毕赤酵母发酵[行业特制]
毕赤酵母发酵
6/28/2014
1.2过氧物酶体(Peroxisome)：遍布于真核生物的细胞器中, 用来去除有
6/28/2014
1. 3GFP-SKL（过氧化物酶体定位蛋白）,该载体含有融合了过氧化物酶体 定位信号1(PTS1)的绿色荧光蛋白报告分子GFP-SKL编码基因 成功地用于描 述不同 时间进程的AOX1启动子和过氧物酶体生物合成因素的特征
6/28/2014
2.3：补料分批培养条件
研究了三种不同发酵条件下的PpAOX1启动子（ YGLY29325 ）和过氧化物酶体 生物合成（ YGLY31884 ）的调控。 诱导阶段分批补料条件 ML:甲醇的起始供应速率为2.6gl/lh然后在0.0063/h的基础上以幂指的形式增加 SML:甲醇培养20h用50%的葡萄糖15g/h的速度培养8h作为一个周期共培养3个周期 OL:甲醇进料保持反应器中甲醇1％，每当DO迅速增加，这表明甲醇消耗。 DO级联 被打开，关闭和搅拌速度 被减小到实现氧气的限制
6/28/2014
2.4 GFP表达的定量和可视化： 约107固定的酵母细胞经PBS洗后用mounting solution重悬制作切片用 Axioscope 2 Plus 显微镜来观察OpenLAB软件来实现相机控制和图像收 集Volocity软件用来量化GFP在细胞中的强度
6/28/2014
2.5抗体效价的测定 在培养上清液中于280nm处抗体浓度用二极管阵列检测器和蛋白A亲 和柱与HPLC系统
6/28/2014
6/28/2014
3.3毕赤酵母AOX1启动子（YGLY29325）根据三种不同的补料分批条件规制 - 甲醇 限制（ML），切换与葡萄糖和甲醇（SML）和氧气限制（OL）补料分批条件。 （a） GFP荧光表达图像（b）不同诱导时间的荧光蛋白相对密度。对于ML和OL，时间表示分 批阶段（T1），甘油补料分批阶段诱导前（T2）和诱导期（T3，10±2小时; T4中， 36±2小时; T5，62±2小时; T6，84±2小时）。对与SML条件下，细胞生长是在T2，T4 和T66/28/2014 葡萄糖阶段，诱导是在T3和T5甲醇阶段
一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法
一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法植物纤维素富含木聚糖，这是一种可溶于水的多糖，可以提供糖分和能量给生物体。
而木聚糖酶则可以将木聚糖分解为各种单糖，因此在生物制造、化学和环境领域有着广泛的应用。
本文讨论了一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法。
首先，我们需要了解什么是毕赤酵母。
毕赤酵母，也称“木质素分解真菌”，是一种在自然环境中广泛存在的真菌。
它主要生长在植物表面、土壤和水中，可以分解植物纤维素和木质素。
毕赤酵母通过培养和生长，可以大量生产木聚糖酶。
毕赤酵母固态发酵的方法是种植毕赤酵母菌株在物理或化学反应器内，以自然或添加的固态基质为生长基质进行发酵。
该方法比传统的液体发酵方法更加高效，环保和经济。
目前，毕赤酵母固态发酵已经被证明是一种可行的生产木聚糖酶的方法。
接下来，我们将详细介绍毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的步骤。
1. 筛选毕赤酵母菌株用一定方法筛选出适合固态酵素生产的毕赤酵母菌株。
在此过程中，考虑到毕赤酵母的生长条件需要有更好的适应性，因此将根据原始环境，筛选生长适应性更强的毕赤酵母菌株。
2. 选取适合的基质调配好相应的培养基，选择适合的固态基质，为毕赤酵母生长和繁殖提供营养，促进木聚糖酶的产生。
同时要确保基质的来源和化学成分、水分、酸碱度都能达到适宜的水平，以保证所生产出的木聚糖酶的纯度和活性。
3. 倒放法在倒放法中，先将经过有效灭菌处理的基质填充到反应器中，然后加入所筛选出的毕赤酵母菌株。
接着，进行表面打平，以保持反应器顶部平整。
4. 发酵条件使反应器维持一定的温度和湿度，具体的温度范围和湿度数值取决于毕赤酵母菌株和所选取的基质类型。
同时，要保证反应器内部通风良好，这可以帮助加速生长和减少气泡的产生以及发酵筛选条件的优化。
5. 收取、组织提取与测定当反应到达一个指定的时间段后，可以进行对所生产出的木聚糖酶的收获。
在此过程中，采取先将基质采获，然后进行适当的干燥以控制其湿度量，并用适量的缓冲液提取酵素，接着才作为酵素来为后续项目的进行提供所需的需要。
毕赤酵母发酵手册
毕赤酵母发酵手册总览简介：毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。
毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度，我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。
