贴壁细胞培养完整版
贴壁细胞传代培养步骤
贴壁细胞传代培养步骤
一、必要预备材料：
1.黏贴培养基；
2.细胞品系；
3.无菌棉签；
4.注射器；
5.脱硫酸盐卤素灯；
6.无菌细胞刀；
7.培养皿；
二、准备培养基:
1. 将黏贴培养基进行解冻，准备好用于细胞传代培养；
2. 用无菌棉签从瓶口处取出50 µl 培养基，用注射器注入培养皿中；
3. 使用脱硫酸盐卤素灯查看培养皿内的培养基，待培养基稳定后，将其置入培养箱中培养。
三、传代培养：
1. 进行一代细胞培养：将100 μl 细胞品系加入培养基，置入培养箱中培养；
2. 收集细胞：在品系培养至90%~100%阶段时，用无菌细胞刀将培养基连同其中的细胞一起取出；
3. 再生细胞：将细胞回收液均匀分散于新培养皿中，培养至细胞分裂
成熟；
4. 用冷冻融解法进行传代：将细胞悬液的容量加入超净水稀释，冷冻至-80℃后融解，充分混匀均匀后加入培养基中，开始进行传代培养。
四、最终传代注意事项：
1. 使用消毒过的相关器具，保证细胞不受污染；
2. 使用玻璃制品，避免细胞停滞或污染；
3. 确保培养箱的清洁，以免细胞污染；
4. 要保证培养条件的稳定,合理检查、温度、湿度及其他有效细胞培养条件；
5. 按时调整培养液、细胞活力，确保细胞传代培养质量。
贴壁细胞传代培养步骤
贴壁细胞传代培养步骤贴壁细胞传代培养是一项细胞学技术，用于繁殖选定细胞，其目的是在同一种细胞中完成繁殖。
此技术对于基础研究、比较生物学和临床诊断都具有重要意义。
在贴壁细胞传代培养过程中，可以形成一系列细胞系供后续的研究使用，因此这一技术在细胞学研究中扮演着至关重要的角色。
贴壁细胞传代培养具体步骤如下：第一步：首先，将细胞从初始培养基中分离出来，用活细胞物镜观察，查看细胞形态是否正常，结果显示细胞有正常分裂。
第二步：将第一步中分离出的细胞悬浮液转移到饱和细胞悬浮液中，一般采用0.25%的胨酶，将细胞细胞壁分裂，使细胞形成悬浮状态，这一步称为“贴壁”。
第三步：将贴壁后的细胞悬浮液转移到新培养皿中，一般采用Trypsin EDTA抑制剂，使悬浮的细胞不能再分裂，形成不可见的“细胞溶液”，这一步称为“传代”。
第四步：缓慢地用微量移液器将细胞溶液倒入新培养皿中，当液体分散成一液一固时，加入培养基，使细胞随培养基逐渐沉淀，这一步称为“培养”。
第五步：此时，细胞受到培养环境的刺激，开始新一轮的分裂，细胞学习到细胞性质的分化，然后细胞会沉淀在培养皿底部，细胞分裂结束后，就形成了新一代的细胞，从而完成了一次贴壁细胞传代培养实验。
以上就是贴壁细胞传代培养的具体操作步骤，要想做好这项实验，必须按照上述步骤进行操作，只有这样，才能确保实验数据的准确性。
同时，必须注意实验中的环境条件，确保培养基的新鲜，避免菌类污染，进而确保实验的准确性和稳定性。
贴壁细胞传代培养技术正逐步得到应用，目前，它已经运用于很多细胞学领域，尤其是在细胞分化和细胞系的建立中发挥了重要作用。
贴壁细胞传代培养技术更加方便、成本更低，并且能够解决传统细胞培养技术中遗传变异现象导致的假阳性，新增细胞不能够稳定传代等问题，所以受到越来越多的关注。
最后，应该提醒大家，在实验中一定要遵守实验安全规范，做好实验前预防措施，以保障实验安全、获得准确有效的实验结果。
总之，贴壁细胞传代培养技术由于其便捷性、稳定性、节约开销等优点，在细胞学领域具有重要的应用价值，未来将会发挥更大的作用。
贴壁细胞培养实验讲义
贴壁细胞培养技术课讲义一、克隆形成及克隆形成抑制试验克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
平板克隆形成实验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
1.准备所需试剂及物品：①含10%及15 %新生牛血清的RPMI-1640培养液（15 ml/组，8组）②PBS③0.25%胰酶④5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），100 μg/ mL（每1mL生理盐水含100ug药物5-FU），（EP管分装，1ml/管x 8）使用前稀释至所需浓度。
⑤甲醇：冰醋酸（3:1）⑥细胞染色液（吉姆萨、甲基绿、刘氏染液选一即可）⑦12孔板（或6孔板）⑧EP管⑨滴管、小瓶等⑩相机、反光板等⑧实验需用的细胞株胃腺癌细胞MGC79012.操作：实验为无菌操作，均需在超净工作台或安全柜中进行。
因此，每次实验前需提前常规将操作台紫外杀菌，乙醇消毒（前已述，在此不多述）。
第一天：⑪制备细胞悬液：取对数生长期胃腺癌细胞MGC7901，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，用含15%血清的RPMI-1640稀释，使细胞密度为3×102cell/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
