胞的正常生长。
5.导入核酸：-将所制备的核酸复合物滴加到细胞培养基中。
-将细胞培养皿置于无菌环境中，以便细胞吸收和利用核酸。
6.细胞培养：-按照细胞类型和所使用的培养基，将细胞置于恰当的培养条件下，并进行培养。
-根据需求添加所需要的生长因子和抗生素。
7.观察和分析：-在一定的培养时间后，观察细胞是否发生了显著的变化。
- 使用适当的实验方法（如PCR、Western blot等）检测外源基因的表达。
-观察并记录实验结果。
以上是脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体转染是目前常用的基因传递技术之一，可以用于研究基因功能、疾病治疗等领域。
随着技术的不断发展，转染效率和特异性将逐渐提高，为研究和治疗带来更多的机会和挑战。
Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂说明书
Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂说明书产品描述Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。
其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。
转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。
Hieff Trans TM以无菌的液体形式提供。
通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做160 次转染；运输与保存方法冰袋（wet ice）运输。
产品4ºC保存，一年有效。
不可冷冻！注意事项1）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。
2）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。
但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。
另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。
3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。
4）使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。
5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。
6）初次使用应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。
脂质体转染survivin siRNA对A549细胞增殖及凋亡的影响
【 关键词 】ｕｖ ｉ，ｉＮ 细胞凋亡 ； 癌 ； Ｎ ｉ Ｓ ｒｉ ｎ ｓ Ａ； ｖ Ｒ 肺 Ｒ Ａ
【 中国图书分类法分 类号 】７４ Ｒ稿 日 】 ０ —６０ 期 ２ ７０ —３ ０
Ｅ ｅ ｔ ｏ ｉｏ ｏ ｆ ｃ ｆ ｌ ｓ ｍａ ｒ ｎ ｆ ｃ ｉｎ ｆ ｓ ｒ ｉｉ ｉ ｐ ｌｔａ ｓ ｅ ｔ ｏ ｕ ｖｖｎ ｓ ｏ ＲＮＡ ｎ ｐ ｏ ｉ ｒ ｔ ｎ ａ ｄ ｏ ｒ ｌｅ ａ ｉ ｎ ｆ ｏ
【ｂｔｃ】Ｏｊｃ ｖ ： ｘｌｅｔ ｆｃ ｏ ｌｏ ｍ ａｓｃｏ ｆ ｕ ｉｎｓ Ｎ ｎｔ ｒｉｒｉ ｎ ｐｐ ｓ ｆｕｇ Ａ ｓａｔ ｂｅ ｉｅＴ ｅｐ ｒ ｈ ｅｅｔ ｆｉ ｓ ａ ｔｎｆ ｔｎｏ ｓｒｖ ｉ Ａ ｏ ｈ ｐ ｌ ａｏ ａｄａｏｔ ｉ ｏ ｌ ｒ ｔ ｏ ｏ ｅ ｐ ｏ ｌ ｒ ｅ ｉ ｖ ｉ Ｒ ｅ ｏｆ ｔｎ ｅ ｏｓ ｎ
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（ ｅａｔ ｎ ｏ ｅｐｒ ｏ ｉ ａｅ， ｅＦｒｔＡｆｌ ｅ ｓｉｌＣ ｏｇｉｇＭｅｉａ Ｕ ｉｅ ｉ ） Ｄ ｐ ｒ ｔｆ Ｒ ｓｉｔｒ Ｄｓ ｓｓｔ ｉ ｆ ｉ ｄＨｏｐｔ ，ｈｎｑｎ ｄｃ ｎｖｒ ｔ ｍｅ ａ ｙ ｅ ｈ ｓ ｉ ａ ｔ ａ ｌ ｓｙ
论 著 文章编号： ５—６６２０） —１ — ０ ３３２（０８０ ０ ００ ２ ２ ４ ４
脂 质体转 染 ｓｒｉ ｎ ｓ Ｎ ｕｖ ｉ ｉ Ａ对 Ａ ４ ｖ Ｒ ５ ９细胞增殖及凋 亡的影 响
刘永全 ， 江 涛 ， 燕梅 冯
４０ １ ） ００ ６
（ 庆 医 科 大 学 附 属 第一 医 院 呼 吸 内科 ， 庆 重 重
贴壁细胞的脂质体转染
一、实验材料1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。
三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
转染率很高。
以下是个人经验，与大家分享。
1.细胞的状态。
这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。
有文献说传代不要超过17代。
我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。
