病毒学检验重点
病毒学检测.
形态学检查
病毒蛋白抗原检查
检测病毒核酸
二、病毒的分离培养
将采集的病料接种动物、 禽胚或组织细胞，可进行病毒 的分离培养。
三、病毒的血清学试验
血清学试验是诊断病毒感染和鉴定病毒的重要手段。血 清学试验最常用的有中和试验、血凝及血凝抑制试验、免疫 扩散试验等。
免疫扩散试验
血凝及血凝抑制试验
谢 3
病毒学检测
畜禽病毒性疫病是危害最严重的一类疫病，给畜牧业带 来的经济损失最大。
常用的监测方法有：包涵体的检查、病毒的分离培养、 病毒的血清学试验、动物接种试验、分子生物学的方法等。
一、病毒感染的快速诊断
病毒感染的快速诊断主要有形态学检查、病毒蛋白抗原 检查和检测病毒核酸等方法。
病毒学检验重点
病毒得特点:1、形体微小,能通过细菌滤器,用电子显微镜才能观察到。
2、无细胞结构,其主要成分就是核酸与蛋白质3、每种病毒只含有一种类型得核酸(RNA或DNA)4、因缺乏完整得酶系统与能源,故只能寄生于活细胞内,依靠宿主细胞得代谢系统合成蛋白质与核酸5、病毒以其基因为模板,在宿主细胞内复制出新得病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属,病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主得能力,并具有对敏感宿主得侵染性与复制性7、在宿主体外,能以大分子状态存在,并可长期保持其侵染能力8、有些病毒得核酸能整合到宿主细胞得基因组中,并能诱发潜伏感染体外细胞培养得基本条件:1、条件要求高,培养液组分复杂,需要添加血清才能满足生长需要2、避免微生物污染,需要在培养液中加入抗生素。
3、体外细胞培养得基本要求主要包括细胞接种(尽量选择对数期细胞接种)、4、培养液营养成分、5、酸碱度(能耐受得ph范围为6、6-7、8,依靠缓冲系统调节)、6、气体条件(细胞生长需要CO2 ,大规模培养需要有足够得氧气)、7、温度(最适温度为35-37。
C)、8、水得纯度(一般要求去离子水或三蒸水)、9、无菌条件等实验动物得微生物控制分类:1、普通动物,一级动物,要求不携带动物烈性传染病与人兽共患病病原2、清洁动物,二级动物,在一级动物要求上,不携带对动物危害大、对实验干扰大得病原体,外观健康,主要器官不得有组织病理学病变3、无特定病原体动物,三级动物,除普通动物、清洁动物不得携带病原体外,还要求排除潜在感染或条件致病菌得感染4、无菌动物,四级动物,要求在体内外不得检出其它生命体实验动物得遗传学分类1、近交系,指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育得动物品系2、封闭系,不从外界引入新得血缘,非近亲交配方式得实验动物群体3、突变系,由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状得动物4、杂交群动物,由不同品系杂交所产生得后代5、转基因动物,插入外源基因后能正常繁殖得动物大鼠、小鼠得采血方法1、剪尾采血,动物麻醉后,将尾端剪去约5mm,待血液流出采集,小鼠可每次采血0、1ml,大鼠约0、4ml2、眼眶后静脉丛采血,拇指及食指抓住鼠两耳之间得皮肤固定,轻轻压迫颈部两侧,使眼球充分外凸。
大学考试资料-病毒学检验
病毒的特点是：1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。
2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA）4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染细胞培养技术：是对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法，即模拟体内的生理环境条件，提供细胞适宜的营养条件和温度，在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术二、单层细胞培养：用于培养病毒的细胞有原代细胞、传代细胞（二倍体细胞株和传代细胞系）三、鸡胚的接种途径：1、羊膜腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、尿囊腔接种4、卵黄囊接种四、间接计数在病毒检验过程中较为常用，是判定病毒感染性的定量方法，常用的有：空斑形成单位法，50%终点法，血凝试验和干扰测定空斑形成单位（PFUs）试验：是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度凡事能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。
50%终点法：是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。
LD50：为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量ID50：即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量CCID50：造成50%细胞培养产生病变效应的剂量五、病毒纯化的一般原则：1、释放病毒至细胞外2、去除细胞碎块3、病毒悬液浓缩六、病毒的保存：1、用低温（-60~25℃）、超低温（-70以下）冰箱或液氮罐（-196~150）保存2、冷冻干燥保存七、血清学实验的方法很多，最常用的是中和试验、补体结合试验、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验中和试验：是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。