因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。
下面+s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃所给出的指导是基于MutMut和发酵罐中发酵而成。
请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。
下面所给出的表就是整个发酵参数：在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。
下面的表格描述了这些参数和※设备推荐：下面是所推荐设备的清单：·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。
你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。
这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。
·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。
·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。
·添加甘油和甲醇的补料泵。
·pH的自动控制。
培养基的准备：你需要准确配置下列溶液：·发酵所需的基本盐类（第11页）·PTM补充盐类（第11页）1·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM补充盐每升甘油。
1·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM补充盐每升甲醇。
1毕赤酵母生长的测定：在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。
培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。
溶氧的测定：简介：溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。
毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。
毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。
然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。
毕赤酵母发酵罐发酵
微生物发酵罐发酵（毕赤酵母）灭菌前：室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母发酵）用6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵pH很长时间是碱性的（如某些细菌发酵）用6.86校正零点，9.18校正斜率）；室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定，100%点接上溶氧电极，放置在空气中较定；或2.0点在灭菌过程中，温度达到121度左右压力0.12mpa左右时候标定，100%在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定，转速在发酵初始转速，通气量在发酵初始通气量时候标定灭菌：1.灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80~90℃，将排气阀逐渐关小。
接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。
2.保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。
（注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。
）灭菌后:A.消耗甘油阶段1.灭菌后冷却30℃时：2.冷却至30℃时，开启搅拌(转速最大)和通气(0.1-1.0vvm),接通28%氨水(未稀释)调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐；3.从摇瓶中接种种子液，DO值为100%，开始培养后会消耗，导致DO值下降，通氧气以确保DO值超过20％，速率先为0.1vvm。
4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。
【每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。
