超氧化物歧化酶活性的测定

合集下载

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法一、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)1、试剂的配制(1)L磷酸缓冲液(PBS,:A母液:L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O(分子量)71.7g;B母液:L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量)31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

L PBS()的配制:分别取A母液(Na2HPO4) ,B母液(NaH2PO4) ,用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000:267~268。

(2)甲硫氨酸溶液:取 Met用磷酸缓冲液()定容至1000ml。

(3)30μM EDTA-Na2溶液:取用磷酸缓冲液定容至100ml。

(4)60μM核黄素溶液:取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。

(5)氮蓝四唑(NBT)溶液:取 NBT用PBS定容至100ml,避光保存。

酶液制备:取(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液()在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,上清液即为酶液。

2、酶活性测定(1)反应混合液配制(以60个样为准):分别取Met溶液162ml,EDTA-Na2溶液,磷酸缓冲液,NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混合后摇匀;(2)分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中(3)将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min;同时做两支对照管,其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS(不加酶液)照光后测定作为最大光还原管,另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

(4)以不照光的对照管(只有缓冲液并置于暗处)调零后,避光测OD560(出现颜色即可测定)。

(5)酶活性计算:SOD活性单位以抑制NBT光化还原50%所需酶量(测的样品值要在最大管的一半左右才合适,否则要调整酶量)为1个酶活单位(u)。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法一、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)1、试剂的配制(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):A母液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O(分子量358.14)71.7g;B母液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量156.01)31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS(pH7.8)的配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml,B母液(NaH2PO4) 21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000:267~268。

(2)14.5mM甲硫氨酸溶液:取2.1637g Met用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至1000ml。

(3)30μM EDTA-Na2溶液:取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

(4)60μM核黄素溶液:取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。

(5)2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液:取0.1840g NBT用PBS定容至100ml,避光保存。

酶液制备:取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,上清液即为酶液。

2、酶活性测定(1)反应混合液配制(以60个样为准):分别取Met溶液162ml,EDTA-Na2溶液0.6ml,磷酸缓冲液5.4ml,NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混合后摇匀;(2)分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中(3)将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min;同时做两支对照管,其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS(不加酶液)照光后测定作为最大光还原管,另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

实验14 氮蓝四唑(NBT)法测定超氧物歧化酶(SOD)活力

实验14 氮蓝四唑(NBT)法测定超氧物歧化酶(SOD)活力

实验14 氮蓝四唑(NBT)法测定超氧物歧化酶(SOD)活力一、原理超氧物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。

而SOD可清除O2,从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂(一)材料;水稻或小麦叶片(二)仪器设备:1.高速台式离心机;2.分光光度计;3.微量进样器;4.荧光灯(反应试管处照度为4000Lx);5.试管或指形管数支。

(三)试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH7.8);2. 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液:称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml;3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液:称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存;4. 100μmol/L EDTA-Na2溶液:称取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml;5. 20μmol/L 核黄素溶液:称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml 避光保存。

三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉)0.5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml。

取 1.5~2ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液。

2. 显色反应取5ml指形管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液:试剂(酶)用量(ml)终浓度(比色时)0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met 溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA-Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.05, 2支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应10min-~20min(要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长)。

抗氧化酶活性测定方法

抗氧化酶活性测定方法

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。

其主要功能是清除体内的自由基,抑制过氧化物形成和脂质氧化反应,从而保护细胞免受氧化应激的伤害。

测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平,为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。

本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。

1.超氧化物歧化酶(SOD)活性测定方法:SOD能够催化超氧阴离子(O2-)的还原反应,将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。

常见的SOD活性测定方法有:-标准醛缩法:根据SOD催化的还原反应,利用NBT(硝基蓝盐)和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。

-自动化测定法:利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物,通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。

-XTT法和WST-1法:由于SOD具有还原型的性质,可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖(XTT)或水溶性四硝基噻唑盐(WST-1)的还原动力学来测定其活性。

2.过氧化氢酶(CAT)活性测定方法:CAT主要参与还原过氧化氢(H2O2),将其转化为氧和水。

常见的CAT活性测定方法有:-色素法:利用黄曲霉素作为还原剂,观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。

-光度法:通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。

-氧化还原电极法:通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。

3.过氧化物酶(POD)活性测定方法:POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应,转化为过氧化物(ROO-)。

常见的POD活性测定方法有:-色谱法:利用酚类底物的氧化反应,测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。