2.细胞的融合度。
转染试剂的作用原理
转染试剂的作用原理一、转染试剂的基本概念转染试剂是一种用于将外源基因或其他生物分子转移到目标细胞中的化学物质。
转染试剂可以通过物理或化学方法改变细胞的通透性，使外源物质能够进入细胞内，并达到转染的目的。
转染试剂在基因治疗、基因表达研究和细胞工程等领域广泛应用。
二、转染试剂的分类转染试剂按照机理和性质的不同可分为多种类型，常见的转染试剂包括：1.脂质体（Liposome）：脂质体是由磷脂双分子层构成的微小囊泡，可与细胞膜融合，将目标物质转移到细胞中。
2.内源蛋白介导的转染：通过利用特定的蛋白质，如病毒衣壳蛋白或细胞内运输蛋白，将目标物质转移到目标细胞中。
3.阳离子聚合物：阳离子聚合物具有正电荷，能够与负电荷的DNA或RNA结合形成复合物，进而转染入细胞。
4.高分子基质：高分子材料如凝胶、纤维或微球等可用于载体，将目标物质与细胞接触，实现转染。
5.电穿孔：利用电场或离子流导致细胞膜破裂，使目标物质通过细胞膜进入细胞质。
三、脂质体转染试剂的作用原理脂质体是一种常用的转染试剂，其作用原理主要包括以下几个步骤：1.与DNA结合：脂质体通过与目标DNA相互作用，形成脂质体-DNA复合物。
脂质体由于其亲油性能与DNA中的疏水部分相互作用，同时脂质体表面带有正电荷，可以与DNA的负电荷相吸引。
2.细胞摄取：脂质体-DNA复合物与细胞膜结合后，脂质体会在细胞膜上形成微囊泡。
随后，微囊泡与细胞膜融合，释放出脂质体-DNA复合物进入细胞质。
3.脱脂质体：脂质体在细胞质中逐渐失去其亲油性，释放出DNA。
由于脂质体-DNA复合物在细胞膜上的微囊泡中形成的电位差，使得DNA被吸引到细胞核附近。
4.核入：DNA由细胞质进入细胞核，最终与染色体结合或进入细胞核内的胞浆，实现转基因。
四、脂质体转染试剂的优缺点脂质体转染试剂具有一些优点和缺点，需要根据实际应用情况选择使用：优点：1.安全性：脂质体转染试剂大多采用合成非病毒载体，通常比病毒载体更安全，不会引起病毒感染及遗传毒性。
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染是一种常用的基因传递方法，通过将目标基因以及负载该基因的脂质体添加到细胞培养物中，使其与细胞膜融合，并将基因导入到细胞内。
脂质体转染的操作步骤如下：
1. 提取脂质体：首先，从脱脂牛奶或其它来源中提取脂质体。
可以通过超声处理、离心等方法将脂质体分离出来。
2. 混合目标基因与脂质体：将目标基因与脂质体混合，目标基因可以是质粒DNA、RNA等。
将基因加入脂质体溶液中，进
行充分混合。
3. 孵育：将脂质体-基因混合物在室温下孵育一段时间，通常
为15-30分钟。
这一步主要是让脂质体与基因充分结合。
4. 加入细胞：将孵育好的脂质体-基因混合物加入需要转染的
细胞培养物中。
细胞种类可以是哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、细菌等。
5. 孵育细胞：将细胞培养物保持在适宜的培养条件下，孵育一定时间，让细胞充分吸收脂质体-基因复合物。
6. 收获转染细胞：经过一定时间的孵育后，可从培养物中收获转染细胞。
可以根据实验需要进行后续分析。
需要注意的是，脂质体转染的效率与脂质体组分、浓度、孵育时间、细胞类型等因素密切相关，需要进行参数优化才能达到较高的转染效果。
细胞的脂质体转染法和电穿孔法
细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法（一）脂质体转染一、实验试剂及器材Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM®减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。
二、实验步骤1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染；2. 使用Opti-MEM®减血清培养基稀释Lipofectamine® 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM®培养基为125 μL× 2，Lipofectamine® 3000为3.75和7.5 μL）；3. 在每管已稀释的Lipofectamine® 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）；4. 室温孵育5分钟；5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中；6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。
三、注意事项1. 在无血清培养基（如Opti-MEM®减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine® 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）；2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；3. Lipofectamine® 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine® 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染；4. Lipofectamine® 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。
