动物分子遗传育种学(第2章-1)

Genome Size (Mb)
Homo sapiens E.coli
3,000 4.6
什么是C 值？
通常是指一种生物单倍体基因组DNA的 总量.
在真核生物中，C值一般随着生物的进化而 增加，高等生物C值一般大于低等生物。 C值悖理： 生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比 例增加
阴影部分为一个门内C-值的范围
H 软件预测 采用NCBI的ORF预测软件 ( ORF finder: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi )判断ORF的可能范围。
1.2 mRNA的5’端即转录起始位点区 通过同源性比较来预测mRNA的5’ 端，最常用的与转录起始位点相关的数 据库是真核启动子数据库(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http://www.epd.unil.ch/ )。
基因家族
一群具有一致的或相似顺序的基因,有的还担负 类似的生物学功能, 可以相互补偿, 比如:E2f transcription factor
Mouse symbol E2f1 E2f2 E2f3
Human Ortholog E2F1 E2F2 E2F3
E2f4 E2f5 E2f6
E2F4 E2F5 E2F6
各重叠群间仍有间隙
顺序间隙 物理间隙
↓
测序时遗漏的测序
↓
载体或宿主菌 选用不当而被丢失 的顺序
解决办法:通过相邻已知 顺序作为探针筛选已有 的基因组文库
解决办法:利用其它宿主菌与 载体重新构建文库
4.2 限制测序

限制测序：是指将一段染色体区段的DNA 顺 序进行组装. 一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基 因组测序中也采用这一方法. 如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据 克隆重叠群,先进行各个BAC克隆的随机测序, 再进行序列组装； 水稻基因组测序计划采取得策略与此相同.

信号肽分析 信号肽分析软件(SignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP ) 把预测过程中证实含完整mRNA 5’端的 Contig翻译为蛋白序列; 然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从 第一个ATG对应的甲硫氨酸Met开始)进行评 估，如果SignalP分析给出正面结果，则测试 序列有可能为信号肽;
1.3 同源查询途径
通过已存入数据库中的基因顺序与 待查的基因组序列进行比较，从中查找 可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于 界定基因的方法称为同源查询。
4 序列的组装
4.1 随机测序与序列组装
随机测序也称”鸟枪法”. 序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼 此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点:不需预先了解任何基因组的情况. A B C
小片段测序
计算机拼装
A
B
C
鸟枪法(Shotgun)测序的问题
A
小片段测序
B
C
计算机拼装
*一个基因完全在另一个基因内部 *部分重叠 * 两个基因共用少数碱基对
*一个基因完全在另一个 基因内部 如：B和A， E和D 其读码结构互不相同
---ATG-----//------AATGCC ----//---ATAACG---//--TAA---A*
B
ATGCCN----NNATAA
*部分重叠 如： K和C *两个基因共用少数 碱基对 如： D和J
什么是单核苷酸多态性
人类99．9％的基因密码是 相同的，而差异不到0．1％， 不同人群仅有140万个核苷 酸差异。这些差异是由“单 一核苷酸多样性”（SNP） 产生的，它构成了不同个体 的遗传基础，个体的多样性 被认为是产生遗传疾病的原 因。在整个基因组序列中， 人与人之间的变异仅为万分 之一，从而说明人类不同 “种属”之间并没有本质上 的区别。
动物
真菌 等 细菌
重复顺序
高度重复顺序： 长度：几个——几千个bp 拷贝数：几百个——上百万个 首尾相连，串联排列 集中分布于染色体的特定区段（如端粒，着丝粒等） 也称卫星DNA 中度重复顺序： 一般分散于整个基因组中； 单一顺序： 基因主要位于单一顺序 动物中单一顺序约占50％ 植物中单一顺序约占20％ 长度和拷贝数差别很大
B
C
A
B
C
两种策略的比较
鸟枪法策略 不需背景信息 时间短 需要大型计算机 得到的是草图(Draft) 指导测序策略 构建克隆群 (遗传、物理图谱) 需要几年的时间
得到精细图谱
4.5 其他测序路线
重要区域优先测序 人们对感兴趣的基因或与疾病相关的 基因优先测序. 如:人类主要组织相容性复合区位于第6号 染色体,与人类免疫系统有关，因而优先 测序.
第一讲 基因组序列解析-1
主要内容:





什么是基因组 什么是基因 DNA测序的方法 DNA序列的组装 人类基因组计划 水稻基因组计划 后基因组学
1. 什么是基因组
基因组就是一个物种中 所有基因的整体组成。 基因组有两层意义：遗 传物质和遗传信息。 要揭开生命的奥秘， 就需要从整体水平研究 基因的存在、基因的结 构与功能、基因之间的 相互关系。
1.1 根据开放读码框预测基因
A 起始密码子 ATG

第一个ATG的确定则依据Kozak规则;
Kozak规则是基于已知数据的统计结果， 所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱 基分布所满足的统计规律.
若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别 标为1,2，3位，则Kozak规则可描述如下： (1)第4位的偏好碱基为G； (2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱 基T； (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； (4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏 好碱基。
C 3’端的确认
3’端的确认主要根据Poly(A)尾序列, 若测试Contig不含Poly(A)序列，则根据 加尾信号序列“AATAAA”和BLAST同 源性比较结果共同判断。
E 密码子偏爱性
编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密 码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。 不同种属间使用同义密码的频率有很大差 异，如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多 为GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。