-酶标法:POD催化氧化反应会形成有色产物,通过测定产物的吸光度来测定POD活性。

4.谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性测定方法:GPx主要参与还原过氧化物,将其转化为相对稳定的醇和水。

常见的GPx活性测定方法有:-碳酸盐法:根据GPx还原底物中的碳酸盐,观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。

4氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力

4氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力

氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力一、原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基,超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。

而SOD可清除超氧阴离子自由基,从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂(一)材料:植物叶片。

(二)仪器设备:高速台式离心机,分光光度计,微量进样器,荧光灯(反应试管处照度为4000lx),试管或指形管数支,黑色硬纸套。

(三)试剂(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)。

[0.2M的Na2HPO491.5mL和NaH2PO48.5mL混合后稀释4倍]or[0.05mol/L PBS缓冲液(pH7.8):7.1g/L ,6.8g/LKH2PO4,按体积9:1混合,如pH高或低于7.8,则用KH2PO4或Na2HPO4调节。

每1000mL缓冲液含8gNaCl,0.2gKCl] 提取介质:内含1%聚乙烯吡咯烷酮的上述缓冲液。

(2)130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。

(3)750µmol/L氮蓝四唑溶液(NBT):称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。

(4)100µmol/L EDTA-Na2溶液:称取0.03721g EDTA-Na2,用磷酸缓冲液定容至1000ml。

(5)20 µmol/L核黄素溶液:称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml,避光保存,现用现配。

超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳

超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳

超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳实验⼆猪⾎中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳⼀、实验原理超氧化物岐化酶SOD⼴泛存在于⽣物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的⾦属类酶。

它作为⽣物体内重要的⾃由基清除剂,可以清除体内多余的超氧阴离⼦,在防御⽣物体氧化损伤⽅⾯起着重要作⽤。

SOD是⼀种酸性蛋⽩,对热、pH和蛋⽩酶的⽔解较⼀般酶稳定。

根据⾦属辅基的不同,它可以分为四类,分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD,其中最常见是(CuZn-SOD),主要存在于真核细胞的细胞质中。

CuZn-S0D酶蛋⽩的分⼦量约为3.2×104,每个酶分⼦由2个亚基通过⾮共价键的疏⽔基相互作⽤缔合成⼆聚体,每个亚基(肽链)含有铜、锌原⼦各⼀个,活性中⼼的核⼼是铜。

SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之⼀,可以直接清除过量的超氧⾃由基,阻⽌机体的过氧化,对机体有较⾼的防护作⽤及保健价值。

本实验采⽤有机溶剂沉淀法以新鲜猪⾎为原料,从中提取SOD硬进⾏纯化。

酶活⼒测定可⽤以下⽅法:黄嘌呤氧化酶法、细胞⾊素C法、肾上腺素⾃氧化法亚硝酸法、NBT光还原法、化学发光法以及邻苯三酚⾃氧化法等。

⽽该实验SOD酶活性采⽤邻苯三酚⾃氧化法测定。

酶活性单位定义为:在1ml的反应液中,每分钟抑制邻苯三酚⾃氧化速率达50%时的酶量定义为⼀个活⼒单位。

SOD同⼯酶奠定采⽤不连续聚丙烯酰胺-的作⽤,因此,电泳分离SOD后,凝凝胶电泳技术分离鉴定。

⽤“负”显⾊法显⽰。

由于SOD能够抑制O2胶上⽆SOD处显⽰为蓝⾊,⼜SOD处为⽆⾊透明,由此可以鉴定SOD同⼯酶酶谱。

⼆、实验试剂与器材ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%⼄醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L 邻苯三酚溶液等以及752分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离⼼机、烧杯、电泳装置、微量进样器、注射器等。

动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定

动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定

动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定原理超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase,简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

它作为生物体内重要的自由基清除剂,可以清除体内多余的超氧阴离子,在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

离子(02-)是人体氧代谢产物,它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病,超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。

由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用,SOD作为一种药用酶,具有广阔的应用前景,并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

按金属辅基成分的不同可分成3种类型。

最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD),主要存在于真核细胞的细胞质中,在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在,CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104,纯品呈蓝绿色,每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。

每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个,活性中心的核心是铜。

第二种含有锰离子(Mn-SOD),主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中,在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在,纯品呈粉红色,由4条或2条肽链组成。