附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：（二）电穿孔转染法一、实验试剂及器材BTX ECM2001®2001细胞电融合仪，细胞，胰蛋白酶，电转液，DMEM，培养板，离心机等。
Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂(亲手整理
Hieff TransTM 脂质体核酸转染试剂产品描述Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA 、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。
其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。
转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM 复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。
Hieff Trans TM 以无菌的液体形式提供。
通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做160 次转染； 运输与保存方法冰袋（wet ice ）运输。
产品4ºC 保存，一年有效。
不可冷冻！ 注意事项1）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。
2）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。
但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA 和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。
另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。
3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。
4）使用高纯度的DNA 或RNA 有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。
5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。
6）初次使用应优化DNA 浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。
脂质体的转染原理
脂质体的转染原理
脂质体是一种由脂质和溶剂组成的胶束结构，可以用于体外和体内的基因转染。
转染是指将外源基因导入目标细胞内的过程。
脂质体的转染原理基于脂质体与细胞膜之间的相互作用和脂质体内基因的释放。
转染过程中，首先将目标基因（如DNA或RNA）与脂质体包裹在一起，形成脂质体-基因复合物。
这些复合物通过静电相互作用、疏水相互作用和膜融合等方式与细胞膜结合。
一旦脂质体-基因复合物结合到细胞膜上，脂质体与细胞膜之间的相互作用促使脂质体通过了细胞膜。
一种可能的机制是脂质体与细胞膜之间形成一个小的膜破裂，从而使基因从脂质体中释放出来。
经过释放，目标基因便能进入到细胞质中，通过细胞内的各种机制被转录成RNA 或翻译成蛋白质。
总的来说，脂质体转染的原理是通过脂质体与细胞膜的相互作用、基因释放和细胞内过程，将外源基因导入到目标细胞中。
脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
一、脂质体转染实验步骤
1）细胞处理：细胞培养，细胞脱落，细胞悬液浓缩；
2）添加脂质体：将DNA与相应脂质体混合，可以将DNA结合到脂质体上；
3）细胞接种：将脂质体/DNA混合物接种到细胞悬液中，使DNA能够被细胞吞噬；
4）转染放置：将接种混合物保持在室温静置一定的时间，从而使DNA能够被细胞吞噬；
5）细胞活化：在静置期间，DNA会被细胞内吞噬，当添加激活剂和营养培养基时，细胞会活化；
6）细胞培养：在细胞活化后，细胞会被培养，并进行观察，以评估DNA转染的效果；
7）细胞收集：在培养过程中，可以通过浓缩细胞悬液，将转染后的细胞收集起来，以便进行其他分析。
细胞转染是将外源DNA片段转染到细胞中，从而改变其基因表达的技术。
目前常用的细胞转染技术有电转染、磁珠转染、质粒转染、脂质体转染等。
1）电转染
电染是一种最常用的染技术，即通过将DNA片段置于细胞悬液中，然后用微电流刺激，使DNA片段直接进入细胞。
脂质体转染_实验报告
一、实验目的本实验旨在通过脂质体转染技术将目的基因导入细胞内，研究脂质体转染方法对基因表达的影响，为后续基因功能研究提供技术支持。