】5.这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。
毕赤酵母发酵过程的染菌分析及预防策略
毕赤酵母发酵过程的染菌分析及预防策略毕赤酵母是一种重要的工业微生物，在酿酒、制曲、酱油等方面都有着重要的作用。
毕赤酵母的发酵过程中，往往会受到细菌、霉菌等其他微生物的影响，引起发酵产物的变质甚至失败。
对毕赤酵母发酵过程的染菌分析及预防策略进行研究和探讨，对于保障毕赤酵母的发酵质量具有重要的意义。
1. 毕赤酵母发酵过程的染菌分析毕赤酵母发酵过程中主要存在的染菌有细菌和霉菌两类。
细菌主要包括乳酸菌、酪酸菌、醋酸菌等，它们会通过酸化作用和产生挥发性化合物等方式影响毕赤酵母的发酵过程。
而霉菌则主要包括曲霉、青霉、黄曲霉等，它们会产生孢子和毒素，引起毕赤酵母的变质和发酵失败。
在进行毕赤酵母发酵过程的染菌分析时，首先需要对发酵前的原料进行严格的检验，确保原料的无菌性和纯度。
需要对发酵过程中的环境、设备、操作人员等方面进行监测和检测，及时发现和处理可能存在的污染源。
还需要对已发酵的毕赤酵母产品进行微生物学检测，了解发酵过程中是否存在染菌情况以及染菌程度，为后续的预防控制提供依据。
对于毕赤酵母发酵过程的染菌预防，可以从原料、环境、设备、操作人员等方面进行全面的控制和管理。
对于原料方面，要求原料的质量要求高，保证原料的无菌性和纯度。
在接收原料时，需要对原料进行检验和检测，严格控制原料的品质。
还需要对原料进行合理的储存和运输，避免在储存和运输过程中引入细菌和霉菌等污染源。
对于发酵过程中的环境、设备和操作人员等方面也需要进行严格的控制和管理。
在发酵车间内，要求保持清洁、干燥、通风良好的环境，避免空气中的细菌和霉菌引入发酵过程。
对于发酵设备和工具，要求进行定期的清洁和消毒，确保设备的无菌性和洁净度。
操作人员要求严格执行卫生操作规程，穿着合格的工作服和使用个人防护用品，避免人为的污染。
对于发酵后的毕赤酵母产品也需要进行合理的储存和运输管理。
在储存和运输过程中，要求避免产品受到污染和变质，保障毕赤酵母产品的质量和安全性。
对毕赤酵母发酵过程的染菌分析及预防策略进行研究和探讨，可以有效保障毕赤酵母的发酵质量，避免因染菌引起的发酵变质和失败。
毕赤酵母的摇瓶发酵方法[指南]
![毕赤酵母的摇瓶发酵方法[指南]](https://img.taocdn.com/s3/m/3ffac097d5d8d15abe23482fb4daa58da1111c5e.png)
毕赤酵母的摇瓶发酵方法：一、摇瓶发酵方法:毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，1、酵母菌株生长阶段；2、脂肪酶诱导表达阶段。
1、酵母生长阶段。
准备试剂：1000ml BMGY培养基，1000ml BMMY培养基，10X的甲醇，摇瓶1L（灭菌），温控摇床，50ml离心管（灭菌）。
紫外分光光度计，石英比色皿。
以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
（1）往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMGY培养基，然后加入约1ml脂肪酶菌株（培养基：菌液=100：1），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过）。
置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母生长，OD600=2.0-6.0，时间约为15-24小时。
（2）将发酵液转入50ml离心管，1500g-3000g离心5min。
去掉上清，用BMMY 培养基将菌体浓度稀释至OD600=1.0，约有500ml左右。
将稀释后的发酵液分别加入到1L的药瓶中，每个摇瓶150ml发酵液（绝不能超过200ml）。
（3）将摇瓶置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母表达脂肪酶，每24小时加入一次5%的甲醇，使甲醇的终浓度为0.5%。
连续诱导表达48小时。
（4）将发酵液进行12000rpm/min离心5min，取上清（若上清仍混浊，可反复离心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMGY培养基的配制（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物（Yeast Extract）,加水至700ml；1210C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml，10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甘油 100ml。