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第二十三章病毒的形态与结构■病毒的共同特点：【病毒是最微小的、结构最简单的非细胞型微生物，对干扰素敏感】(1〕体积微小(纳米)，用电子显微镜观察；(2)结构简单，只有核酸基因和蛋白质外壳；(3)超级寄生，在活细胞内寄生；■病毒的根本结构与功能：(1)基因组，由DNA或RNA组成，故DNA和RNA病毒。
功能：病毒遗传变异的物质根底，具有编码病毒蛋白、控制病毒性状、决定病毒复制及增殖侵害的功能。
(2)蛋白衣壳，包裹或镶嵌在病毒核酸外面、由病毒基因组编码的蛋白质。
病毒的蛋白衣壳是壳粒组成，它是包裹病毒核酸的的形态亚单位。
功能：保护病毒核酸免受外界环境因素(如核酸水解酶)的影响，同时表现病毒的生物学特性，如对宿主细胞的亲嗜性、致病性、毒力和抗原性。
(3)核衣壳，病毒核酸和蛋白衣壳的总称。
■病毒的特殊结构及其功能：(1)包膜(囊膜)，包裹在病毒核衣壳外面结构，由脂质和糖蛋白组成。
1)、脂质的来源与作用来源：病毒出芽成熟过程中从宿主细胞的核膜或细胞质膜获得。
作用：包膜中脂质对宿主细胞的亲嗜性，决定病毒特定的侵害部位；有包膜病毒可被脂溶剂灭活。
2)、糖蛋白的来源与作用来源：糖获自宿主细胞，蛋白质由病毒自身基因编码。
包膜突起(刺突)构成了病毒糖蛋白的亚单位；作用：流感病毒的包膜突起有病毒血凝素(HA)和病毒神经氨酸酶(NA)两种。
(2)触须常见于腺病毒〔无囊膜〕。
功能：凝聚和毒害敏感的宿主细胞。
第二十四章病毒的复制与变异■病毒复制1、病毒复制周期：病毒基因为模板，籍DNA多聚酶或RNA多聚酶等，使细胞转为复制病毒的基因组，转录、转译出相应的病毒蛋白，最终释放出子代病毒。
2、病毒复制的过程：(1)吸附：病毒配体与细胞膜特异受体结合。
(2)穿入：吸附后进入细胞内，有两种方式，吞饮或融合。
(3)脱壳：脱去衣壳、核酸裸露。
(4)生物合成：无完整病毒可见，血清学检测不出病毒的抗原，为隐蔽期。
脱壳后的病毒基因组在细胞内先合成非结构蛋白，然后根据病毒基因组指令，复制病毒的核酸、合成结构蛋白与非结构蛋白。
病毒学检验知识点
●病毒学检验的特点●病毒学检验的内容和应用范围●新发传染病病毒检测的特点●选择用于病毒培养的细胞遵循的原则●常见细胞污染的来源，种类及防控措施●细胞培养技术在病毒学检验中的应用第二章●鸡胚接种途径，以新城疫病毒接种为例，请说明接种方法好过程●血凝和血凝抑制试验的原理，如何判断结果●动物实验遵循的原则●鸡胚和动物实验的主要用途●实验动物按微生物控制分类的目的，如何分类第五章●电子显微镜技术在病毒鉴定方面的优势快速负染技术简单，负染技术操作简单。
准确:电镜检测的结果主要是发现病毒颗粒的存在是证明病毒存在的最直接证据，对具有明显形态特征的病毒即刻可做出准确的判断。
具有同时检测多种病原的潜力，依赖于已知的核酸序列抗原或抗体信息。
●对病毒进行检测的常规电子显微镜技术负染技术，超薄切片制样技术，免疫电子显微镜技术●负染样本制作过程病毒灭活的方法负染色是一种反衬染色，通过重金属盐溶液染色，增加标本外围密度，在生物标本的外围形成均质的电子不透明环境，而电子能够通过主要由碳，氢氧氮等元素组成的密度较低的生物样本。
形成电子透亮的白色，而时生物标本，显示出负的（较透明的）反差，成像后的效果为在黑色背景下低密度的标本（病毒颗粒）呈现白色透亮状态，从而形成负染色成像。
优点。
大大提高了标本的反差和分辨力，既能够清晰显示出病毒的超微结构。
简便易行，不要求高纯度的标本制备技术技通常不需要对样本进行纯化，有杂质也不会影响对病毒形态8的辨别。
染色技术本身不改变生物样本的活性剂，不因染色造成病毒形态的改变。
第六章●流感病毒和腺病毒的核酸检测方法的异同●鼻咽拭子是呼吸道病毒检测常用的标本，采集此类标本是注意事项。
除鼻咽拭子之外，呼吸道病毒感染检测还可以采集哪些标本●举例说明常见呼吸道感染病毒分离培养时使用的敏感细胞系●肠道病毒和引起肠胃炎的腹泻病毒通常包括哪些，其病毒学地位分别是什么，其基因组特征分别是什么？●肠道病毒和腹泻病毒的区别是什么？肠道病毒EV是小RNA病毒科肠道病毒属，包括脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，埃可病毒，新型肠道病毒。
病毒学- 病毒的检验汇总
可直接用纯化的病毒核酸通过电镜观察，对 其进行鉴定。但技术要求较高。 近年来,PCR核酸测序技术的应用使得病毒核 酸型鉴定的可行性大为增加。 （观看PCR视频）
②脂溶性试验
用乙醚或氯仿处理待检病毒液,而后与未处理 者比较其TCID50的变化,以判断是否敏感。 乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等脂溶剂能破坏病 毒的脂质包膜。 有包膜的病毒对脂溶剂敏感,受脂溶剂的处理 能使病毒失去感染性;无包膜的病毒往往对脂 溶剂有抵抗力。因此,用乙醚等可以鉴定所分 离的病毒是否有包膜。
病毒粒的结构模式图
包膜子粒
包膜
包膜病毒
壳粒
衣壳
核衣壳
核心（核样物）
处理方法:
将病毒悬液2000~3000r/min离心20min,取上清液,分成 两组： 一组为试验组：按与乙醚4:1的比例振荡混合均匀,管口 密封好,4℃过夜后,2000~3000r/min离心20min。此时液 体分为两层,上层为乙醚,下层为病毒液。吸取下层部分, 避免混有乙醚。 另一组为对照组：不加乙醚,处理方法同试验组。 将两组的病毒液同时测定病毒滴度,如果试验组病毒滴 度明显降低,与对照组有明显差异,说明病毒对乙醚敏感, 属于有膜病毒。如果两组的病毒滴度没有显著差异,说 明病毒对乙醚有抵抗力,属于无膜病毒。
(2)病毒的生物学特性 ①细胞病变效应
哪三种现象？