二、实验材料1. 细胞：人胚肾细胞HEK2932. 载体：pGL3-Basic（含有报告基因）3. 脂质体：Lipofectamine 30004. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液5. 实验仪器：超净工作台、CO2培养箱、酶标仪、显微镜、PCR仪等三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，待细胞汇合至80%时进行实验。
2. 脂质体-DNA复合物制备：将pGL3-Basic质粒DNA和Lipofectamine 3000试剂按照说明书比例混合，室温孵育20分钟。
3. 细胞转染：将脂质体-DNA复合物加入细胞培养孔中，轻轻混匀，37℃、5%CO2培养箱中孵育6小时。
4. 洗涤：弃去转染液，用PBS缓冲液洗涤细胞两次。
5. 优化培养条件：将细胞分为实验组和对照组，实验组加入脂质体-DNA复合物，对照组加入等量无DNA的脂质体。
6. 重组蛋白表达检测：收集细胞，提取总蛋白，进行Western blot检测目的蛋白表达水平。
7. 报告基因表达检测：收集细胞，提取总RNA，进行实时荧光定量PCR检测报告基因表达水平。
四、实验结果1. Western blot结果：实验组细胞中目的蛋白表达水平明显高于对照组（P<0.05），表明脂质体转染成功。
2. 实时荧光定量PCR结果：实验组细胞中报告基因表达水平明显高于对照组（P<0.05），表明脂质体转染对基因表达有显著促进作用。
五、实验讨论1. 脂质体转染技术在基因研究中的应用：脂质体转染技术具有操作简便、转染效率高、安全性好等优点，是基因研究中最常用的转染方法之一。
2. 本实验中，脂质体转染成功地将目的基因导入细胞内，并显著提高了报告基因的表达水平。
这表明脂质体转染技术在本实验中具有良好的效果。
师姐整理之细胞转染技巧
师姐整理之细胞转染技巧1、细胞转染有脂质体转染，病毒转染、电转染、磷酸钙法、显微注射….下⾯主要讲最常⽤的脂质体lip2000介导的细胞转染。
2、转染效率影响因素：1、细胞种类，细胞状态，2、质粒⼤⼩，3、转染试剂。
3、转染前细胞的状态和密度都⾮常影响转染效率和后期的实验结果。
转染时细胞的密度为50%-80%较好，同时注意在转染后收细胞时的密度不要过爆。
⽐如转染质粒到细胞内，48⼩时后做WB，那么此时细胞的密度最好不要长满. 因为细胞长的过爆严重影响细胞的状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）从⽽影响实验结果。
⼀般为前⼀天下午铺板，第⼆天上午进⾏转染，48⼩时候收细胞进⾏功能检测。
4、不同的质粒和脂质体最佳搭配⽐例不同，转染前，应该摸⼀个最佳配⽐。
质粒：脂质体=1：1，1：1.5， 1：2， 1：2.5， 1：3， 1：3.5的梯度⽐例来检测最佳转染⽐例（⼀般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率，没有荧光的只能通过qPCR来检测各组转染效率）。
5、质粒的纯度影响转染效率：1、脂质体转染基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离⼦，蛋⽩，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进⾏。
2、含有内毒素的质粒对细胞有很⼤的毒性作⽤。
建议使⽤QIAGEN公司的超纯质粒抽提试剂盒。
6、转染时，⼩⼼轻柔的将lip2000加到培养基中并轻轻混匀（说明书上的⽤词为：Mix gently），避免粗暴⽤⼒吹打，会导致脂质体失效。
opti-MEM培养基提⾼转染效率。
转染后6⼩时更换培养基，⼀是lip2000具有⼀定毒性，⼆是培养基需要更换成有⾎清培养基。
9、⽀原体污染会严重影响细胞转染的效率，且⽀原体污染不会像细菌污染那么明显可见，转染前可以⽤环丙沙星杀⼀杀⽀原体。
10、转染后效率的检测：1、观察转染后细胞荧光情况。
2、qPCR验证。
3、WB检测敲减或者过表达蛋⽩。
11、转染后发现转染效率不⾼，可以通过两种⽅法：1、复转染，即转染后12-24⼩时再次进⾏转染，前提是该细胞对脂质体的耐受性较好，转染后细胞死亡数较少。
脂质体转染法的原理及特点
脂质体转染法的原理及特点脂质体转染法是一种常用的转基因技术，通过利用脂质体作为载体将外源基因导入到细胞中，从而实现基因转染。
其主要原理包括以下几点：1. 脂质体结构：脂质体是一种由磷脂和胆固醇等成分组成的球形结构，其外层为亲水性头基团，内层为疏水性脂肪酸基团。
这种结构使得脂质体能够结合并包裹DNA，形成脂质体-质粒复合物。
2. 细胞摄取：脂质体-质粒复合物可以与细胞表面脂质脂质双层膜进行相互作用，导致脂质体被细胞摄取。
一旦摄取到细胞内，脂质体会与细胞内的膜融合并释放质粒DNA。
3. 质粒DNA释放：脂质体在细胞内融合后，会导致质粒DNA从脂质体中释放出来。
质粒DNA由于具有负电荷，会与细胞内的阳离子结合并进入细胞质中。
4. 核入侵：释放的质粒DNA需要穿越细胞核膜才能进入细胞核。
质粒DNA可以通过凝胶蛋白小孔或核膜内的核膜孔进行通过，进入细胞核。
5. 基因表达：一旦质粒DNA进入细胞核，可以与细胞的内源性转录因子结合并转录成mRNA。
mRNA会进一步被转化为蛋白质，从而实现外源基因的表达。