EST (Expressed sequence tag) 测序
EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探 针很容易从 cDNA文库中筛选全基因,又可从BAC克隆 中找到其基因组的基因序列. 优点: A mRNA 可直接反转录成cDNA,而且cDNA文库也比 较容易构建; B 对cDNA文库大量测序,即可获得大量EST的序列; C EST为基因的编码区,不包括内含子和基因间区域, 一次测序的结果足以鉴定所代表的基因;
5.人类基因组计划
人类基因组计划 （Human genome project）于1990年启 动，我国于1999年加 入该计划，承担其中 1%的任务，即人类3 号染色体短臂上约 30Mb的测序任务。
5.1 人类基因组计划的目的



阐明人类基因组30亿个碱基 对的序列，发现所有人类基 因，并搞清其在染色体上的 位置; 破译人类全部遗传信息，使 人类第一次在分子水平上全 面地认识自我; 解码生命、了解生命的起源、 了解生命体生长发育的规律; 认识种属之间和个体之间存 在差异的起因、认识疾病产 生的机制以及长寿与衰老等 生命现象、为疾病的诊治提 供科学依据。
CAATGCATTA… …GCAGCCAATGC
GAP
错装
实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及 顺序组装
超声波打断纯化的基因组DNA ↓ 琼脂糖电泳收集1.6∼2.0Kb的区段、纯化 ↓ 构建到质粒载体中 ↓ 随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序 为11 631 485 bp ↓ 组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群, ↓
D 终止密码子 -------TAATG-------
J 起始密码子
3. DNA测序的方法

链终止法测序 化学降解法பைடு நூலகம்序 自动化测序-链终止法测序 非常规DNA测序
3.3 自动化测序

基本原理 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧 光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧 光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各 自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时 判读4种碱基. （PCR产物直接测序和克隆测序的比较）
4.3 指导测序与序列组装
建立在基因组图谱基础上的”鸟枪 法”,即所谓”指导鸟枪法”或”指导 测序”。
先将染色体打成比较大的片段(几十-几百Kb), 利用 分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群(Contig), 分别 测序后拼装. 这种策略叫基于克隆群(contig-based)的策 略. A
大片段contig 小片段测序拼装
假基因(Pseudogene)
来源于功能基因 但已失去活性 的DNA序列
产生假基因的原因有: 1. 由重复产生的假基因; 2. 加工的假基因, 由RNA反转录为cDNA 后再整合 到基因组中; 3. 残缺的基因(Truncated gene)
重叠基因: 同一段DNA 能携带两种不同蛋白的信息.
重迭基因有以下几种情况：
5.6 人类基因组计划的论理学
A 个人DNA顺序的隐私权. 如:”次等”基因携带者可能受到岐 视,职 业限制,医疗保险等问题; B 基因专利问题
6. 后人类基因组计划



破解贮存于基因组之中 的遗传语言; 识别、分离、鉴定和克 隆所有基因； 搞清每个基因的功能及 基因之间的相互作用和 相互关系。
5.2 人类基因组草图的完成
2000年6月26日是人类 历史上值得纪念的一天。 人类基因组的工作草图 已经绘制完毕并于这天 向全世界公布。最终完 成图要求测序所用的克 隆能忠实地代表常染色 体的基因组结构，序列 错误率低于万分之一。
5.4 人类基因组测序结果
• 基因数是3万、4万还是10万 人类遗传基因数量比原先估计 的少很多。目前研究表明，人类 基因组中约有3万至4万个蛋白编 码基因，仅仅是果蝇基因数目的 两倍，人有而鼠没有的基因只有 300个。此结论是由两大科研小 组的数据是从DNA水平上得出的； 而“人类有10万多个基因”则是 从RNA水平上得出的结论。所以， 这些数据不能推翻“人类有10万 个基因”的说法。
人类基因组研究的惊人发现
• 19号染色体是含基因最丰富的染色 体，而13号染色体含基因量最少 •目前已经发现和定位了26000多个功 能基因，其中尚有42%的基因尚不知 道功能 •人类基因组中存在“热点”和大片 “荒漠”。在染色体上有基因成簇密 集分布的区域，也有大片的区域只有 “无用DNA” ——不包含或含有极少 基因的成分。基因组上大约有1／4的 区域没有基因的片段。 • 35．3％的基因包含重复的序列。 这说明那些原来被认为是“垃圾”的 DNA也起重要作用，应该被进一步研 究。
7 水稻的基因组
2002年我国科学家完 成了水稻基因组定序和初 步分析。出人意表的是， 水稻的基因竟比人类基因 还要多得多。人类基因大 约有3-4万个，水稻有 46022-55615个基因。因 此水稻基因组可说是继人 类基因组之后，完成定序 的最大基因组，也是至今 已知最大的植物基因组。 由于水稻是全球半数以上 人口的主食，对解决全球 粮食问题具有重要意义。
2. 什么是基因？
是遗传信息的物理和功能单位，包含产生 一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸 序列。 基因分类： 编码RNA的基因，如rRNA基因，snRNA 基因等； 编码蛋白质的基因
基因的不连续性
Intron 和Exon:
大多数真核生物蛋 白质基因的编码顺 序(Exon)都被或长 或短的非编码顺序 (Intron)隔开
第二讲 基因组序列解析-2
问题


基因组序列所包含的全部遗传信息是什 么？ 基因组作为一个整体如何行使其功能？ 用什么方法寻找基因，研究基因地功能 呢？
主要内容：



寻找基因 获取基因的全长cDNA序列 确定DNA顺序中基因的位置 研究基因的功能 基因表达 蛋白质组学
1. 寻找基因