具体操作如下：①胰酶消化：将培养瓶中原培养液从上面轻轻吸取弃之（可用滴管），加消化液1ml使之均匀分布作用于瓶内贴壁生长的细胞，细胞变形呈圆形颗粒附着于瓶底（镜下可见）即可弃消化液（可用滴管）（一般数十秒甚至几分钟）。
②加入1mlPBS稍摇动瓶，随即吸取弃之（不要直接冲洗细胞）③加入含10 % 血清RPMI-1640培养液6ml冲洗细胞（吸管，轻、均匀，一定要使瓶内细胞充分悬浮！！），再用加样器吸出0.5ml至1.5Ep管，取10ul样品计数。
《细胞工程》实验三 贴壁细胞株的传代培养
谢 谢！
0.25g胰酶+100mlPBS+0.02gEDTA
4℃过夜溶解
超净台滤器除菌
0.25%胰酶（ 4℃保存，-20 ℃长期保存）
实验步骤：
弃去培养基，PBS洗2-3次
加胰酶（每瓶0.5ml左右，覆盖细胞即可）
消化适当时间，加完全培养基中和（与胰酶比例2:1）
吸取细胞悬液至离心管中
离心（1200转左右，3分钟）
弃去上液，加入新的培养基
成细胞悬液后，转移到培养瓶中
3. 细胞冻存与复苏
收集细胞时，除需用胰酶消化外，其它同悬浮细胞
4. 作 业
贴壁细胞培养的关键技术流程
4.常见问题
传代频率：每2-3天传代（至细胞长满至80%）
传代比率：1:6-1:8传代
消化条件：室温或者37℃
消化时间：依据不同细胞的贴壁牢固程度而不同 1.肉眼观察：细胞团的产生 2.显微镜观察：细胞变圆，部分漂浮 消化过度：传代后细胞不贴壁
贴壁细胞株的传代培养
贴壁细胞
细胞来源：人乳腺癌细胞：MCF-7
肿瘤相关成纤维细胞：CAF
1.培养条件
培养基：1640培养基（或DMEM）（含10%FBS）
PH： 7.2-7.4（可稍偏酸） 温度： 37℃
孵育箱
气体组成： 5%CO2+95%空气
2. 传 代
0.25%胰酶
配制方法：
贴壁细胞培养步骤及注意事项
贴壁细胞培养步骤一、复苏1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。
液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2.把上述细胞悬液吸到装有10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5.3天换一次培养基（具体看细胞生长状态及培养液情况）。
二、传代1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2.把原有培养基吸掉。
3.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS4.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
5.当看到细胞开始脱离培养皿时倒掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
6.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
7.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
8.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
9.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个，继续培养。
10.若是只培养一皿，只需吹散后倒剩1/4左右，重新加入培养液继续培养。
三、冻存1.把原有培养基吸掉。
2.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
4.去掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
5.吹落后把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
6.加入1毫升冻存液悬浮细胞，装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。
7.4℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
配制溶液一、培养基配制（1）（DEME培养基）89%基础培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗（2）（1640培养基）89%基础1640培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗二、冻存液90%血清+10%DMSO；DMSO要慢慢滴加，边滴边摇三、消毒液75%的酒精注意事项（1）进入细胞间必须严格按照下列步骤操作①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。
贴壁细胞培养 A498
北京索莱宝科技有限公司
贴壁细胞培养A498