脂质体转染法的特点包括：1. 简单易行：脂质体转染法操作简单，不需要特殊的设备，适用于一般的实验室条件。
2. 高效率：相对于其他转染方法，脂质体转染法在一定程度上具有较高的转染效率，可以使较大数量的细胞获得外源基因。
3. 适用广泛：脂质体转染法可以应用于多种细胞类型，包括哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等。
4. 低毒性：相对于病毒载体转染法，脂质体转染法的毒性较低，不会对细胞产生明显的损伤。
5. 稳定性较差：脂质体转染法所转染的外源基因在细胞中会存在过期的情况，需要进行适当的处理来维持外源基因的稳定表达。
脂质体转染操作步骤
脂质体转染操作步骤
（一）准备材料
1.质粒：一般是由受体细胞胞浆抽提的质粒，其中含有DNA操纵因子、胞质蛋白等；
2.抗体：主要由混合物或单一蛋白质组成，用于鉴定质粒抗原性以及
抑制免疫反应；
3.细胞培养液：一般为包含细胞培养基和生长因子的混合物；
4.转染试剂：也称转染缓冲液，主要由多种物质，如阿拉伯胞浆清酯、卡夫培糖、酚红、多数体核酸等组成，用于载体细胞的传感和质粒的迁移。
（二）脂质体转染操作
1.取出细胞培养液，将受体细胞倒入培养管中，用浓度为0.25%（体
积比）的牛血清添加至8-10%，以细胞膜生长抗性抑制剂（如抗生素或吲
哚美辛）等抑制细胞膜的分裂，加以培养；
2.将培养液中的受体细胞的数量控制在2×105/ml以上，用酚酞红法
检测，检测结果达到要求后，把受体细胞从培养管中放入6 ml的离心管中，进行6000 g的离心；
3.将离心液放入新的容器中，把细胞抽出，再加入细胞稀释缓冲液
（以PBS或缓冲液为主，加入百维素或多数体核酸）至1×106/ml，离心5000 g；
4.将离心液抽出，用转染试剂缓冲液把细胞洗涤，再分别加入DNase I, 抗体和质粒，放入摇床中。
8、细胞转染(脂质体介导法)
细胞转染（脂质体介导法）细胞转染可以：（1）真核细胞可以掺入外源DNA而获得新的遗传标志；（2）应用于转基因动植物；（3）应用于生物制药、基因治疗、RNA干扰。
实验材料：293T细胞、MyoD表达质粒、EGFP表达质粒试剂、试剂盒：DMEM培养基、青霉素、FCS、PBS、EDTA、转染试剂、链霉素、小牛血清仪器、耗材：微量移液器、Tip头、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、培养皿、转染管、离心管、观察用倒置显微镜、荧光显微镜、CCD其他：研究进展1. 转染技术国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效转染试剂率高受到研究者们的青睐。
其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。
聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。
这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。
大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。
目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。
2. 转染效率线型PEI（LinePEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。
但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。
超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。
汉恒生物-LipoFiter转染试剂中文说明书
LipoFiter TM 转染试剂操作说明保存条件：4℃保存，一年有效（避免反复冻融）。
LipoFiter TM 简介LipoFiter TM 脂质体转染试剂( LipoFiter TM Liposomal Transfection Reagent )是一种适合于把质粒或其它形式的核酸,以及核酸蛋白复合物转染到培养的真核细胞中的高效阳离子脂质体转染试剂。
LipoFiter TM 优点1、转染效率高，重复性好，操作简单。
2、无明显细胞毒性，用LipoFiter TM 转染细胞后，对于大多数细胞72 小时内不更换培养液无明显细胞毒性。
3、LipoFiter TM 对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用，并且可以用于稳定表达细胞株的筛选。
LipoFiter TM 使用说明1.细胞培养：以293T 细胞为例，转染前一天(20-24 小时) ~0.4×106 细胞(具体的细胞数量据细胞大小和细胞生长速度而定)铺到六孔板内，使第二天细胞汇合度（confluent）能达到约50%~70%。
注1：汉恒生物LipoFiter TM 对细胞毒性极小，因此无需通过增大细胞汇合度来抵抗转染试剂毒性，我们实验证明，50%~70% confluent 时细胞的转染效率可以达到最优。
注2：其它培养板或培养皿参考六孔板进行操作，其他培养介质如培养板，培养皿的详细细胞接1种数目请按照比例自行换算。