第三种是Fe-S0D,过去一直认为只存在于原核细胞中,近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。

Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色,由2条肽链组成,多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。

l969年,McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。

自然界中SOD分布极广,其含量随生物体的不同而不同,即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位,其SOD的种类和含量也有很大差别。

迄今为止人们已从细菌,真菌、原生动物。

藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。

为拓宽提取SOD的原料,筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法一、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)1、试剂的配制(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):A母液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O(分子量358.14)71.7g;B母液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量156.01)31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS(pH7.8)的配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml,B母液(NaH2PO4) 21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。

加入10gPVP(聚乙烯吡咯烷酮)参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000:267~268。

(2)130mmol/L甲硫氨酸溶液:取1.399g Met用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至100ml。

网上说定容到100ML我也不懂。

拜托(3)100μmol/L EDTA-Na2溶液:取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml;(4)100μM核黄素溶液:取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml,避光保存,随用随配,并稀释10倍(5)750μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液:称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存;酶液制备:取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉)0.5g于预冷的研钵中,加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆,加缓冲液使终体积为10ml。

取5ml于10000r/min下离心10min,上清液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。

2、酶活性测定2.显色反应取试管(要求透明度好)5支,3支为样品测定管,1支为对照管,另外1支作为空白,按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处,其它各管于4000lx日光灯下反应20min(要求各管受光情况一致,反应室的温度高时时间可适当缩短,温度低时时间可适当延长)。

玉米超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活性测定

玉米超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活性测定

- · O2 -· O 2 + + 2H + H 2O 2 + O 2 SOD 玉米超氧化物歧化酶(SOD )的提取及活性测定一、目的1.通过对玉米超氧化物歧化酶(SOD )的提取及活性测定,掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质和超滤浓缩的方法和原理。

2.掌握测定超氧化物歧化酶(SOD )的活力和比活力的方法。

3.掌握分级盐析沉淀的方法和原理,以及透析的方法和原理。

二、原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ,简称SOD ),它广泛存在于各类生物体内,按其所含金属离子的不同,可分为3种:Cu,Zn-SOD ,Mn-SOD ,Fe-SOD 。

SOD 催化如下反应:在生物体内,它是一种重要的自由基清除剂,能治疗人类多种病症,如炎症、脑外伤、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老等,对生物体有保护作用。

在玉米中,SOD 主要存在于胚芽中,当将萌发的玉米籽粒打浆破碎后,以中性盐沉降其蛋白质部分,SOD 就存在于沉淀中,但其中有许多杂蛋白,因此在盐析时先用40%(NH 4)2SO 4去除杂蛋白部分,再用90%(NH 4)2SO 4饱和上清液,经过一定时间后,再将盐析液离心,取其沉淀进行透析,一定时间后,则其中的SOD 成分即被浓缩分离。

超滤也是一种蛋白质浓缩方法,其工作原理是运用液压迫使溶质透过膜,并按溶质分子量、形状、大小的差异,把大溶质分子阻留在膜的一侧,而小分子溶质则随溶剂透过膜到另一侧,使大小溶质分子得到分离。

利用此原理只要选择适当的超滤膜即可将玉米浆中SOD 与其它小分子杂蛋白、可溶性糖等分离,并去除水份,得到SOD 浓缩液。

SOD 活性的测定:采用NBT 光还原法。

其原理为核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O 2-,当加入NBT 后,在光照条件下,与超氧自由基反应生成单甲月替(黄色),既而还原成二甲月替(呈兰色)。

该产物在560nm 下有最大吸收峰。

当加入SOD 时,可以使超氧自由基与H +结合生成H 2O 2+O 2,从而抑制了NBT 光还原的进行,使兰色二甲月替 生成速度减慢。

氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力

氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力

氮蓝四唑(NBT )法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力一、 目的与要求SOD 在植物抗逆过程中发挥着重要的作用,通过本实验理解其抗逆机理,熟悉其操作步骤及其计算方法。

二、原理SOD 是普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT )在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2-,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm 处有最大吸收。