细胞名称：人肾癌细胞；A498
形态特性：上皮样
生长特性：贴壁生长
培养条件：MEM-EBSS:Minimum Essential Medium(MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts)10%FBS；1%NEAA
传代方法：1:3-1:8传代
冻存条件：细胞冻存液
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。
注意：
我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
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细胞贴壁实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞贴壁生长的基本原理和方法。
2. 了解细胞培养过程中细胞贴壁生长的重要性。
3. 观察细胞在不同条件下的贴壁生长情况，分析影响细胞贴壁生长的因素。
二、实验原理细胞贴壁生长是细胞在体外培养过程中的一种重要生长方式。
细胞在培养皿表面贴附，通过细胞与培养皿表面的相互作用，细胞逐渐伸展、增殖。
细胞贴壁生长对于细胞培养、细胞实验和药物筛选等具有重要意义。
三、实验材料1. 细胞：小鼠心肌细胞（HL-1细胞）2. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清3. 培养工具：培养皿、移液枪、吸球、无菌操作台、显微镜、盖玻片、载玻片4. 实验试剂：0.5%多聚赖氨酸、PBS缓冲液、胰蛋白酶四、实验步骤1. 预处理：将细胞从培养瓶中取出，用胰蛋白酶消化后，用PBS缓冲液清洗细胞，收集细胞悬液。
2. 细胞贴壁：将细胞悬液加入培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 贴壁条件优化：1）将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟，自然晾干后，将其放置于培养皿底部。
2）将细胞悬液加入盖玻片上，使其均匀铺展。
3）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
4. 观察与记录：1）每隔一定时间（如1小时、2小时、4小时等），在显微镜下观察细胞贴壁生长情况。
2）记录细胞贴壁生长速度、细胞形态、细胞数量等指标。
5. 数据分析：1）根据观察结果，绘制细胞贴壁生长曲线。
2）分析影响细胞贴壁生长的因素，如培养时间、细胞密度、培养条件等。
五、实验结果与分析1. 细胞贴壁生长曲线：细胞在培养皿中贴壁生长，随着时间的推移，细胞数量逐渐增加，细胞形态逐渐伸展。
2. 影响细胞贴壁生长的因素：1）培养时间：细胞贴壁生长速度随培养时间的延长而增加，但过长的培养时间会导致细胞密度过大，影响细胞生长。
2）细胞密度：细胞密度越高，细胞贴壁生长速度越快，但过高的细胞密度会导致细胞相互挤压，影响细胞生长。
3）培养条件：适当的温度、pH值、气体环境等有利于细胞贴壁生长。
贴壁细胞培养
北京索莱宝科技有限公司
贴壁细胞培养
细胞名称：293T，人胎肾细胞
生长特性：贴壁生长
培养条件：DMEM-H(4.5g/L Glucose）+10%FBS
传代方法：1:3～1:4传代，一周2~3次
冻存条件：细胞冻存液
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁且细胞连接松散时再吹打，将细胞分离成单个后，加培养基混匀，分瓶培养。
特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。
3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。
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贴壁细胞培养步骤及注意事项
贴壁细胞培养步骤及注意事项第一步：准备工作1.1清洁实验台面和培养器具在开始培养之前，应先清洁培养器具和实验台面，以确保无菌环境。
1.2准备培养基根据不同实验的要求，准备需要的培养基，并确保其无菌。
1.3预热培养基和器械将培养基和器械置于37℃的培养箱中，使其达到需要的温度。
第二步：细胞分离2.1收集细胞使用无菌技术，收集需要培养的细胞，最好使用处于快速生长期的细胞。
2.2细胞计数使用显微镜和计数板计数细胞数目，以便确定接种的细胞数量。
2.3离心细胞将细胞离心，去除上清液。
第三步：贴壁培养3.1接种细胞将细胞重新悬浮在预热的培养基中，并根据需要的细胞浓度接种到培养器皿中（例如培养皿、培养瓶等）。
3.2倾斜培养器具倾斜培养器具，以确保细胞均匀分布并黏附于底部。
3.3培养器出现倒置的小液滴密封培养器，以防止培养基蒸发和外界污染。
第四步：培养条件4.1恒温条件将培养器放在恒温箱中，维持适当温度（通常为37℃）和湿度。