BMMY培养基的配制方法（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物,加水至700ml；1210C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml，10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甲醇 100ml。
重组毕赤酵母发酵产脂肪酶及其应用
重组毕赤酵母发酵产脂肪酶及其应用引言:脂肪酶是一种重要的生物催化剂，在食品加工、工业生产和生物医学领域中具有广泛的应用前景。
而重组毕赤酵母发酵产脂肪酶则成为了一种备受关注的方法，本文将从发酵产脂肪酶的原理、重组毕赤酵母的构建、脂肪酶应用以及前景展望等方面进行阐述。
一、发酵产脂肪酶的原理脂肪酶是一类催化脂肪水解的酶，其生产过程通常采用微生物发酵。
重组毕赤酵母发酵产脂肪酶的原理是通过将脂肪酶的基因导入毕赤酵母中，通过发酵过程使其表达并产生脂肪酶。
脂肪酶的基因导入毕赤酵母后，经过转录、翻译等生物过程，最终在酵母细胞内合成脂肪酶。
这种方法具有高效、经济、环境友好等优点，因此备受关注。
二、重组毕赤酵母的构建重组毕赤酵母的构建是实现发酵产脂肪酶的关键。
首先，需要从天然来源中提取脂肪酶基因。
然后，将脂肪酶基因与毕赤酵母的表达载体连接，并导入毕赤酵母细胞中。
接下来，通过筛选和培养优化等方法，得到高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母菌株。
通过这一构建过程，可以实现大规模、高效率产脂肪酶的目标。
三、脂肪酶的应用脂肪酶在食品加工、工业生产和生物医学领域中有着广泛的应用。
在食品加工领域，脂肪酶可用于改善食品的质感和口感，例如在奶制品中应用脂肪酶可使其更加顺滑、细腻。
在工业生产领域，脂肪酶可用于生产生物柴油和洗涤剂等，具有良好的环境友好性。
在生物医学领域，脂肪酶可用于药物制剂、诊断试剂和生物传感器等，对疾病的治疗和检测有着重要的作用。
四、前景展望重组毕赤酵母发酵产脂肪酶技术的发展为脂肪酶的生产和应用提供了新的途径。
随着基因工程技术的不断进步，重组毕赤酵母发酵产脂肪酶的效率将进一步提高，产量将大幅增加。
同时，脂肪酶的应用领域将不断扩展，为食品工业、化工工业和医药领域带来更多的创新和应用。
结论:重组毕赤酵母发酵产脂肪酶是一种高效、经济、环境友好的方法。
通过构建重组毕赤酵母菌株，可以实现大规模、高效率产脂肪酶的目标。
脂肪酶在食品加工、工业生产和生物医学领域中有着广泛的应用，且前景广阔。
《毕赤酵母(Pichiapastoris)LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》
《毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》一、引言随着生物技术的快速发展，酶类物质在工业、医药及生物工程等领域的应用日益广泛。
纳豆激酶作为一种天然存在的溶栓酶，因其具有良好的生物活性和稳定性而备受关注。
本文选取毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013作为纳豆激酶的生产菌株，通过对其发酵过程进行优化及发酵动力学研究，以期提高纳豆激酶的产量及发酵效率。
二、材料与方法2.1 材料本研究所用材料包括毕赤酵母LNF013菌株、发酵培养基、酶活性检测试剂等。
2.2 方法（1）发酵过程优化：通过调整培养基组成、发酵温度、pH 值、接种量等参数，对毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的发酵过程进行优化。
（2）发酵动力学研究：采用动力学模型对发酵过程进行描述，分析各参数对纳豆激酶产量的影响，并建立相应的数学模型。
三、结果与分析3.1 发酵过程优化结果通过调整各参数，我们发现：（1）培养基组成：适当增加碳源、氮源浓度有助于提高纳豆激酶的产量。
（2）发酵温度：在30℃左右，毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的活性较高。
（3）pH值：pH值为6.5左右时，菌株生长及纳豆激酶产量达到最佳状态。
（4）接种量：适宜的接种量有助于提高菌株的生长速度及纳豆激酶的产量。
3.2 发酵动力学研究结果通过建立动力学模型，我们发现：（1）菌体生长与纳豆激酶产量之间存在明显的相关性，可通过监测菌体生长情况来预测纳豆激酶的产量。
（2）各参数对纳豆激酶产量的影响程度不同，其中培养基组成、温度和pH值对纳豆激酶产量的影响最为显著。
四、讨论通过对毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的发酵过程进行优化及发酵动力学研究，我们找到了提高纳豆激酶产量的关键因素。
在实际生产中，可根据实际情况调整这些参数，以实现更高的纳豆激酶产量及发酵效率。
此外，建立的动力学模型有助于预测和调控发酵过程，为工业化生产提供有力支持。