而SOD 可清除O 2-,从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。

一个酶活力单位定义为将NBT 的还原抑制到对照一半(50%)时所用的酶量。

222222SOD O H H O O -+−−−→+222222CAT H O H O O −−−→+三、材料、仪器设备及试剂(一)材料:水稻或小麦叶片(二)仪器设备:1.高速台式离心机;2.分光光度计;3.微量进样器;4.荧光灯(反应试管处照度为4000Lx );5.试管(三)试剂:1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH7.8: 0.2mol/L Na 2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L NaH 2P048.5 ml );2. 130mmol/L 甲硫氨酸(Met )溶液:称1.9397gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml ;3. 750μmol/L 氮蓝四唑溶液:称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ,避光保存;4. 100μmol/L EDTA -Na 2溶液:称取0.03721gEDTA -Na 2用磷酸缓冲液定容至1000ml ;5. 20μmol/L 核黄素溶液:称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至1000ml 避光保存。

四、实验步骤1. 酶液提取:取叶片0.5g 于预冷的研钵中,加2ml 预冷的PH 7.8的磷酸缓冲液,在研钵上研磨成匀浆,加缓冲液使终体积为10ml ,取5ml 于4度下4000rpm 离心15min ,上清液即为SOD 粗提液。

0101.超氧化物歧化酶(SOD)-NBT法--分光计

0101.超氧化物歧化酶(SOD)-NBT法--分光计

超氧化物歧化酶(SOD)-NBT法(酶标仪48T)(1)检测原理:超氧化物歧化酶(SOD)(EC 1.15.1.1)在动植物、微生物和培养细胞体内广泛存在,其具有抗衰老、提高机体对多种疾病的抵抗力,能增强机体对外界环境的适应力。

本实验是NBT法测定SOD活性,NBT可以和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XO)催化产生的超氧化物阴离子(O2.-)反应产生有颜色物质,后者在560nm处有吸收;SOD 可清除O2.-,从而抑制有色物质形成;反应液颜色越深,说明SOD活性愈低,反之活性越高。

1①组织样本:取约0.1g组织(水分充足的样本可取0.25g),加入1mL提取液,在4ºC或冰浴进行匀浆(或使用各类常见匀浆器)。

4ºC×12000rpm离心10min,取上清作为待测液。

【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取②细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞加入1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。

③液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。

2、上机检测①可见分光光度计预热30min以上,调节波长至560nm,蒸馏水调零。

②测定前将试剂一、三和四25℃水浴5min以上。

③试剂四每次加样前务必混匀,保证试剂的均一性。

④在1mL玻璃比色皿(光径1cm)中依次加入:【注】:1、若样本量较多,测定前可将试剂一、三和四按照240μL:60μL:320μL比例混成一个混合液(需依据当次检测的样本数量混合对应的试剂量),每管务必最后一步加620μL该混合液。

2、样本对照管*:提取后样本颜色较深的,一定要做此管,否则抑制率偏低,即SOD活性偏低。

超氧化物歧化酶活性的测定

超氧化物歧化酶活性的测定

超氧化物歧化酶活性的测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是生物体内一种重要的抗氧化酶,它能够将有害的超氧自由基(superoxide radical, O2•⁻)转化为氧和过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2),从而防止细胞和组织受到氧化应激的损伤。

因此,超氧化物歧化酶活性的测定对于研究氧化应激与各种疾病的关系具有极大的重要性。

超氧化物歧化酶活性的测定方法有多种,以下主要介绍两种常用的方法:一、停止法停止法测定超氧化物歧化酶活性的原理是,用发生超氧自由基的化学反应(如PMS-NADH系统)制造超氧气自由基以模拟体内超氧自由基的生成,观察并测定经超氧化物歧化酶处理后剩余的超氧自由基量的下降速率,通过计算算出SOD活性。

步骤:1、准备试剂:PMS(N-甲基-苯肼)溶液、NADH(辅酶Ⅰ)溶液、EDTA-Na2溶液、碳酸氢钠-硫酸溶液、紫外分光光度计。

2、制定反应液:取适量PMS溶液和NADH溶液加入缓冲液中,使最终浓度分别为100μM和780μM,混匀。

3、制备样品:用生理盐水或缓冲液将要测定的样品进行稀释,并在4℃下保存备用。

4、制备标准品:以SOD标准品(0-10U/mL)为浓度系列,每组分别加入50μL的样品和反应液,在37℃水浴中反应30min。

5、反应终止:以碳酸氢钠-硫酸溶液均匀混合停止反应。

6、测定吸光度:用紫外分光光度计测定反应液的吸光度,波长设置在340 nm。

7、计算超氧化物歧化酶活性:计算标准品的反应速率(Vx)和酶反应的反应速率(Vt),按照以下公式计算超氧化物歧化酶活性:SOD活性(U/mL)=(Vt–Vx)/Vx×标准品的酶活力二、降解法降解法测定超氧化物歧化酶活性的原理是,将超氧自由基产生物质注入试管中,随着时间的推移,样品中的超氧自由基将越来越少。