4.2CO2条件对于一些细胞，需要提供CO2环境以保持合适的pH值。
可以通过加入CO2气体或培养箱添加CO2控制器来实现。
4.3培养时间根据细胞类型和所需实验目的，确定合适的培养时间。
第五步：观察和维护细胞5.1细胞观察使用显微镜定期观察细胞的形态和增长情况。
注意检查细胞的黏附性和细胞层的均一性。
5.2细胞维护根据需要，定期更换培养基，以保持细胞的正常生长和功能。
5.3细胞传代根据细胞生长状态，当细胞层达到一定的密度时，可进行细胞的传代，以保持细胞的活性和健康。
注意事项：1.确保所有用于细胞培养的器具和培养基都是无菌的，以防止细胞受到外界污染。
2.严格遵循无菌技术，避免任何可能导致细菌和真菌污染的操作。
3.细胞培养过程中，保持实验室卫生，定期清洗工作台和设备。
4.在细胞培养中，要注意避免细胞的过度处理和操作。
5.对于一些特殊类型的细胞，如原代细胞，可能需要特殊的培养条件和技术，需要进行额外的注意和维护。
贴壁细胞的培养冻存与复苏
贴壁细胞的常规培养，冻存与复苏1.准备器材，移液管，移液枪，PBS，37℃水浴的完全1640（含10%的血清，加双抗）20min，紫外线照射超净台30min。
2.消毒液洗手，将细胞放在倒置显微镜观察其生长状态，密度。
3.将细胞培养瓶从培养箱中移至超净台中4.用移液枪、移液管吸去培养液。
5.用PBS洗涤培养瓶内细胞两次。
6.加入新鲜的培养液，完全的1640。
7.继续放入37.5℃，5%二氧化碳的培养箱中。
冻存：1.去对数生长期的细胞，当细胞增殖至培养瓶底80%时，吸出培养基。
2.加入1ml胰蛋白酶，洗涤1次后弃去瓶中液体。
3.重新加入1ml胰酶，消化细胞。
4.静置并通过倒置显微镜观察，当细胞变圆并有部分细胞脱壁后，加入1ml含有血清的培养基终止消化。
5.用滴管吸取瓶中也团体轻轻捶打培养瓶底，使细胞完全脱壁。
6.将细胞悬液移入离心管，800r/min离心5min。
7.弃去离心管中液体，加入培养基2ml，轻轻吹打，使细胞重悬。
8.800r/min离心5min。
9.吸去离心管中液体。
10.加入细胞冻存液DMSO100μl，血清900μl保持5~10%的浓度，重悬。
11.将细胞悬液移入冻存管中，4℃放置30min。
12.-20℃放置2h，-70℃过夜。
13.放入液氮中长期保存。
复苏：1.将水浴锅温度调至37~40℃。
2.向离心管中加入9ml培养基。
3.从液氮中取出细胞，迅速放入水浴锅中。
4.完全融化时，将细胞悬液加入离心管中。
5.800r/min离心5min，弃上清。
6.用培养基重悬细胞沉淀。
7.接种培养瓶，常规培养。
8.次日换液。
细胞贴壁生长实验报告
1. 掌握动物细胞培养的基本技术，特别是细胞贴壁生长的过程。
2. 观察细胞在体外培养中的生长和形态变化。
3. 学习细胞传代培养的方法和注意事项。
二、实验原理细胞贴壁生长是指动物细胞在体外培养过程中，细胞会附着在培养皿或瓶壁上，形成单层细胞层。
这一过程依赖于细胞表面的粘附分子与培养皿表面的相互作用。
细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，也是进行细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验的前提。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 小鼠成纤维细胞（或其它动物细胞）- 培养基（DMEM或RPMI-1640）- 10%胎牛血清- 0.25%胰蛋白酶- 灭菌的细胞培养皿- 灭菌的移液器- 灭菌的移液管- 培养箱- 显微镜2. 仪器：- 超净工作台- 离心机- 恒温水浴锅1. 细胞复苏：将冻存的细胞取出，在37℃水浴中快速解冻，然后加入适量的培养基，用移液器吹打均匀，使细胞分散。
2. 制备细胞悬液：将细胞悬液用移液器吹打均匀，确保细胞均匀分布。
3. 接种细胞：将制备好的细胞悬液加入培养皿中，每皿约1×10^5个细胞。
4. 培养：将培养皿放入37℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔24小时更换一次培养基。
5. 观察细胞生长：在显微镜下观察细胞的生长和形态变化，记录细胞贴壁、生长和分裂情况。
6. 细胞传代：当细胞长满培养皿底部时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，按照1:10的比例进行传代培养。
五、实验结果1. 细胞在培养皿中迅速贴壁，形成单层细胞层。
2. 细胞呈梭形、多边形或不规则形，细胞之间紧密连接。
3. 细胞不断增殖，形成致密的细胞层。
4. 经过多次传代培养，细胞生长状况良好。
六、实验讨论1. 细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，对于细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验具有重要意义。