病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。 不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细 胞病变效应。 例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上,出现细胞融合, 产生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、 肾综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到 WI-38或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨 大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使 细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病 毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。
病毒学检验
1. 病毒学检验：是从维护公众健康的角度，以医学病毒学和流行病学为基础，借助免疫学，现代分子生物学和其他分析技术，对临床和流行病学现场的标本进行检测，确定感染的病毒种类和数量，追溯病毒来源，检测和预测病毒变迁，为人群中病毒性疾病的预防和控制提供技术支撑的一门学科。
2. 病毒：是一类普通光学显微镜下可见的、专性细胞内寄生的非细胞型微生物。
3. 原代培养期：从供体体内取出组织，将其分散成单个细胞后接种于培养液中为初次培养，从初次培养到第一次传代培养为原代细胞培养期。
4. 传代细胞系：从人类癌细胞或其他组织细胞制备的传代细胞系来自自发转发的原代细胞系。
5. 细胞培养技术：是模拟体内生理环境条件，提供细胞适宜的营养和温度条件，在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术。
6. 原代细胞：将动物或人的胎儿组织经剪碎、酶消化、稀释计数、加营养液，37℃培养1～2天后，形成的单层细胞或悬浮细胞。
7. 传代细胞：原代细胞培养过程中，大多数细胞退化时，少数细胞又能长期传下去，这种能在培养容器内连续多次传代培养的细胞叫传代细胞。
8. 细胞系：原代培养物经传代培养获得的一群细胞，包含有多种细胞成分，根据其生存期分为有限细胞系和无限细胞系。
9. 细胞株：从原代培养物或细胞系中获得的遗传、生化特性相同的细胞群，如对某种病毒的敏感性或抗性、具有特殊的抗原性等，这些特性在传代培养中保持不变。
10. 细胞病变效应（CPE）大多数病毒感染敏感细胞，在细胞内增殖并与之相互作用后，会引起受感染细胞发生聚集、脱落、融合，形成包涵体，甚至损伤、死亡，可在低倍镜下直接观察，这些特征的改变称为细胞病变效应。
11. 细胞周期是单个细胞分裂增殖的过程，一个细胞经过前期的物质准备进入分裂期而成为两个新细胞，而两次细胞分裂间隔的时间为一个细胞周期，包括G1期、S期、G2期、M期。
12. 血凝试验（HA）是红细胞凝集试验的简称，可初步测定样品中是否有病毒存在及病毒滴度，分为直接血凝试验和间接血凝试验，常用的血凝试验一般指直接血凝试验。
病毒检验技术课堂
第二节 病毒的分离与鉴定
二、病毒增殖的观察
（一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1．细胞形态的改变 （1） 细胞病变效应（cytophathic effect，CPE）
第二节 病毒的分离与鉴定
1．细胞形态的改变
（3）包涵体
某些病毒感染宿主细胞后， 细胞内出现一种光学显微镜下 可见的蛋白质结构，多为圆形、 卵圆形或不定形。一般是由完 整的病毒颗粒或尚未装配的病 毒亚基聚集而成，称为包涵体。
第二节 病毒的分离与鉴定
二、病毒增殖的观察
2．红细胞吸附 有些病毒感染细胞后,细胞膜上 可镶嵌着病毒基因编码产生的 糖蛋白,其中有些能吸附特定种 类的红细胞,或将细胞培养单层 刮下后,经过适当处理,可以凝 集特定种类的红细胞,此类糖蛋 白在细胞表面形成刺突,称为血 凝素。
? 主要有 细胞培养法、鸡胚培养法、动物接种 法等,而对细胞、鸡胚不敏感 ,又没有合适动 物模型的病毒 ,可采用基因克隆的方法。
第二节 病毒的分离与鉴定
一、 病毒的分离培养
组织细胞培养 2.鸡鸡胚胚培培养养
原代细胞培养 二倍体细胞培养 传代细胞
羊膜腔接种 尿囊腔接种 卵黄囊接种 绒毛尿囊膜接种
是将离体活组织块或 分散的组织细胞加以 培养的技术总称，为 病毒分离鉴定中的最 常用的基本方法。
尿囊腔接种 常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒 和新城疫病毒的适应和传代培养
羊 膜 腔
羊膜腔接种
常用于临床流感病毒初次分离
第二节 病毒的分离与鉴定
2. 鸡胚培养
羊膜腔
人工气室
病毒感染的实验诊断
病毒感染的实验诊断● 考点病毒的生物学性状病毒的实验室检查方法常见病毒的感染【内容讲解】第一节概述一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。
仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。
病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。
在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。
一、病毒的基本性状（一）形态结构1.大小和形状：大小：测量单位用纳米表示，一般在20-300nm之间。
形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、弹形、砖形、蝌蚪形等。
2.结构（二）病毒的增殖病毒必须依赖宿主细胞，以特殊的自我复制方式进行增殖。