超氧气自由基和非酶物质将通过电子色谱法被检测和测量。

1、制备反应液:将样品加入含有相应浓度的降解剂中,使反应液中超氧气自由基的浓度达到稳定状态。

SOD测定方法

SOD测定方法

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,简称SOD)的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品(如生鱼片、动物血等初加工肉制品)、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。

超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶,测酶活方法很多,本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。

(一)氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下,核黄素受光激发,与电子供体反应被还原。

在氧气中,还原的核黄素与氧化反应产生,将无色(或微黄)的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭,SOD通过催化歧化反应,生成O2与H2O2,从而抑制蓝色形成。

按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。

酶活力越高,抑制50%蓝色形成所需酶量越少。

2. 仪器荧光灯管。

离心机。

分光光度计。

pH计。

3. 试剂(1)磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O),磷酸二氢钾(KH2PO4),甲硫氨酸(Met),氮蓝四唑(NBT),核黄素,乙二胺四乙酸(EDTA),以上试剂均为分析纯级;所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。

(2)pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液(于冰箱中保存)。

4. 测定步骤(1)酶液的制备:称取5~10g样品,加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液,缓冲液的量为所用样品的10倍以上,在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆,四层纱布过滤,滤液经4000r/min离心20min,取上清液用于酶活测定。

(2)酶反应酬体系液的制备:取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml,依次溶入Met,NBT,核黄素与EDTA,使它们的浓度分别为1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L,放冰箱中避光保存。

(3)测酶活在暗光下,取上述酶反应体系液3mL,移入试管中,试管放在一反应小室中,反应小室壁上贴锡箔纸,应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。

超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

超氧化物歧化酶(SOD)活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化,如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。

这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。

近来大量研究表明,植物在逆境胁迫或衰老过程中,细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。

过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用,造成细胞膜系统的损伤,严重时会导致植物细胞死亡。

自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。

生物体内产生的自由基主要有超氧自由基(O2.-)、羟自由基(OH.)、过氧自由基(ROD)、烷氧自由基(RO)等。

植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(ASA-POD)等是酶促防御系统的重要保护酶。

抗坏血酸(VC )、VE和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。

SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.-、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。

自1968年发现SOD后,立刻引起科学界的高度重视,近40年来这方面的研究进展非常迅速,它的应用领域日益拓宽,SOD也有了产品。

二十世纪80年代后期,我国关于SOD的研究及应用也形成了热点,如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

超氧自由基(O2.-)是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。

自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子,化学性质非常活泼,是活性氧的一种。

如果细胞中缺乏清除自由基的酶时,机体就会受到各种损伤。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase),简称SOD,能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基(O2.-),生成H2O2和O2。

H2O2由过氧化氢酶(CAT)催化生成H2O和O2,从而减少自由基对有机体的毒害。

一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化还原法测定SOD活力的方法和原理,并了解SOD的作用特性。

植物组织中SOD活性MDA含量的测定方法

植物组织中SOD活性MDA含量的测定方法

植物组织中SOD活性MDA含量的测定方法超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量是评价植物细胞的氧化应激程度和损伤程度的重要指标。

下面将介绍常用的测定植物组织中SOD活性和MDA含量的方法。

一、SOD活性测定方法:1. 混合植物组织提取液:将适量的植物组织(如叶片、根部等)加入冰冻磨碎器中,加入适量的冰冷提取液(Tris-HCl缓冲液,pH 7.8或其他适宜缓冲液),按比例加入少量酒石酸、酚酸、DTT等,然后将混合物离心10分钟。