2. 细胞贴壁生长过程受到多种因素的影响，如细胞种类、培养基成分、温度、CO2浓度等。
3. 在实验过程中，应严格控制实验条件，确保细胞正常生长。
支原体检测-贴壁细胞培养法
支原体检测(DNA荧光染色法-贴壁细胞爬片法)实验原理：利用荧光试剂二苯甲酰胺(Hoechst33258),结合到细胞和支原体DNA,A-T富含区域的特点，在紫外激发束（波长为330～380nm）激发下产生黄绿色荧光的原理，利用荧光显微镜检测细胞中是否存在支原体污染。
实验基本材料准备：（1）实验仪器：荧光显微镜（莱卡激发波长330～380nm紫外光UV-2A滤光片）；（2）实验耗材：盖玻片（12×12mm）；载玻片（76×26mm）；甲醇；冰乙酸；荧光染料Hoechst33258；封片液；吸管；六孔板；细胞培养液（MEM完全培养基和五抗生素MEM培养基）；1xPBS；细胞消化液（0.25%胰蛋白酶液）（3）待检细胞：将待检细胞传1～2代，每次培养3～5d，作为待检样品（4）盖玻片准备：盖玻片处理同载玻片，擦净后干燥用无菌去离子水2～8℃保存待用。
（5）载玻片准备：玻片置于自来水中加洗涤剂煮20min，然后用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗3次，放入去离子水中2～8℃待用实验试剂试液配制：(1)固定液配制:甲醇:冰乙酸（3:1）混匀，现配现用；(2)二苯甲酰胺荧光染料(3)封片液；(4)1×PBS细胞样品制备及实验步骤（1）待检细胞处理：①将长成致密单层的细胞用0.25%的胰蛋白酶+0.05%EDTA消化，800～1000r/min离心5min，弃上清胰蛋白酶混合液，所沉淀的细胞用1×PBS洗1次，离心条件相同；用细胞生长液按实验要求稀释至 1×105/ml，加入3ml/孔至6孔板中（6孔板中事先加入盖玻片），在5%CO2，37℃孵箱中培养3～5天；（2）固定：用枪头吸出六孔板中的培养液，用1×PBS清洗六孔板5ml，吸出，加入新配制的固定液5ml，放置5min，吸出；再加新固定液到六孔板中放置10min，用枪头吸出；（3）清洗细胞：加入5ml蒸馏水至六孔板，3min，清洗三次；（4）染色：每孔加入33258荧光染料工作液2ml，室温避光放置30min。
贴壁细胞培养
贴壁细胞培养一、克隆形成抑制试验原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
材料与方法（一）用品：含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、0.25%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。
5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）操作：①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密2个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
度为3×10PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。
Mix。
）吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。
重复。
直到需要的细胞数。
12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。
种板：12孔板，加0.9ml培液，加1ml细胞，不用摇。
②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，0.33， 0.66 ，1.33 ，2.66，3.994.66 μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO，饱2和湿度条件培养箱内孵育7天。
贴壁培养实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞贴壁培养的基本方法。
2. 观察细胞贴壁、生长、增殖过程。
3. 了解细胞培养技术的基本原理和应用。
二、实验原理动物细胞贴壁培养是一种常见的细胞培养方法，适用于大多数动物细胞。
该方法将细胞悬浮于含有营养物质的培养液中，使其附着于培养皿底部或盖玻片上，形成单层或多层细胞。
在适宜的培养条件下，细胞可进行增殖、分化等生物学活动。
三、实验材料1. 细胞：小鼠成纤维细胞2. 培养基：DMEM培养基3. 试剂：10%胎牛血清、青霉素-链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶4. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、移液器、培养皿、盖玻片等四、实验方法1. 细胞复苏：将冷冻保存的细胞取出，用预热的DMEM培养基溶解，37℃水浴箱中复温至37℃，加入10%胎牛血清、青霉素-链霉素混合液，制成细胞悬液。