6毕赤酵母介绍
毕赤酵母及级胰岛素——优思灵巴斯德毕赤酵母(P／ch／a pastor／s)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处。
酵母作为一种最简单的单细胞真核生物, 兼有原核生物和真核生物的某些优点。
毕赤酵母生活史与酿酒酵母十分相似。
这使得毕赤酵母的发酵工程部分可与酿酒酵母相同, 从而节省了重新购臵设备和进行新技术探索的巨额花费, 这是用其他方法进行大规模商品化的外源蛋白生产所不能比拟的优势。
现将毕赤酵母表达系统优点概括如下:①毕赤酵母更接近高等真核细胞, 不含内毒素和其他有害物质, 使用安全;②同酿酒酵母一样, 繁殖速度快, 对培养条件要求低, 培养基价廉, 能进行高密度培养, 且能耐受较高的液体静压, 便于工业化生产;②该系统的载体能与核基因组进行整合, 因此构建的菌株较稳定, 一般不会在传代过程中出现丢失现象;③在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内, 又可在分泌信号作用下将蛋白分泌至胞外;⑤具有强有力的易控制的乙醇氧化酶基因(AOX1)或磷酸甘油酸脱氢酶( GAP) 基因启动子作为外源基因启动子, 可对外源蛋白的表达进行严格调控;⑥作为真核表达系统, 可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰, 即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N糖基化、O糖基化, 从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性;⑦外源蛋白表达量高, 同时自身分泌的背景蛋白少, 表达产物易于纯化;⑧和酿酒酵母相比, 毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基, 比酿酒酵母每条侧链平均50～150个甘露糖残基短得多。
毕赤酵母极少出现过渡糖基化, 可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能, 而且糖链中不含具有致敏作用的α21, 32甘露糖, 使其使用更加安全。
《毕赤酵母(Pichiapastoris)LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》
《毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》一、引言毕赤酵母（Pichia pastoris）作为一种重要的工业生产微生物，近年来在生产纳豆激酶方面展现出了良好的应用前景。
纳豆激酶是一种能够促进血液凝固和溶栓的酶，在医药和生物工程领域具有广泛的应用价值。
本文以毕赤酵母LNF013为研究对象，针对其产纳豆激酶的发酵过程进行优化研究，并深入探讨其发酵动力学特征，旨在提高纳豆激酶的产量及生产效率。
二、材料与方法2.1 材料实验所用毕赤酵母LNF013菌株、培养基及其他试剂均符合实验要求。
2.2 方法（1）发酵过程优化：通过调整发酵温度、pH值、接种量、培养时间等参数，探究各因素对纳豆激酶产量的影响。
（2）发酵动力学研究：通过实验数据，分析毕赤酵母LNF013在生长和产酶过程中的动态变化，建立发酵动力学模型。
三、结果与分析3.1 发酵过程优化结果通过调整发酵条件，我们发现以下因素对纳豆激酶的产量具有显著影响：（1）温度：在XX-XX℃的范围内，随着温度的升高，纳豆激酶的产量先增加后降低，存在一个最佳温度。
（2）pH值：pH值对纳豆激酶的产量也有较大影响，在pH 值为XX-XX的范围内，纳豆激酶产量较高。
（3）接种量：适当的接种量有利于提高纳豆激酶的产量，但过高的接种量可能导致竞争生长，降低产量。
（4）培养时间：随着培养时间的延长，纳豆激酶的产量逐渐增加，但达到一定时间后，产量增长速度减缓。
3.2 发酵动力学分析根据实验数据，我们绘制了毕赤酵母LNF013的生长曲线和纳豆激酶产量曲线。
通过分析这些曲线，我们发现毕赤酵母LNF013在生长过程中存在一个对数生长期和稳定生长期，而纳豆激酶的产量主要在稳定生长期达到高峰。
此外，我们还建立了发酵动力学模型，分析了各因素对毕赤酵母LNF013生长和产酶的影响。
四、讨论通过本文的研究，我们发现在一定的范围内调整发酵条件可以显著提高毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的产量。
毕赤酵母发酵罐发酵资料讲解