2.处理提取物:将上述所得的植物组织提取液加入活性溶液,如NBT、PIP等,混匀后放置在37°C水浴中反应一定时间。

3. 停止反应:将反应液加入组织破壁液(甘油、NaCl、Tween-20等混合物),混匀后放置一段时间,离心10-15分钟。

4.测定光密度:取上清液用比色计测定光密度(OD)值,以反映SOD的活性,活性越高,OD值越低。

二、MDA含量测定方法:1.组织提取:将适量的植物组织加入冰冷提取液(如磷酸盐缓冲液,pH7.4),用冷磨具磨碎并移至离心管中,离心5分钟收集上清液。

2.加入TBA液:取上清液与TBA液(三硝基苞球菌素溶液)按比例混合,混匀后在水浴中加热(100°C,10分钟),然后迅速冷却至室温。

3.离心沉淀:将样品离心10分钟,取上清液。

4.测定光密度:分别取上清液测定OD值,OD值越高,MDA含量越高。

三、优化与改进:1.提取液的选择:根据不同植物组织的特点选择合适的提取液,以提高SOD活性和MDA含量的测定效果。

2.比色反应的时间和温度的调整:根据植物组织中SOD活性的变化调整反应时间和温度,以保证测定结果的准确性。

3.重复测量:为了提高实验结果的可靠性,可以重复测量同一样本,并取平均值作为最终结果。

4.与对照的比较:将测定样本与对照组进行比较,以评估SOD活性和MDA含量的变化,进一步分析植物组织的氧化应激程度和损伤程度。

wst8法测定sod原理

wst8法测定sod原理

WST8法测定SOD原理超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是一种重要的抗氧化酶,它能够催化超氧阴离子(O2·-)的还原,将其转化为氧气(O2)和过氧化氢(H2O2),从而保护细胞免受氧化应激的损伤。

WST-8法是一种常用的测定SOD活性的方法,其基本原理如下:1.原理介绍: WST-8是一种水溶性的四磺基偶氮盐化合物,它可以通过酶促反应被还原为可溶性的有色产物。

WST-8法测定SOD活性的原理是,利用超氧阴离子的还原能力将WST-8还原为有色产物,通过测量产物的吸光度来间接测定SOD的活性。

该方法的优点是简便、灵敏、重复性好,适用于多种生物体系。

2.SOD活性测定步骤:(1)制备反应液:将WST-8溶液与辣根过氧化物酶(HRP)溶液按一定比例混合,得到WST-8/HRP工作液。

(2)制备样品:将待测的SOD样品进行适当的稀释,使其浓度在测定范围内。

(3)反应体系组装:将适量的WST-8/HRP工作液、稀释后的SOD样品和超氧化物发生剂(例如黄嘌呤核苷酸)按一定比例混合,得到反应混合液。

(4)反应过程:将反应混合液孵育在适宜的温度下,一定时间后终止反应。

(5)测定吸光度:使用分光光度计测定反应液的吸光度,一般在450 nm波长处测量。

吸光度的变化与SOD活性成正比。

3.原理解析: WST-8法测定SOD活性的关键在于超氧化物发生剂的选择和反应液中WST-8的还原反应。

超氧化物发生剂能够产生超氧阴离子,它们与SOD样品中的SOD发生反应,将超氧阴离子转化为氧气。

反应液中的WST-8分子能够被超氧阴离子还原为有色产物,产物的吸光度与WST-8的还原程度成正比,从而间接测定SOD的活性。

4.反应机理:超氧化物发生剂黄嘌呤核苷酸(Xanthine),在存在黄嘌呤氧化酶(XOD)的催化下,被氧气氧化生成尿酸和超氧阴离子。

超氧阴离子与WST-8反应,将WST-8还原为可溶性的有色产物。

实验二 超氧化物歧化酶的活性测定

实验二 超氧化物歧化酶的活性测定

(2)10mmol/L HCl (3)50 mmol/L邻苯三酚
称取邻苯三酚0.063g,用10mmol/L HCl溶液溶解,定容至10mL, 避光保存。
(4)SOD样液
试剂和器材
1、试剂 (1)pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
称取Tris 0.61g,EDTA-2Na 0.037g,用双蒸水溶解至80mL左右, 用HCl调节pH =8.20(用pH计校正),最后定容至100mL。
方法和步骤
试剂 空白管(mL) 自氧化管(mL)
pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
10mmol/L HCl 50 mmol/L邻苯三酚
2.98
0.02 -
2.98
0.01 0.01
方法和步骤
2、SOD样液的活性测定 样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的 待测酶液,再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化 速率的测定。
(2)10mmol/L HCl (3)50 mmol/L邻苯三酚
称取邻苯三酚0.063g,用10mmol/L HCl溶液溶解,定容至10mL, 避光保存。
(4)SOD样液
试剂和器材
2、器材 (1)恒温水浴槽 (2)紫外分光光度计 酚自氧化速率的测定 取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加 入预热过的邻苯三酚(空白管用10mmol/L HCl代替邻苯 三酚 ),迅速摇匀,立即倾入1cm比色杯中,在325nm波 长处测定光吸收值,每隔30s读数一次,测定4min内每分 钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光 吸收值为0.07(可增减邻苯三酚的加入量,以控制光吸收 值)。
酶工程实验二
超氧化物歧化酶的活性测定
实验背景

