脂质体转染

二、脂质体转染操作步骤1、操作步骤[方法一]：

(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。

(3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。

(4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：

(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板底面积。

(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo 质粒DNA或供体DNA。②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。

(3)(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。

(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时，

(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24~48小时。

(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

(7)3、稳定的脂质体转染方法如下：(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。(3)在每孔中加入1mL、20%FCS 的DMEM，37℃培养48小时。(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法

细菌粘附侵入实验

1、将细胞按1.0×10⁵ cells/ml的量接种于24孔板中，每孔1ml，置于37°的培养箱中培养3天直至细胞均勾铺满孔底，长满单层的细胞显微镜下可见细胞之间接触紧密，形成该细胞所特有的紧密连接。

2、实验前一天取E.coli菌株接种于含有相应抗生素的BHI培养基中，于37°培养箱中静置培养过夜。

3、取长满单层的HBMEC细胞，用预热的WXM培养基轻柔地将细胞洗3遍，以去除培养基中的双抗。

4、然后每孔中加入400μL培养基，于37°温箱中

5、静置期间取过夜培养的细菌，3000r/min离心5min收集菌体。弃去培养基，将菌体沉淀重悬于1mlXM培养基中。并用培养基调整菌液的OD₆₂₀至0.2约为1.0×10⁸ CFU/ml。

6、分别向24孔板中每孔细胞加入100μL细菌悬液（10⁷CFU,MOI约为100，使总体积达到500μL。轻轻晃动24孔板使细菌均勾分散。（若为侵入实验，则将24孔板于水平离心机中,1000r/min离心5min促使细菌与细胞的接触；若为粘附实验，则该步离心省略。

7、将24孔板置于37°温箱中静置培养90min。对初始的感染菌量进行连续10倍稀释，并涂布平板计数。

8、取出24孔板，将每孔中的细胞用预热的WXM培养基洗涤3遍。

9、每孔加入1ml含有100μg/ml庆大霉素的XM培养基，于37°中继续孵育1h。

10、作用结束后，取出细胞板，用WXM培养基充分洗涤孔中的细胞。然后每孔中加入500μL的裂解细胞，于室温下静置裂解，之后用移液器反复上下吹打细胞，收集全部裂解物。裂解后的细胞液进行连续倍稀释，并选取，，和这个稀释度涂平板计数。对于粘附实验，省略庆大霉素作用，细菌与细胞孵育后直接充分洗涤，裂解后计数，选择，和四个稀释度涂平板。副猪嗜血杆菌毒力因子蹄选和基因功能研究及致脑膜炎大肠杆菌突破血脑屏障的分子机制研究实验中如果需要预先用抑制剂或药物处理细胞，则将抑制剂或药物按指定浓度预先用培养基进行稀释后，加入到孔板中，每孔于°温箱中作用后，再每孔中加入细菌作用。粘附侵入实验的结果记录以粘附侵入的细菌数目相对于初始接种量的百分比进行计算，并统一以野生株的粘附侵入或者阴性对照组的粘附侵入作为其他各处理组计算其相对百分比。每组孔重复，结果以平均值士标准误士表示。