2. 细胞接种：将细胞悬液用移液器吸取，接种于培养皿中，每孔加入2ml细胞悬液，置于CO2培养箱中培养。
3. 细胞传代：待细胞生长至80%左右融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液。
按照1:3的比例传代培养。
4. 观察细胞贴壁、生长、增殖过程：每隔一定时间，观察细胞在培养皿中的生长状态，包括细胞形态、数量、融合程度等。
五、实验结果1. 细胞复苏：冷冻细胞在37℃水浴箱中复温后，逐渐恢复活力，出现典型的细胞形态。
2. 细胞接种：细胞接种后，约24小时开始贴壁，约48小时形成单层细胞。
3. 细胞传代：细胞传代后，生长状态良好，形态、数量、融合程度与原代细胞相似。
4. 细胞生长曲线：观察细胞生长过程，绘制细胞生长曲线，显示细胞呈指数增长。
六、实验讨论1. 本实验成功实现了动物细胞贴壁培养，观察了细胞贴壁、生长、增殖过程。
2. 细胞贴壁培养过程中，温度、CO2浓度、pH值等环境因素对细胞生长具有重要影响。
本实验中，CO2培养箱的温度设置为37℃，CO2浓度为5%，pH值稳定在7.2-7.4。
贴壁细胞培养流程
贴壁细胞培养流程1.将自己的细胞取出来，观察密度。
（细胞密度大于等于80%就可以处理了）2.准备传代需要的实验器材及试剂（5ml、1ml枪头，PBS,培养基，废液缸）3.将培养瓶中培养液倒出（培养瓶举高一点，不要太靠近废液缸，以免污染）4.每次加3ml左右PBS洗细胞，洗两次（注意不要将细胞吹打下来。
用PBS洗的目的：传代细胞所用的培养基一般含有血清，而血清能影响胰酶的活性，使其失效，因此一般在加胰酶之前会用PBS洗一下，避免胰酶活性降低）5.加入1ml胰酶，前后摇匀，在显微镜下观察其形态（为什么用胰酶消化：细胞外含有多种胞外蛋白,如胶原蛋白。
这些蛋白使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起来。
用胰蛋白酶分解这些蛋白质后它们就分开了。
胰酶消化过度：消化过度，一方面会对细胞本身造成伤害，另一方面，造成细胞流失，也就是吸取消化液时，由于消化过度，其中大量溶在消化液中的细胞被吸走，导致细胞数量减少）6.等到细胞变圆，没有连成一片且开始慢慢脱落下来的时候就可以终止消化了（如果想加速消化，就把细胞放回培养箱）7.终止消化：加入5ml左右培养基，并将细胞吹打下来。
吹打完后在显微镜下观察吹打情况。
（注意四个角落的细胞是否吹打下来）8.把细胞吸到离心管中，离心5分钟1000转。
9.离心完后取出离心管，离心管底部有一团白色的细胞。
10.倒出培养液，加入2ml左右培养基并吹散细胞。
11.取出一个培养瓶，加入7ml左右培养基。
12.吸取左右细胞加入培养瓶，混匀培养瓶中细胞并前后摇匀。
做好标记，放入培养箱。
（吸取前先混匀离心管中细胞。
）。
贴壁细胞的培养
实验报告三（2015.5.17）贴壁细胞培养姓名：王亚斌班级：生物技术12（1）班学号：2012332860026一、实验目的初步掌握贴壁细胞培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的应用打下基础。
二、实验器材倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml 玻璃吸管、酒精灯等三、方法步骤、观察内容1.用倒置显微镜观察细胞，评估细胞(喉癌)生长状态以及确认无细菌和真菌污染。
弃旧培养液：吸除或倒掉培养皿中的旧培养基。
2.漂洗：每个培养皿加1mL PBS清洗单层细胞，漂洗贴壁细胞一次后倒掉。
3.消化：每个dish加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.025EDTA混合液1:1），轻轻摇动培养皿，经消化液铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下待1/2细胞变圆后加适量完全培养液终止。
4.离心：1000rpm、5分钟离心沉淀细胞，去除培养基（含胰酶及EDTA）。
5. 计数：离心前先滴好计数板待计数，计算细胞的浓度（个/ml）。
取对数生长期于10cm dish 的肿瘤细胞按上述操作消化计数后以2.5×105/孔（5×105/孔）密度铺于6孔板，再用完全培养液补至2 ml/孔。
四、观察结果试验中所添加的防己诺林碱浓度分别为0um/ml 2um/ml 4um/ml6um/ml 8um/ml 10um/ml，下图是各个梯度细胞存亡情况：0um/ml 2um/ml4um/ml 8um/ml10um/ml由上图可以看出，随着防己诺林碱浓度的升高，细胞数目在逐渐地减少，当防己诺林碱浓度在8um/ml的时候细胞形态发生明显变化，从圆球形变为梭形，而且数量有明显的减少，可以看出在这个浓度下细胞开始发生凋亡。