实验四 超氧化物歧化酶测定

实验四 超氧化物歧化酶测定

高级植物生理实验报告植物抗性生理农学院农药学东保柱20132020542013年12月27日实验1 超氧化物歧化酶(SOD )活性和丙二醛含量的测定(操作步骤)1 试剂配制1.1 磷酸缓冲液 (PBS) 配制注:配成PBS2000ml ,其中1000ml 用于A 液配制,另1000ml 用于酶液制备。

1.2 其它溶液配制2 酶液制备称取植物材料1g ,加少许0.05mol/L 、pH7.8的磷酸缓冲液在冰浴中研磨,最终定容制得10 ml 匀浆。

转移至10ml 离心试管中,在3000 rpm 下粗离心1分钟,粗提液再转移至2个5ml 离心管中,在冷冻离心机13000g 、4℃下离心20分钟,上清液即为酶液,用于SOD 活性和丙二醛含量的测定。

3 丙二醛含量测定吸取酶液2ml →加入F液2ml →沸水浴加热15分钟(呈粉红色)→快速冷却→4000rpm 下离心5分钟。

若以种子为材料,则加热后溶液混浊,需增加离心力。

以F液为参比液,分别在532nm 和600nm 处测定光密度值。

丙二醛含量(nmol ·g -1)=式中:V/v --- 提取液总量(10ml)/测定液用量(2ml)R --- 反应液总量(4ml)W --- 植物材料鲜重或干重(g)0.155 --- 丙二醛的摩尔浓度消光系数(当[MDA]=1nmol/ml 时,OD 532-OD 600=0.155)[即( OD532—OD600) / 0.155的单位为1nmolMDA / ml ]室温下处理的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值室温下丙二醛含量(nmol·g-1)=-0.0022+0.039/0.155×4×10/2×1=4.75 nmol·g-1 冷处理下的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值冷处理下丙二醛含量(nmol·g-1)=0.077-0.026/0.155×4×10/2×1=6.58 nmol·g-14 超氧化物歧化酶活性测定4.1 操作及说明* 仪器调零液中的“酶液”0.1ml,可以取对照植株的,也可以取胁迫植株的。

超氧化物歧化酶的活力测定

超氧化物歧化酶的活力测定

超氧化物歧化酶的活力测定
曾勤
【期刊名称】《四川省卫生管理干部学院学报》
【年(卷),期】1996(15)1
【摘要】超氧化物歧化酶(SOD)是清除体内超氧自由基(O)的酶类,有保护机体免 O 的毒害的作用,已成为当今医学科学最活跃的研究领域之一。

检测 SOD 活力的方法是研究中的一个首要的问题。

本文复习有关文献。

【总页数】3页(P24-26)
【作者】曾勤
【作者单位】生化教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R446.1
【相关文献】
1.超氧化物歧化酶活力测定方法研究现状 [J], 解国梁;刘敏捷;云吉应;
2.超氧化物歧化酶霜的制备及活力测定 [J], 洪进齐
3.血清超氧化物歧化酶活力测定在肺部炎性与恶性肿块鉴别诊断探讨 [J], 谷力加;麦惠成
4.肺癌患者血清超氧化物歧化酶同工酶活力测定及其意义 [J], 张菊娥;张翠英
5.腮腺肿瘤患者血清超氧化物歧化酶活力测定 [J], 吕昌惠;李冬梅;李树朝;安新因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法
【实验目的】
1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。

2. 熟悉植物叶片中ROS 去除机制。

【实验原理】
超氧化物歧化酶(SOD )普遍存在于动植物与微生物体内。

SOD 是含金属辅基的酶。

高等植物有两种类型的SOD :Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。

SOD 能够清除超氧阴离子自由基 (O 2—),它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害,从而减少自由基对机体的毒害。