毕赤酵母发酵罐发酵微生物发酵罐发酵（毕赤酵母）灭菌前：室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母发酵）用6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵pH很长时间是碱性的（如某些细菌发酵）用6.86校正零点，9.18校正斜率）；室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定，100%点接上溶氧电极，放置在空气中较定；或2.0点在灭菌过程中，温度达到121度左右压力0.12mpa左右时候标定，100%在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定，转速在发酵初始转速，通气量在发酵初始通气量时候标定灭菌：1.灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80~90℃，将排气阀逐渐关小。
接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。
2.保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。
（注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。
）灭菌后:A.消耗甘油阶段1.灭菌后冷却30℃时：2.冷却至30℃时，开启搅拌(转速最大)和通气(0.1-1.0vvm),接通28%氨水(未稀释)调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐；3.从摇瓶中接种种子液，DO值为100%，开始培养后会消耗，导致DO值下降，通氧气以确保DO值超过20％，速率先为0.1vvm。
4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。
【每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察. 将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。
】5. 这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。
毕赤酵母发酵补料生长原理
毕赤酵母发酵补料生长原理嘿，朋友们！今天咱来唠唠毕赤酵母发酵补料生长原理。
你说这毕赤酵母啊，就像是个贪吃的小孩子。
它在发酵的过程中，得不断地给它喂好吃的，也就是补料，这样它才能快快长大，好好干活呀！
想象一下，毕赤酵母就像一个在努力成长的运动员，补料呢，就是它的营养大餐。
没有这些营养，它怎么能有足够的能量去冲刺，去发挥它的本领呢？
在发酵过程中，一开始，毕赤酵母就像刚起跑的选手，活力满满。
这时候给它合适的营养补料，那就是给它加油打气呀！随着发酵的进行，它不断消耗着营养，就像运动员跑了一段路，体力开始下降了。
这时候不及时补料，那可不行，它就没力气跑下去啦！
而且啊，这补料也不是随便乱给的。
就跟咱人吃饭一样，得讲究个营养均衡。
给多了，它消化不了，那不就浪费了嘛；给少了，它吃不饱，又怎么能茁壮成长呢？这可真是个技术活呢！
你说这毕赤酵母发酵补料生长，是不是跟咱培养孩子有点像？得精心照顾，得给它合适的东西，让它在一个良好的环境里成长。
如果不管不顾，那能行吗？肯定不行呀！
再想想，这毕赤酵母在发酵罐里努力生长，不就是为了给我们带来好东西嘛。
我们可得好好对待它，让它能发挥出最大的作用呀！
咱平时做面包、酿酒啥的，不都得靠这毕赤酵母嘛。
要是不了解它的发酵补料生长原理，怎么能做出好吃的面包、好喝的酒呢？这可不是开玩笑的呀！
所以说呀，咱得重视这个毕赤酵母发酵补料生长原理。
别小看了这些小小的微生物，它们的作用可大着呢！咱得好好利用它们，让它们为我们的生活增添更多的美好。
怎么样，是不是觉得很有意思呢？这就是毕赤酵母的神奇世界呀！。
江南大学科技成果——重组毕赤酵母发酵生产碱性果胶酶
江南大学科技成果——重组毕赤酵母发酵生产碱性果胶酶项目简介
该项目成功构建了一株高产碱性果胶酶的毕赤酵母工程菌，通过对发酵过程的优化控制，在3L罐中酶活达到890U/mL。
在此基础上进行了碱性果胶酶的中试及其工业化研究，在10吨发酵罐中产酶达到1305U/mL.采用该重组碱性果胶酶代替传统的强碱高温工艺，废水COD显著降低，可生化性较大提高。
处理体系pH值为9.4，代于碱精练水平；酶处理温度低于碱处理，这些结果对棉织物前处理的清洁生产具有重要的应用价值。
本项目受到国家863计划资助，获中国轻工业联合会科学技术一等奖。
创新要点
在10吨发酵罐中产酶达到1305U/mL.采用该重组碱性果胶酶代替传统的强碱高温工艺，废水COD显著降低，可生化性较大提高。
处理体系pH值为9.4，代于碱精练水平。
效益分析
纺织业是污染非常严重的工业，在棉制物前处理的退浆加工中，传统工艺耗费大量的水和化学品，不仅耗费资源，同时造成环境污染。
利用碱性果胶酶处理织物后，替代传统的高温大量漂洗的前处理水平，以达到在处理过程中节约水耗与能耗，并减少废水排放量。
本研究成果总体达到国际先进水平，发酵水平处于国际领先水平，保障了其巨大的市场需求。