病毒的复制周期：吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装与成熟、释放6个阶段。
异常增殖：顿挫感染：病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能合成本身的成分或不能组装和释放有感染性的病毒颗粒。
缺陷病毒：由于病毒基因组不完整或基因位点改变而不能进行正常增殖的病毒。
干扰现象：当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象。
（三）噬菌体以细菌、真菌等为宿主，能引起细菌等裂解的病毒。
噬菌体特异性识别细菌表面受体，可用于进行细菌的鉴定与分型。
噬菌体感染细菌后产生两种后果：溶菌周期和溶源性周期。
（四）非寻常病毒比病毒更小更简单的致病因子，又称为亚病毒因子，包括类病毒、卫星病毒和朊粒等。
朊粒个体微小，不含核酸，其主要成分是一种蛋白酶抗性蛋白，对各种理化作用的抵抗力强，具有传染性，是引起传染性海绵状脑病的病原体。
朊粒致中枢神经系统退化性病变，引起牛海绵状脑病（疯牛病）。
克雅病（CJD）和Kuru病被认为与朊粒感染有关。
二、病毒的分类与命名科、属、种3级或科、亚科、属、种4级。
DNA病毒、RNA病毒、DNA和RNA逆转录病毒三大类。
按传播途径可分为呼吸道病毒、胃肠炎病毒、经性传播感染的病毒等。
按感染部位与症状特征可分为肝炎病毒、出血性热病毒、疱疹病毒等。
病毒学检验实验教学大纲(供卫生检验专业使用)
《病毒学检验》实验教学大纲
（供卫生检验专业使用）
一、实验教学的指导思想和教学目的
在理论学习基础之上，培养学生病毒检测的基本实验操作技能，提高实验的综合设计、分析能力。
二、实验教学的基本要求
原代细胞制备技术和细胞传代技术：了解细胞的保存方法；病毒鉴定技术：掌握血凝和血凝抑制试验鉴定病毒的原理，细胞病变的判断方法；鸡胚培养方法和鸡胚不同途径接种方法：掌握尿囊腔接种和尿液收获方法。
每组4人。
三、实验教材
卫生部规划教材《病毒学检验》第一版（李洪源主编，北京：人民卫生出版社，2006年）。
四、实验考核
实验成绩：实验教学过程成绩、实验报告成绩和操作考试分别占30%、30%和40%。
五、实验项目表。
第5章病毒检验基本技术
第5章病毒检验基本技术第五章病毒检验基本技术一、标本的采集、处理与运送根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。
病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲亚砜（DMSO）并防止反复冻融使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。
二、病毒的培养条件实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞都可以作为人工增殖病毒的基本工具。
而大量病毒的培养，又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断试剂的先决条件。
1、组织培养病毒在细胞内的增殖及其对细胞的作用，可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象以及通过对“指示病毒”的干扰等方法加以识别。
组织培养用的玻璃器皿要求比较严格，要用硫酸和重铬酸钾溶液浸泡后再清洗应用。
常用于组织培养的人工综合营养液的主要成分有氨基酸、糖类、无机盐、维生素和辅助生长因子等，常用的人工综合营养液为MEM何RPM I 1640.用人工综合营养液配制细胞生长液时需要加入适量血清和谷氨酰胺溶液，还需要加入规定量的抗生素溶液防止细菌污染，加入碳酸氢钠溶液修正pH，根据情况还可加入HEPES溶液可使生长液具有较强的pH缓冲能力。
能使组织和成片细胞分散成单个细胞的化学制剂为胰蛋白酶和EDTA，EDTA使用液又可称之为Versen 溶液，其分散细胞的作用原理是EDTA可以结合钙、镁离子，使组织细胞分散。
动物血清中具有细胞生长所必需的各种营养因子，它能促进细胞的贴壁和生长，具有很强的酸碱缓冲能力。
细胞培养液在细胞培养过程中可分为细胞生长液和细胞维持液两种。
生长液是使细胞发育增殖的液体，因此要求营养条件丰厚；维持液用于延缓细胞代谢，从而延长细胞的存活时间，以利于实验的进行。
这两种液体成分的主要区别是血清含量不同。
第十七章病毒检验技术
葡萄状
一、形态学检查及诊断
*2包．涵中体和试狂验犬（病N毒t）感染---1---.嗜组酸织性包细涵胞体 培养
第二节 病毒的分离与鉴定
病毒感染细胞后，可使细胞的代谢发生变化，导致培养液pH值改变。
采集时间：发病早期或急性期尽快采集。
是指某些病毒特别是无包膜的病毒感染组织细胞后，正常生长的梭形细胞变圆、变性、坏死、溶解及从培养瓶壁脱落，细胞堆积形成
第二节 病毒的分离与鉴定
1．细胞形态的改变
（3）包涵体
某些病毒感染宿主细胞后， 细胞内出现一种光学显微镜下 可见的蛋白质结构，多为圆形、 卵圆形或不定形。一般是由完 整的病毒颗粒或尚未装配的病 毒亚基聚集而成，称为包涵体。
第二节 病毒的分离与鉴定
二、病毒增殖的观察
2．红细胞吸附
3．细胞培养液pH值改变 病毒感染细胞后，可使细胞的代谢发生变化，导致培 养液pH值改变。
用于观察病毒和细菌表面结构和附属结构等一形态学检查及诊断扫描电子显微镜第三节病毒学检测及诊断h1n1流感病毒电子显微镜图片狂犬病病毒电子显微镜图片第三节病毒学检测及诊断1标本制备超滤法超速离心法接种细胞快速增殖法免疫凝集法2常用观察方法负染色法超薄切片法免疫电镜法病毒颗粒具有亮度在周围较暗的背景上显示亮点过程与病理切片过程相似免疫组织化学与电镜技术的结合透射电子显微镜第三节病毒学检测及诊断二血清学检测及诊断原理
是指某些病毒特别是无包膜的病毒感染组织细胞后，正常生长的梭形细胞变圆、变性、坏死、溶解及从培养瓶壁脱落，细胞堆积形成
葡萄状