五、分析讨论本次试验在在不同浓度防己诺林碱作用相同时间下，细胞数目和形态有明显不同。
防己诺林碱浓度越高，细胞数目越少，形态也发生变化。
说明一定浓度的防己诺林碱可以起到抑制细胞的繁殖和数目的增长，而达到8um/ml及更高时，细胞开始发生凋亡，10um/ml浓度时，细胞的增殖受到了明显的抑制。
贴壁法原代培养
贴壁法原代培养
1.取得组织（手术组织等），尽量在无菌状态下置于10％DMEM＋双抗培养液中，冰上保
存。
以下步骤在超净台内操作：
2.组织用PBS涮5遍。
（如果为非无菌条件下取得的动物组织，如皮肤等，先用75％酒精
涮一遍）
3.按照图示方法取得最终大约2cm2大小的组织块。
这种做法的目的是为了减少获得污染组织的几率。
4.将2cm2大小的组织块置于6cm培养皿中，在组织上加3－4滴10％DMEM＋双抗培养
液（防止组织干掉），用剪刀剪碎成大约米粒大小。
注：组织块不宜太小，否则不利于细胞爬出生长。
5.将剪碎的组织移入6孔板中，用镊子等将组织块比较紧密的排列在板底。
无需加入培养
基，因为剪组织的时候，组织上沾有培基。
如图示。
注：组织快之间的距离不宜太密，也不宜太疏，否则均不利于细胞生长。
6.将6孔板倒置于37度培养箱中，培养6-8hr，使组织块在孔板中贴牢。
7.正置6孔板，加入10％DMEM没过组织块
注：可以选择加双抗或不加双抗，加双抗时细胞生长较慢，有时会发生没有细胞爬出的情况，在初始组织基本无菌时尽量选择不加双抗培养。
8.无需换液，一般3天后能观察到细胞从组织块中爬出。
当培养基变黄时新加适量培养基。
等到细胞基本长满孔板时，按照正常传代方式进行传代培养。
注：勿忘冻存细胞，保种！。
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贴壁细胞培养
HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
贴壁细胞培养
一、克隆形成抑制试验
原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
材料与方法
（一）用品：
含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。
5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）操作：
①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为
3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数
倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。
Mix。
）
吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。
重复。
直到需要的细胞数。
12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。
种板：12孔板，加培液，加1ml细胞，不用摇。
②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，，，，，
，饱和湿度条件培养箱内孵育μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO
2
7天。
计数：
满体积2000ul 其中药物浓度100ug/ml 100ul
NS: 0 100 N=2
μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = + NS N=2
μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = + NS ul N=2
μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = + NS N=2
μg/ml *2000ul = 100ug/ml * X X = + NS ul N=2
μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = ul + NS ul N=1
4.66μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = ul + NS ul N=1
eg:5-FU * 3 + NS * 3 mix 在EP管中。
等待加药。
N=2
③. 吸去培养液，加入PBS洗涤后，染色,干燥：
刘氏染色法
加Liu A Solution ml染色30 s。
滴加Liu B Solution 1ml于A液上面,轻吹使其充分混合,染色1 min。
水洗, 干燥、拍照
二、细胞传代
