PCR技术原理简介ppt课件
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PCR ）：简称PCR技术，是一种体外扩增特异性DNA 片段的技术，其基本工作原理是以拟扩增的DNA分子 为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为 引物，在DNA聚合酶的作用下，通过变性-复性-延 伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板大量扩增。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
4
基本原理
变性(denaturation):通过加热使DNA双螺旋氢
浓度过高可加速反应速度，同时增加碱基的掺入率和实验 成本，浓度过低又会降低反应速度，但可提高实验的精准 性。
18
反应体系
（四）模板（靶基因，target gene）
PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为模板用 于PCR反应。但为了保证反应的特异性，一般还宜用微 克水平的基因组DNA或104拷贝的扩增片段作为起始材料。
……
……
30
230
n
2n
10
二、PCR反应体系
反应体系
PCR反应五要素：
特异性寡核苷酸引物（Primer） 耐热DNA聚合酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） DNA模板（Template） 反应缓冲液（Reaction buffer）
及Mg2+存在的条件下，5’ 3’的聚合酶催化以引物为起始 点的DNA链延伸反应。
7
PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
基本原理
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
8
1个 PCR 循环完成后得到2个拷贝的靶序列
基本原理
9
n次循环后靶序列扩增的数量为2n
基本原理
循环次数 DNA扩增数
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物 量减少。
Taq DNA聚合酶具有5’ 3’聚合酶活性和5’ 3’外切酶 活性，而无3’ 5’外切活性，因而没有校正功能，碱基 配错率为2.1 ×10-4 。
17
反应体系
（三）dNTP
在PCR反应中，dNTP应为 50～200umol/L，尤其是注意4种 dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓 度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。
11
反应体系
（一）寡核苷酸引物
引物是PCR特异性反应的关键； PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度； 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设
计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在 体外大量扩增。
12
反应体系
引物设计的原则：
1. 引物应在核酸序列保守区内设计并具有特异性：引物与非 特异性扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补 碱基同源。
键断裂，双链解离成单链DNA 模板
模板
5
基本原理
退火（annealing）:当温度降低时由于模板分子结
构较引物复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于 模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而 模板DNA双链之间互补的机会较少
6
基本原理
延伸(extension):在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核酸底物
2. 产物不能形成二级结构：某些引物无效的主要原因是扩 增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二 级结构区域。
3. 引物长度一般为 15-30bp左右。引物的有效长度不能大于 38 ，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温 度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性。引物过短 也会使特异性降低。
13
反应体系
引物设计的原则：
4. 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果 不佳， G+C 过多易出现非特异条带。四种碱基分布最好 是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
5. Tm值最好接近72℃：以使复性条件最佳。Tm一般低于 有效启动温度5~10℃，也可按公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 估计Tm值。
16
反应体系
（二）耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌yT1株分离提取的， Taq DNA聚合酶它的最适反应温度在75℃左右，在 95℃的高温具有良好的热稳定性。
在100ul PCR反应体系中。一般约需加入酶量 2-4U， 足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的速度。
19
（五）反应缓冲液
反应体系
PCR缓冲液为反应提供所必须的合适的酸碱度和某些离子， 目前最常用的缓冲液是10-50mmol/L的Tris-HCl。
Tris-HCl
10-25mmol/L
KCl
50mmol/L
MgCl2
1.5mmol/L
明胶或牛血清白蛋白 100ug/ml
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高反应特异性降低，出 现非特异扩增； 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性， 使反应产物减少。
2013/3/21
1
PCR是由美国科学家Kary B. Mullis 提出的一种体外简化 条件下模拟DNA体内复制的 DNA快速扩增的方法，获得 1993年诺贝尔化学奖。
2
目录
1 2 3 4
基本原理 PCR反应体系 实验流程 PCR的应用
3
一、基本原理
基本原理
聚合酶链反应（ polymerase chain reaction ，
6. 碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，尤其 是3’端不应超过3个连续的G或C。
7. 引物自身不能有连续4个碱基互补，否则引物自身会折 叠成发夹结构影响引物本身复性。
14
反应体系
引物设计的原则：
8. 引物之间不能有连续4个碱基互补，避免两条引 物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物 二聚体，产生非特异性的扩增条带。
9. 引物的延伸从3’端开始，3’端不可修饰，而 引物5’端可以修饰，如加酶切位点、标记生物 素、引入突变位点等。
10.引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及 倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导 致PCR失败。切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好
处
15
反应体系
引物量：
PCR反应中引物的浓度一般为0.2 ~ 1umol，以最低引物 量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和 非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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基本原理
变性(denaturation):通过加热使DNA双螺旋氢
浓度过高可加速反应速度，同时增加碱基的掺入率和实验 成本，浓度过低又会降低反应速度，但可提高实验的精准 性。
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反应体系
（四）模板（靶基因，target gene）
PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为模板用 于PCR反应。但为了保证反应的特异性，一般还宜用微 克水平的基因组DNA或104拷贝的扩增片段作为起始材料。
……
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二、PCR反应体系
反应体系
PCR反应五要素：
特异性寡核苷酸引物（Primer） 耐热DNA聚合酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） DNA模板（Template） 反应缓冲液（Reaction buffer）
及Mg2+存在的条件下，5’ 3’的聚合酶催化以引物为起始 点的DNA链延伸反应。
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PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
基本原理
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
8
1个 PCR 循环完成后得到2个拷贝的靶序列
基本原理
9
n次循环后靶序列扩增的数量为2n
基本原理
循环次数 DNA扩增数
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浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物 量减少。
Taq DNA聚合酶具有5’ 3’聚合酶活性和5’ 3’外切酶 活性，而无3’ 5’外切活性，因而没有校正功能，碱基 配错率为2.1 ×10-4 。
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反应体系
（三）dNTP
在PCR反应中，dNTP应为 50～200umol/L，尤其是注意4种 dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓 度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。
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反应体系
（一）寡核苷酸引物
引物是PCR特异性反应的关键； PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度； 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设
计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在 体外大量扩增。
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反应体系
引物设计的原则：
1. 引物应在核酸序列保守区内设计并具有特异性：引物与非 特异性扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补 碱基同源。
键断裂，双链解离成单链DNA 模板
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基本原理
退火（annealing）:当温度降低时由于模板分子结
构较引物复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于 模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而 模板DNA双链之间互补的机会较少
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基本原理
延伸(extension):在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核酸底物
2. 产物不能形成二级结构：某些引物无效的主要原因是扩 增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二 级结构区域。
3. 引物长度一般为 15-30bp左右。引物的有效长度不能大于 38 ，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温 度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性。引物过短 也会使特异性降低。
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反应体系
引物设计的原则：
4. 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果 不佳， G+C 过多易出现非特异条带。四种碱基分布最好 是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
5. Tm值最好接近72℃：以使复性条件最佳。Tm一般低于 有效启动温度5~10℃，也可按公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 估计Tm值。
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反应体系
（二）耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌yT1株分离提取的， Taq DNA聚合酶它的最适反应温度在75℃左右，在 95℃的高温具有良好的热稳定性。
在100ul PCR反应体系中。一般约需加入酶量 2-4U， 足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的速度。
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（五）反应缓冲液
反应体系
PCR缓冲液为反应提供所必须的合适的酸碱度和某些离子， 目前最常用的缓冲液是10-50mmol/L的Tris-HCl。
Tris-HCl
10-25mmol/L
KCl
50mmol/L
MgCl2
1.5mmol/L
明胶或牛血清白蛋白 100ug/ml
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高反应特异性降低，出 现非特异扩增； 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性， 使反应产物减少。
2013/3/21
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PCR是由美国科学家Kary B. Mullis 提出的一种体外简化 条件下模拟DNA体内复制的 DNA快速扩增的方法，获得 1993年诺贝尔化学奖。
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目录
1 2 3 4
基本原理 PCR反应体系 实验流程 PCR的应用
3
一、基本原理
基本原理
聚合酶链反应（ polymerase chain reaction ，
6. 碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，尤其 是3’端不应超过3个连续的G或C。
7. 引物自身不能有连续4个碱基互补，否则引物自身会折 叠成发夹结构影响引物本身复性。
14
反应体系
引物设计的原则：
8. 引物之间不能有连续4个碱基互补，避免两条引 物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物 二聚体，产生非特异性的扩增条带。
9. 引物的延伸从3’端开始，3’端不可修饰，而 引物5’端可以修饰，如加酶切位点、标记生物 素、引入突变位点等。
10.引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及 倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导 致PCR失败。切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好
处
15
反应体系
引物量：
PCR反应中引物的浓度一般为0.2 ~ 1umol，以最低引物 量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和 非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会