腔
一、形态学检查及诊断
尿囊腔接种 羊膜腔接种 常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒
病毒液中若先加入病毒的特异性抗体，抗体与病毒表面的抗原特异性结合，从而抑制病毒与红细胞的血凝现象，称为血凝抑制试验。
病毒学检验
绪论◼ 病毒 是一类光学显微镜下不可见，专性细胞内寄生的非细胞型微生物。
特点：①极小（10~300 nm ）；②能与细胞受体结合；③酶系统缺失或不全；④离体条件下以无生命的大分子形式存在；⑤通过复制进行增殖。
形态：多数呈球状或近似球状，少数为杆状、丝状、子弹状，细菌噬菌体呈蝌蚪状。
1. 病毒变异 包括遗传漂变和遗传转移。
◼ 遗传漂变由于基因组复制时发生碱基变异所导致，其引起的抗原变异，称为抗原漂变。
◼ 遗传转移 由于基因组重组（如片段交换）引起。
——快速变异（如流感病毒）第一章 细胞培养技术一、细胞培养技术◼ 细胞培养技术 是模拟体内生理环境条件，提供细胞适宜的营养和温度条件，在无菌操作的基础上，使立体组织细胞生长增殖并进行传代的技术。
1. 体外培养细胞的组织来源（1）胚胎或成体组织；（2）正常或肿瘤组织2. 体外培养细胞的生物学特性（1）细胞异质性：来源于同一组织或不同组织的细胞之间均存在差异。
（2）细胞的增殖与分化（3）细胞生长特征与形态形态贴壁依赖性，分为上皮样细胞型（呈不规则多角形）、成纤维细胞型（梭形三角形） 生长接触性抑制→单层生长；密度抑制→停止生长贴壁过程：重力作用→细胞下沉至瓶底→分泌细胞外基质和黏附分子→贴壁适合于大规模细胞培养，便于细胞传代3. 体外细胞培养生长增殖过程（1）细胞周期：G 1期（DNA 合成前期）→S 期（DNA 合成期）→G 2期（分裂前期）→M 期（分裂前期）（2）细胞一代周期：两次传代接种间隔的时间，分为迟缓期、对数期、平衡期和衰亡期。
根据贴壁状况、细胞界限、折光率、胞内颗粒来判断。
（3）细胞的生命周期原代培养期：从初次培养到第一次传代培养。
异质性→单一性传代培养期：中间衰亡期：出现细胞凋亡，即细胞程序性死亡。
4. 体外培养细胞的基本条件（1）细胞接种——对数期的细胞（2）营养物质——天然营养液、合成培养基①天然培养液——主要为血清（血浆去除纤维蛋白）作用：提供基本营养与结合蛋白；提供激素及各类生长因子；提供促进细胞壁的蛋白；提供抗损害的保护性物质；提供蛋白酶抑制物质；提供pH 缓冲物质。
临床微生物学检验（理论）病毒总论重点整理
临床微生物学检验（理论）病毒总论重点整理病毒的生物学性状病毒（virus）：最微小的、结构最简单的非细胞型微生物。
特征体积非常微小，必须用电子显微镜放大几万至几十万倍后方可观察；结构简单，无完整细胞结构，仅有一种核酸（RNA或DNA）；严格的细胞内寄生性，只能在一定种类的活细胞中增殖；对抗生素不敏感，但对干扰素敏感。
第一节病毒的大小与形态病毒体（virion）：完整成熟的病毒颗粒。
①大小：nm，比细菌小的多，细菌的测量单位是μm。
②形态：球形、杆形（丝形）、弹性、砖形、蝌蚪状，多数呈球形的。
第二节病毒的结构与化学组成病毒的基本结构有核心和衣壳，二者构成核衣壳。
有的病毒核衣壳外有包膜和刺突，有的没有。
根据包膜有无可分为：裸病毒（naked virus）、包膜病毒（enveloped virus）1、病毒核心：成分为核酸，病毒基因组，控制病毒的遗传性状。
2、病毒衣壳：包绕在核酸外面的蛋白质外壳。
具有抗原性，可以刺激机体发生免疫应答；具有保护核酸免受外界环境的破坏，比如核酸酶等；介导病毒进入宿主细胞。
根据壳粒排列方式不同，病毒有三种对称型：螺旋对称、二十面体立体对称、复合对称①螺旋对称：有些病毒粒子呈杆状或丝状，其衣壳形似一中空柱，电镜观察可见其表面有精细螺旋结构。
在螺旋对称衣壳中，病毒核酸以多个弱键与蛋白质亚基相结合，能够控制螺旋排列的形式及衣壳长度，核酸与衣壳的结合也增加了衣壳结构的稳定性。
烟草花叶病毒(TMV)是螺旋对称的典型代表。
②20面体立体对称：有些病毒的外形呈“球状”，实际上是一个立体对称的多面体，一般为二十面体。
它由20个等边三角形组成，具有12个顶角，20个面和30条棱。
腺病毒是二十面体对称的典型代表。
二十面体病毒有的也具有包膜。
③复合对称：两种对称方式同时存在：T噬菌体，头部呈立体对称（二十面体），尾部为螺旋对称。
逆转录病毒内部是螺旋形的核心，外部是二十面体的外壳，是复合对称型病毒。
临床医学检验临床微生物：病毒学总论必看题库知识点四
临床医学检验临床微生物：病毒学总论必看题库知识点四1、单选在组织培养中识别病毒的方法不包括下列哪一种（）A.观察细胞病变B.空斑试验C.中和试验D.比浊度E.底物显色正确答案：D2、单选口蹄疫病毒（江南博哥）除感染偶蹄类动物外，还可以感染下列哪些种类（）A.家畜B.啮齿类动物C.节肢动物D.人和非偶蹄类动物E.鸟类正确答案：D3、单选病毒标本长期保存的存放温度是（）A.4℃B.0℃C.－20℃D.－70℃E.－196℃正确答案：D4、单选甲型肝炎实验室诊断方法主要依赖于检测患者血清中的下列哪一种成分（）A.抗HAV的IgAB.抗HAV的IgGC.抗HAV的IgMD.抗HAV的IgDE.抗HAV的IgE正确答案：C5、单选外毒素的特点之一是（）A.多由革兰阴性菌产生B.多为细菌裂解后释放C.化学组成是脂多糖D.可制备成类毒素E.耐热正确答案：D6、单选目前我国所使用的流行性出血热的疫苗是下列哪一种（）A.减毒活疫苗B.细胞培养灭活疫苗C.羊脑组织疫苗D.鸡胚细胞疫苗E .二倍体细胞疫苗正确答案：B7、单选不属于病毒分离培养的传代细胞系是（）A.FLB.HeLaC.Hep－2D.VeroE.WI－38 正确答案：E8、单选不属于病毒核酸检测的PCR技术的是（）A.PCR－DNAB.HPLCC.定量PCRD.RT－PCRE.巢式PCR正确答案：B9、单选流行性出血热双价苗是指下列哪一种疫苗（）A.灭活和非灭活混合疫苗B.