超氧阴离子自由基(O 2—)是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。

SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基,生成H 2O 2和O 2。

生成的H 2O 2可被过氧化氢酶分解为O 2和H 2O :
2 O 2—+ 2H + H 2O 2+O 2 2 H 2O 2 O 2+H 2O
超氧自由基非常不稳定,寿命极短,一般用间接方法测定SOD 活性。

本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑(NBT )在光下的还原作用来确定酶活性的大小。

有氧化物质存在时,核黄素可在光照条件下还原。

被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2—。

当加入NBT 后,在光照条件下O 2—又可将NBT 还原为蓝色的甲腙,后者在560nm 处有最大光吸收。

当加入SOD 时,SOD 可通过清除O 2—,而抑制NBT 的光还原反应,使蓝色甲腙生成速度减慢。

于是,进行光还原反应后,反应液蓝色越深,说明酶的活性越低,反之酶的活性越高。

抑制NBT 光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系,据此可以计算出酶活性的大小。

常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位(U )。

【器材与试剂】 1. 实验仪器与用具
研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、微量移液枪、刻度移液管、离心管、光照箱(光照度为4000lx )、容量瓶(10ml )、试管
2. 实验试剂
50mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.8); 130mmol/L 甲硫氨酸(MET )溶液; 750μmol/L 氮蓝四唑(NBT )溶液; 100μmol/L EDTA- Na 2溶液;
CAT
SOD
20μmol/L 核黄素溶液;
SOD 提取介质:50mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.8)内含1% PVP 。

3. 实验材料
正常生长或经逆境处理的小麦叶片 【实验步骤】
1. SOD 提取:称取植物材料0.5g 于预冷的研钵中,加入2ml 预冷的提取介质,在冰浴条件下研磨成匀浆,转移至10ml 容量瓶中,用提取介质冲洗研钵2~3次(每次1~2ml ),合并冲洗液于容量瓶中,定容至10 ml 。

取5ml 转入到离心管中,于4℃、10000 r/min 离心15min ,收集上清液,即为SOD 粗提液。

2.活性测定:取透明度好、质底相同的试管4支。

测定管2支,光下对照1支,暗中对照1支(调零)。

按下表所列内容加入各种溶液(注意最后加入核黄素溶液)。

表 测定SOD 活性时各试剂加入量
试剂/ml
测定管 光下对照
暗中对照
1
2 3 4 50mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.8) 1.5 1.5 1.5 1.5 130mmol/L MET 溶液
0.3 0.3 0.3 0.3 750μmol/L 氮蓝四唑(NBT )溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 100μmol/L EDTA- Na 2溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 20μmol/L 核黄素溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 粗酶液 0.1 0.1 0 0 蒸馏水
0.5
0.5
0.6
0.6
4号试管加入核黄素后立即用黑布套遮光,全部试剂加完后摇匀,将试管置于4000 lx 荧光灯下显色反应15~20min (要求各管照光一致,反应温度控制在25~35摄氏度)。

反应结束后用黑布罩遮盖住试管终止反应。

以4号管作空白(调零),在560nm 下测定吸光度,记录测定数据。

3.结果计算
SOD 活性(U ·g -1FW ·h -1) =
t
V FW A V A A S t S ⨯⨯⨯⨯⨯⨯-5.060
)(00
式中,A0:光下对照管吸光度;A S :样品测定管吸光度;Vt :样品提取液总体积(ml );V S :粗酶液量;t :显色反应光照时间(min );FW :样品鲜重(g )。

【实验结果】 1. 测定数据记录
1(逆境测定管)
2(CK 测定管)
3(光下对照管)
4(暗中对照管)
吸光度A 0.076
0.087
0.437
0.000
反应时间
20 min
2. 计算
逆境下:SOD 活性=
20
1.05.05.0437.060
10)076.0437.0(⨯⨯⨯⨯⨯⨯-=991.3 U ·g -1FW ·h -1
正常环境下:SOD 活性=20
1.05.05.0437.060
10)087.0437.0(⨯⨯⨯⨯⨯⨯-=961 U ·g -1FW ·h -1
可以看出,逆境下的SOD 活性升高。

【注意事项】
1.线粒体内SOD 酶浓度较高,因此研磨要充分。

2.要求各管受光情况一致,所有反应管应排列在与日光灯管平行的直线上。

反应温度控制在25℃,视酶活性高低适当调整反应时间。

温度较高时,光照时间应缩短;温度较低时,光照时间相应延长。

相关文档
最新文档