2.在进行下述转染步骤前，把六孔板每孔内换成新鲜细胞培养液。
培养液的体积约为2 ml。
注：其他培养介质培养液体积参见《各种培养介质下LipoFiter TM 转染DNA 详表》，抗生素、Glutamine 等对LipoFiter TM 转染并无影响。
如果LipoFiter 对目的细胞毒性较大，建议去除转染体系内的抗生素。
3.把LipoFiter TM 脂质体转染试剂轻轻混匀。
4.对于待转染的六孔板中一个孔的细胞，取一只洁净无菌离心管，加入4 μg 质粒DNA（其他培养介质DNA 用量参见附表）到250 μl DMEM 溶液，用枪轻轻吹打混匀。
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二、脂质体转染操作步骤1、操作步骤[方法一]：
(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。
(3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。
(4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。
注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：
(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板底面积。
(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo 质粒DNA或供体DNA。
②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。
③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。
(3)(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。
(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时，
(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24~48小时。
(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。
(7)3、稳定的脂质体转染方法如下：(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。
(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。
(3)在每孔中加入1mL、20%FCS 的DMEM，37℃培养48小时。
(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法
细菌粘附侵入实验
1、将细胞按1.0×10⁵ cells/ml的量接种于24孔板中，每孔1ml，置于37°的培养箱中培养3天直至细胞均勾铺满孔底，长满单层的细胞显微镜下可见细胞之间接触紧密，形成该细胞所特有的紧密连接。
2、实验前一天取E.coli菌株接种于含有相应抗生素的BHI培养基中，于37°培养箱中静置培养过夜。
3、取长满单层的HBMEC细胞，用预热的WXM培养基轻柔地将细胞洗3遍，以去除培养基中的双抗。
4、然后每孔中加入400μL培养基，于37°温箱中
5、静置期间取过夜培养的细菌，3000r/min离心5min收集菌体。
弃去培养基，将菌体沉淀重悬于1mlXM培养基中。
并用培养基调整菌液的OD₆₂₀至0.2约为1.0×10⁸ CFU/ml。
6、分别向24孔板中每孔细胞加入100μL细菌悬液（10⁷CFU,MOI约为100，使总体积达到500μL。
轻轻晃动24孔板使细菌均勾分散。
（若为侵入实验，则将24孔板于水平离心机中,1000r/min离心5min促使细菌与细胞的接触；若为粘附实验，则该步离心省略。
7、将24孔板置于37°温箱中静置培养90min。
对初始的感染菌量进行连续10倍稀释，并涂布平板计数。
8、取出24孔板，将每孔中的细胞用预热的WXM培养基洗涤3遍。
9、每孔加入1ml含有100μg/ml庆大霉素的XM培养基，于37°中继续孵育1h。
10、作用结束后，取出细胞板，用WXM培养基充分洗涤孔中的细胞。
然后每孔中加入500μL的裂解细胞，于室温下静置裂解，之后用移液器反复上下吹打细胞，收集全部裂解物。
裂解后的细胞液进行连续倍稀释，并选取，，和这个稀释度涂平板计数。
对于粘附实验，省略庆大霉素作用，细菌与细胞孵育后直接充分洗涤，裂解后计数，选择，和四个稀释度涂平板。
副猪嗜血杆菌毒力因子蹄选和基因功能研究及致脑膜炎大肠杆菌突破血脑屏障的分子机制研究实验中如果需要预先用抑制剂或药物处理细胞，则将抑制剂或药物按指定浓度预先用培养基进行稀释后，加入到孔板中，每孔于°温箱中作用后，再每孔中加入细菌作用。
粘附侵入实验的结果记录以粘附侵入的细菌数目相对于初始接种量的百分比进行计算，并统一以野生株的粘附侵入或者阴性对照组的粘附侵入作为其他各处理组计算其相对百分比。
每组孔重复，结果以平均值士标准误士表示。