两种细胞混合培养疫苗C.两种组织混合培养疫苗D.两种疫苗合并应用E.家鼠型和野鼠型混合疫苗正确答案：E10、单选埃博拉病毒的名称是根据下列哪一个由来而得名的（）A.最初分离到病毒的人的姓名B.最初发现本病的人的姓名C.病毒最初流行的地名D.第一例病人姓名E.根据病毒命名原则得来正确答案：C11、单选流感病毒的快速诊断主要依赖于下列哪一种方法（）A.检查特异性IgM抗体B.检查抗核蛋白抗体C.检查抗病毒血凝素抗体D.直接查病原E.检查抗病毒聚合酶抗体正确答案：B12、单选关于内毒素，下列叙述错误的是（）A.来源于革兰阴性菌B.其化学成分是脂多糖C.性质稳定，耐热D.菌体死亡裂解后释放出来E.能用甲醛脱毒制成类毒素正确答案：E13、单选使大多数病毒比较稳定的条件是（）A.pH5.0以下B.pH9.0以上C.pH5～9D.37℃E.56℃正确答案：C14、单选根据流感病毒核蛋白抗原性的不同，流感病毒又可分为几型（）A.1型B.2型C.3型D.4型E.5型正确答案：C15、单选下列关于病毒错误的是（）A.由单一核酸和蛋白外壳组成B.属于原核细胞型微生物C.体积微小D.只能在活的细胞内生长繁殖E.能通过滤菌器正确答案：B16、单选被灭活的病毒不能保留的特性是（）A.抗原性B.红细胞吸附性C.感染性D.血凝性E.细胞融合正确答案：C17、单选流感病毒易发生抗原变异的主要原因是下列哪一点（）A.流感病毒核蛋白变异性很强B.流感病毒血凝素变异性很强C.流感病毒基质蛋白变异性很强D.流感病毒聚合酶变异性很强E.流感病毒非结构蛋白变异性很强正确答案：B18、多选病毒抗原检测技术包括（）A.细胞培养B.免疫荧光C.酶免疫D.发光免疫分析E.免疫层析正确答案：B, C, D, E19、单选血清中HBV－DNA聚合酶的存在，表明HBV的感染处于下列哪一时期（）A.病毒血症期B.病毒活动复制期C.病毒血症前期D.病毒血症后期E.病毒血消退期正确答案：B20、单选以下技术用于病毒感染的快速诊断，除外是（）A.形态学检查B.病毒抗原检测C.早期抗体检测D.晚期抗体检测E.病毒核酸检测正确答案：D21、单选含病毒标本冻存时应加入的保护剂是（）A.叠氮钠B.二甲基亚砜C.丁二酮D.对氨基苯甲醛E.硝酸甘油正确答案：B22、单选EBV除引起人类皮肤和黏膜的疱疹样病变外，还与下列哪一类疾病密切相关（）A.人类皮肤癌B.人类鼻咽癌C.人类色素细胞癌D.肺癌E.胃癌正确答案：B23、单选采集流感患者的咽漱液后，分离病毒最合适的接种法是（）A.人胚羊膜细胞B.小鼠腹腔C.鸡胚羊膜腔D.鸡胚尿囊腔E .鸡胚卵黄囊正确答案：C24、单选用于流感病毒分离与鉴定的标本应取自患者哪个部位（）A.血清B.鼻咽分泌物C.唾液D.黏膜渗出液E.排泄物正确答案：B25、单选逆转录病毒科最基本的特征是在生命过程活动中有下列哪一个复制过程（）A.DNA到蛋白质B.RNA到蛋白质C.DNA到RNAD.RNA到EDNAE.RNA到DNA 正确答案：E26、单选分离柯萨奇病毒和ECHO病毒最好接种的动物是（）A.乳鼠B.小鼠C.家兔D.豚鼠E.猴正确答案：A27、单选下列哪些方法适用于病毒的分离（）A.细胞或动物接种和传代B.超速离心C.透析D.过滤E.亲和层析正确答案：A28、单选为有效预防流行性出血热，我国相应地研制了不同型别的流行性出血热细胞培养灭活疫苗，并在实际应用中证实有效。
病毒学检验期末总结
1.病毒学检验:是从维护公众健康的角度,以医学病毒学和流行病学为基础,借助免疫学,现代分子生物学和其他分析技术,对临床和流行病学现场的标本(如人或宿主动物的血液,尿,粪便,组织液和组织等)进行检测,确定感染的病毒种类及数量,追溯病毒的来源,监测和预测病毒的变迁,为人群中病毒性疾病的预防和控制提供技术支撑的一门学科2.病毒:是一种普通光学显微镜下不可见的,专性细胞内寄生的非细胞型微生物3.核酸杂交技术:是现代分子生物学的重要方法之一,是用特定标记已知核酸序列与待测核算进行特异性的杂交结合,形成杂交体,并利用相应的显示技术来检测目标核酸的存在及其位置的分子生物学方法4.细胞培养技术:是模拟体内生理环境条件,提供细胞适宜的营养和温度条件,在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术5.原代细胞:将动物或人的胎儿组织经剪碎,酶消化,稀释计数,加营养液,37o C培养1-2天后形成的单层细胞或悬浮细胞6.传代细胞:原代细胞培养过程中,在大多数细胞退化时,少数细胞又能长期传下去,这种能在培养容器内连续多次传代培养的细胞叫～7.细胞系:原代培养物经过传代培养获得的一群细胞,包含有多种细胞成分,根据其生存期分为有限细胞系和无限细胞系8.细胞株:从原代培养物或细胞系中获得的遗传,生化特征和相同的细胞群9.细胞病变效应:大多数病毒感染敏感细胞,在细胞内增殖并与之相互作用后,会引起受感染细胞发生聚集,脱落,融合,形成包涵体,甚至损伤,死亡,可在低倍显微镜下直接观察,这些特征为～10.变性:指核酸双螺旋去的氢键断裂,变成单链,并不涉及共价键的断裂11.复性:变性DNA在适当的条件下,两条彼此分开的链又重新缔合形成双螺旋结构的过程12.熔点/溶解温度(Tm)通常吧DNA的双螺旋结构失去一半是的温度称为该DNA的～13.核酸杂交:互补的核苷酸序列通过碱基配对形成非共价键,从而形成稳定的同源或异源双链分子的过程14.核酸探针:指以研究和诊断为目的,用来检测特定序列的核酸的DNA或rna片段15.探针:指溶液中的标记分子,能喝微阵列基片上的互补靶标分子发生反应16.southern印迹:将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物上,即～17.northern印迹:将rna 样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,再转移到固相支持物上,用同位素或生物素标记的核酸探针对固定于膜上的rna进行杂交,将具有阳性标记的分子位置与标准对照的相对分子量进行比较获得来自一个样品的rna种类的数目,分子大小及丰度等信息18.