原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。
为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
材料与方法
（一）用品：
含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、%胰酶、EP管，细胞培养瓶。
（二）操作：
①制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，PBS过一遍，加%胰酶消化并吹打成单个细胞，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数用。
②细胞传代：在之前制备的细胞悬液中，用滴管吸取1/3滴管至细胞培养瓶，后用滴管吸取3滴管含10%新生牛血清的RPMI-1640至细胞培养瓶，关紧瓶盖用酒精棉
培养箱中孵育。
球搽拭后，放入37℃5%CO
2
三、MTT比色法
原理：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。
实验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料。
化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐。
商品名噻唑蓝，MTT。
活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的兰紫色结晶物，并沉积在细胞中。
而死细胞无此功能。
二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量，在一定的范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
与其他检测方法如细胞计数法，3H掺入法，LDH法有良好的相关性。
材料与方法
（一）用品：
1 MTT液：称取250mgMTT，放入小烧杯内，加50ml PBS（0.01M，）在电磁力搅拌
仪上搅拌30min。
用 um的微孔滤器除菌，分装4度保存，2周内有效。
2. 10%新生牛血清的RPMI-1640， %胰酶，DMSO（分析纯）
3. 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公
司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）步骤
1. 接种细胞，用%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。
2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100μl到EP管中，吹打，计
数。
3. 配5000个细胞/120ul。
用96孔板，设0， 2， 4， 8， 16， 24 μg/ml组每
空加入120μl细胞。
培养。
4. 第二天，加入药物40μl。
5，培养48h。
每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，继续培养4h。
小心吸弃孔内的上清液。
6. 每孔加入150μl的DMSO，震荡10min，570nm 测吸光值。
满体积160ul 其中药物40μl 药物浓度100ug/ml(对照组加40μlNS)
2μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = ul + NS ul
4μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = + NS ul
8μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = + NS ul
16μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = ul + NS ul
24μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = ul + NS ul
5-FU * 4 + NS * 4 mix 在EP管中。
等待加药。
CCK-8法步骤
1. 接种细胞，用%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。
2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100μl到EP管中，吹打，计
数。
3. 配5000个细胞/120ul。
用96孔板，设0， 2， 4， 8， 16， 24 μg/ml组每
空加入120μl细胞。
培养。
4. 第二天，加入药物40μl。
5，培养48h。
每孔加入CCK-8溶液10μl，继续培养30—90min。
6. 震荡10min，450nm 测吸光值。