推广情况已转让相关企业。
授权专利
一种用温度策略促进重组毕赤酵母高产碱性果胶酶的方法，200710134521.6；一株产碱性果胶酶工程菌及其构建和用该菌生产碱性果胶酶的方法，200710130976.0；一种用添加山梨醇提高发酵生产碱性果胶酶产量的方法，200910030831.2。
一种发酵毕赤酵母及其应用[发明专利]
![一种发酵毕赤酵母及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/19a005f45ebfc77da26925c52cc58bd6318693d3.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110032614.8(22)申请日 2021.01.12(83)生物保藏信息CGMCC No.19317 2020.01.09(71)申请人 浙江省林业科学研究院地址 310023 浙江省杭州市西湖区留下镇留和路399号(72)发明人 彭华正 金群英 朱汤军 张飞英 叶华琳 (51)Int.Cl.C12N 1/16(2006.01)A01N 63/30(2020.01)A01P 21/00(2006.01)A01P 3/00(2006.01)C12R 1/84(2006.01)(54)发明名称一种发酵毕赤酵母及其应用(57)摘要一种发酵毕赤酵母及其应用，属于生物技术领域。
本发明一方面提供了一种新的发酵毕赤酵母菌株，另一方面提供了该菌的应用，尤其是该菌在保持和提升植物花粉活力上的的作用。
本发明的发酵毕赤酵母及其发酵液对果树花粉萌发活力有较好的促进作用，和对植物有一定的抗病害作用，可在农业生产上用于提高授粉效率、提升结实率、降低落花落果，从而增加产量，提高果树经济效益。
本发明的发酵毕赤酵母及其发酵物源于自然归于自然，与环境友好兼容，无污染无残留，可作为新型无公害微生物药剂用于果树的无害化生产。
权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图1页CN 112574896 A 2021.03.30C N 112574896A1.一种发酵毕赤酵母菌Pichia fermentans 菌株15B1，其保藏号为CGMCC No.19317。
2.如权利要求1所述的发酵毕赤酵母菌Pichia fermentans 菌株15B1作为抑菌剂的应用，所述抑菌剂为胶胞炭疽菌、葡萄座腔菌和串珠状赤霉菌的抑菌剂。
3.如权利要求1所述的发酵毕赤酵母菌Pichia fermentans 菌株15B1在保持和提升花粉活力上的应用。
毕赤酵母发酵培养基配方
毕赤酵母发酵培养基配方
哎呀，说到毕赤酵母发酵培养基配方，这可真是个技术活儿。
我得说，这玩意儿可不简单，得精确到毫克，还得考虑各种营养成分的比例。
不过，别担心，我这就给你细细道来。
首先，咱们得准备一些基本的原料。
毕赤酵母这家伙，它喜欢糖，所以葡萄糖是必不可少的。
咱们得准备个100克，这可是它的主食。
然后，酵母提取物也不能少，这玩意儿能提供酵母生长所需的维生素和氨基酸，大概需要5克。
还有，别忘了添加一些无机盐，比如磷酸二氢钾和硫酸镁，这些对酵母的生长也很重要，各准备1克。
接下来，咱们得聊聊碳源和氮源。
毕赤酵母对碳源的要求比较高，除了葡萄糖，还可以加点甘油或者乳糖，这取决于你想要培养的酵母的特性。
氮源的话，除了酵母提取物，还可以加点蛋白胨，大概2克左右。
哦，对了，还有pH值。
毕赤酵母喜欢偏酸性的环境，所以咱们得把培养基的pH 值调到5.0-6.0之间。
这可是个技术活儿，得用pH试纸或者pH计来精确测量。
最后，别忘了消毒。
咱们得把培养基煮沸个15-20分钟，确保没有杂菌污染。
然后，等培养基冷却到室温，就可以分装到培养瓶里了。
这就是毕赤酵母发酵培养基的基本配方了。
当然，具体的配方可能还得根据你的实验目的和酵母的特性进行调整。
不过，掌握了这些基本步骤，你就已经迈出了成功的第一步。
记得，做实验的时候要有耐心，观察酵母的生长情况，及时调整配方。
毕竟，每个实验室的条件都不一样，有时候还得靠自己摸索。
祝你实验顺利，酵母长得壮壮的！。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
16
3.4：ML，OL，及（b）SML 过氧化物酶体的生物合成三种 不同的培养条件下比较。 SML： 切换葡萄糖和甲醇进料。在过 氧化物酶体中使用GFP-SKL （YGLY31884）进行定量测定。 数据点表示在两个独立的运行 平均值。星号（*）表示甲醇阶 段
一类荟萃
17
一类荟萃
18
3.5三种不同的工艺条件下（YGLY29325）发酵特性 - ML， OL和SML。 （一）细胞的密度分布（gWCW/ L）; （二）细胞列 解指数（毫克 DNA/ L）; （三）抗体效价（毫克/升）; （d） OL条件下延长诱导时间的细胞密度和抗体效价。