斑点杂交:先将提取的核酸或浓缩标本直接滴于硝酸纤维素膜或尼龙膜等固相支持物上,核酸经变性处理后80o C烘烤2小时,使其固定于膜上,再与探针进行杂交19.聚合酶链反应:体外酶促扩增核酸序列的技术,20.巢式pcr:一种变异的聚合酶链反应,使用两对pcr引物扩增完整的片段21.多重pcr:在同一pcr反应体系里加上两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的pcr反应22.基因芯片:又称DNA芯片,专门用于核酸检测的生物芯片23.基因:可以转录成rna的基因组片段24.基因组:指生物体的细胞中一套完整的遗传信息,对于真核生物通常以核内单倍数染色体包含的所有基因为一个基因组25.病毒基因型:根据同种病毒基因序列差异的程度不同,可被分为一个或多个型别,即~26.免疫荧光技术:在免疫学,生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术,既有免疫学反应的特异性和敏感性,又有显微镜技术精确性和直观性的优点27.酶免疫技术:将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性结合的一种免疫检测技术28.中和试验:在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物,使病毒与抗体相互反应,再将混合物接种到敏感的宿主体内,然后测定残存病毒感染力的一种方法29.血凝单位:以出现“＋＋”的稀释度的倒数为判定终点称为一个血凝单位。
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病毒的特点：
1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。
2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质
3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA）
4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸
5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒
6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性
7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力
8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染
体外细胞培养的基本条件：
1、条件要求高，培养液组分复杂，需要添加血清才能满足生长需要
2、避免微生物污染，需要在培养液中加入抗生素。
3、体外细胞培养的基本要求主要包括细胞接种（尽量选择对数期细胞接种）、
4、培养液营养成分、
5、酸碱度（能耐受的ph范围为6.6-7.8，依靠缓冲系统调节）、
6、气体条件（细胞生长需要CO2 ，大规模培养需要有足够的氧气）、
7、温度（最适温度为35-37。
C）、
8、水的纯度（一般要求去离子水或三蒸水）、
9、无菌条件等
实验动物的微生物控制分类：
1、普通动物，一级动物，要求不携带动物烈性传染病和人兽共患病病原
2、清洁动物，二级动物，在一级动物要求上，不携带对动物危害大、对实验干扰大的
病原体，外观健康，主要器官不得有组织病理学病变
3、无特定病原体动物，三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带病原体外，还要求
排除潜在感染或条件致病菌的感染
4、无菌动物，四级动物，要求在体内外不得检出其它生命体
实验动物的遗传学分类
1、近交系，指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系
2、封闭系，不从外界引入新的血缘，非近亲交配方式的实验动物群体
3、突变系，由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状的动物
4、杂交群动物，由不同品系杂交所产生的后代
5、转基因动物，插入外源基因后能正常繁殖的动物
大鼠、小鼠的采血方法
1、剪尾采血，动物麻醉后，将尾端剪去约5mm，待血液流出采集，小鼠可每次采血
0.1ml，大鼠约0.4ml
2、眼眶后静脉丛采血，拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤固定，轻轻压迫颈部两侧，
使眼球充分外凸。
采血管插入眼角与眼球之间，向眼底方向刺入，切开静脉丛，血流即流入取血管。
3、颈（股）动脉或颈（股）静脉采血，麻醉动物，剪去被毛，作颈静脉或劲动脉分离
术后采血
4、摘眼球采血，采血时，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球凸出，右手用弯头
镊子摘除眼球，迅速采集血液
病毒的纯化方法：
一般原则释放病毒至细胞外、去除细胞碎块、病毒悬液浓缩
1、PEG浓缩法，包括直接加入法、液体浓缩法、固体浓缩法
2、超过滤法
3、吸附法，有凝胶吸附法、红细胞吸附法
4、超速离心法
中和试验及其应用
是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。
通常以100TCID50/单位体积或100LD50/单位体积作为标准的病毒试验浓度
1、鉴定病毒、
2、分析病毒抗原的性质、
3、测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果、