一类荟萃
21
• AOX1启动子是在ML最活跃下，但OL下不太活跃。
SML:甲醇培养20h用50%的葡萄糖15g/h的速度培养8h作为一个周期共培养3个周期 OL:甲醇进料保持反应器中甲醇1％，每当DO迅速增加，这表明甲醇消耗。 DO级联 被打开，关闭和搅拌速度 被减小到实现氧气的限制
一类荟萃
8
2.4 GFP表达的定量和可视化：
约107固定的酵母细胞经PBS洗后用mounting solution重悬制作切片用 Axioscope 2 Plus 显微镜来观察OpenLAB软件来实现相机控制和图像收 集Volocity软件用来量化GFP在细胞中的强度
一类荟萃
19
3.6 在甲醇补料阶段的代谢过程（a）甲醇限定（ML）（b） 氧受限（OL）条件下补料分批巴斯德毕赤酵母的培养。
一类荟萃
20
4结论与分析
在这项研究中，我们调查AOX1启动子和过氧化物酶体如何被调 节以响应碳源（例如甲醇）和氧气分子的可用性 在蛋白质生产阶 段，以更好地了解在毕赤酵母发酵常用的工艺条件。
酵母表达手册）
一类荟萃
5
一类荟萃
6
一类荟萃
7
2.3：补料分批培养条件
研究了三种不同发酵条件下的PpAOX1启动子（ YGLY29325 ）和过氧化物酶体 生物合成（ YGLY31884 ）的调控。
诱导阶段分批补料条件
ML:甲醇的起始供应速率为2.6gl/lh然后在0.0063.5抗体效价的测定
在培养上清液中于280nm处抗体浓度用二极管阵列检测器和蛋白A亲 和柱与HPLC系统
一类荟萃
10
2.6:细胞裂解
从毕赤酵母细胞释放细胞外的DNA使用 Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit 双链DNA检测试剂盒检测
一类荟萃
11
3实验结果与讨论 3.1:
额外增加1%甲醇（OL）DO (%) ：
黑色直线，甘油或葡萄糖：蓝色,甲 醇:红色。细胞湿重：黑色三角
一类荟萃
14
一类荟萃
15
3.3毕赤酵母AOX1启动子（YGLY29325）根据三种不同的补料分批条件规制 - 甲醇 -
限制（ML），切换与葡萄糖和甲醇（SML）和氧气限制（OL）补料分批条件。 （a）
通过荧光显微术 UB - R- GFP和GFP- SKL 被正确地定位于细胞 质和过氧化物酶体， 符合预期
一类荟萃
12
一类荟萃
13
3.2:YGLY29325的三种不同的补料
分批发酵条件的取样数据(a) 甲醇
限制 (ML); (b) 葡萄糖培养8h甲醇 培养(20 h) (SML); (c) 氧气限制并
题目
Regulation of alcohol oxidase 1 (AOX1) promoter and peroxisom biogenesis in different fermentation processes in Pichia pastoris
毕赤酵母不同发酵进程中乙醇氧化酶启动子和过氧物酶体生物合 成 的调控规律
文章来源：Journal of biotechnology
一类荟萃
1
• 1背景介绍
• 2实验材料和方法
• 3实验结果
• 4结论与分析
一类荟萃
2
背景介绍
1.1醇氧化酶AOX1基因启动子作为甲醇诱导的强启动子,在Pichia pastoris表达系统生产重组蛋白中得到广泛应用。P.pastoris中的转录 因子通过特异的顺式作用元件与启动子相互作用而影响基因的转录,因此 通过调节AOX1基因启动子的活性可以控制下游基因的表达
一类荟萃
3
1. 3GFP-SKL（过氧化物酶体定位蛋白）,该载体含有融合了过氧化物酶体 定位信号1(PTS1)的绿色荧光蛋白报告分子GFP-SKL编码基因 成功地用于描 述不同 时间进程的AOX1启动子和过氧物酶体生物合成因素的特征
1.4泛素蛋白（细胞液中的短周期荧光蛋白）泛素(ubiquitin)是一种存 在于大多数真核细胞中的小蛋白。它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质， 使其被水解。当附有泛素的蛋白质移动到桶状的蛋白酶的时候，蛋白酶就会 将该蛋白质水解
GFP荧光表达图像（b）不同诱导时间的荧光蛋白相对密度。对于ML和OL，时间表示分
批阶段（T1），甘油补料分批阶段诱导前（T2）和诱导期（T3，10±2小时; T4中，
36±2小时; T5，62±2小时; T6，84±2小时）。对与SML条件下，细胞生长是在T2，T4
和T6 葡萄糖阶段，诱导是在T3和T5甲醇阶一段类荟萃
一类荟萃
4
二：实验材料和方法
2.1：质粒的构建
表达GFP- SKl pGLY11245或pGLY13173 转化YGLY27355或YGLY31884 YGLY14836生 产单克隆IgG1抗体
表达Ub-R-GFP pGLY10148转化 YGLY19309或YGLY29325 生产单克隆IgG1抗体 2.2：转化：毕赤酵母感受态的制备和电转化的方法（参见nvitrogen公司的Pichia