4、测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病
鸡胚培养的优缺点
优点
1、组织分化程度低，病毒易于繁殖
2、来源充足，其本身很少携带病毒和细菌，敏感范围广，对接种的病毒不产生抗
体
3、有神经血管的分布和脏器的构造
缺点
1、与除引起鸡胚死亡的病毒及产生痘疱的病毒外，通常不产生特异性的感染指
症，必须通过另外的实验来证明病毒的存在
2、鸡食入的抗生素会使某些病原体的繁殖收到抑制
3、某些细菌和病毒能够从感染的鸡传递到鸡胚
PCR（聚合酶链反应）基本反应体系和步骤
反应体系：需要扩增的模板、与DNA靶序列3’末端互补的合成引物、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸dNTP、耐热DNA聚合酶、合适的缓冲液体系。
基本步骤与反应：
1、变性，将反应体系混合物加热至94⁰C，维持约30~60秒，使待测双链DNA变性解链为单链模板。
2、2、退火，冷却至特定的温度（引物的Tm值左右，一般为45~65⁰C），一对寡糖核苷酸引物分别与正、负单链DNA序列两端互补结合。
3、延伸，将温度提高至72⁰C并维持一段时间，引物在聚合酶作用下，以3´端为起点，4种dNTP为原料，按碱基配对原则，沿5´→3´方向延伸，合成两条新DNA链。
基因克隆以及基本步骤：
利用酶将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割、重组连接、组成新的DNA 重组子，导入宿主细胞，随着宿主细胞的繁殖从而得到大量自带DNA重组子或其表达产物。
基本步骤：
1、分离或合成目的基因
2、将目的基因在体外插入载体形成重组DNA
3、将重组DNA导入宿主细胞
4、重组体的筛选、鉴定和分析
乙肝病人血清学检测的五项指标：
HBsAg（表面抗原）、抗-HBs（表面抗体）、抗-HBc（核心抗体）、HBeAg（e抗原）、抗-HBe（e抗体）
乙肝病毒血清学检查三种主要抗体及其意义
1、抗-HBe一般存在于无症状HBV携带者及活动期慢性肝炎患者中。
2、抗-HBs：是HBsAg刺激机体产生的特异性中和抗体，是保护性抗体。
阳性表明机体已经产生免疫力
3、抗-HBc：包括抗-HBcIgM、抗-HbcIgG，前者是急性感染的重要指标，也是慢性活动肝炎的重要标志。
阳性主要见于乙肝恢复期，慢性感染和既往感染。
空斑形成单位（PFUs）试验：是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度。
凡是能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。
50%终点法：是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。
ID50：即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量
CCID50：造成50%细胞培养产生病变效应的剂量
LD50：为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量
血凝试验（HA）：有些病毒和病毒表面的血凝素能引起人或某些哺乳动物的红细胞发生凝集，这就是所谓的红细胞凝集现象。
当病毒数与红细胞数比值足够大时，病毒会与红细胞结合成网状，造成悬浮液沉淀或凝集
血凝滴度HT：将红细胞与一系列病毒稀释液混合。
造成凝血的最高稀释倍数即为血凝滴度
电镜分辨率：是指分清楚两个点或两条线中心之间的最小距离的能力
负染色技术：高密度物质如重金属磷钨酸、醋酸铀等在透射电镜下形成黑色的背景反衬低密度的标本，从而清楚的显示出被衬物的细节结构
质粒：是存在于细菌染色体之外的、可自主复制的双链环状DNA，几乎完全裸露，易于分离纯化。
核酸杂交技术：用特定标记的已知核酸序列与待测核酸进行特异性结合，形成杂交体，并体用相应的显示技术检测目标核酸的存在及其位置。
Southern印迹杂交：一是将待测定核酸DNA分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
步骤包括：1、待测核酸样品的制备与限制酶消化2、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品3、电泳凝胶的预处理4、转膜5、探针标记6、预杂交与southern杂交7、洗膜8、放射性自显影检测。
Nouthern印迹杂交：将RNA样品通过琼脂凝胶电泳进行分离，再转移到固相支持物上，用探针对其进行杂交，将具有阳性的位置与标准相对分子质量进行比较可得到RNA种类的数目、分子大小及丰度等信息。
Ct值：值每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct 值与其起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
核酸探针：是指以研究和诊断为目的，带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，用来检测特定序列核酸的DNA或RNA片段。
Tm值：Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
CPE细胞病变效应：是病毒或接种分离标本后。
细胞出现的病理性变化。
不同的病毒可引起不同的细胞病变效应。
干扰现象interference phenomenon：一种病毒感染细胞后，可以干扰另一种病毒在细胞内的增值。
复性：变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的链又可重新结合成为双螺旋结构，这个过程称为复性。
方法是缓慢冷却。