玉米遗传转化体系的优化及HrpZ基因转化玉米的研究

玉米遗传转化体系的优化及HrpZ基因转化玉米的研究

HrpZ基因是一种来源于植物病原菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)

的蛋白激发因子,它能引起非寄主植物的过敏性反应(hypersensitive response, HR),表现为受侵染组织的快速、局部的萎缩和死亡,这就限制了病原菌进一步扩散的可能性。HR反应后,植物体内出现了一系列的防反应,如强化结构屏障作用,合成裂解酶或者产生植物抗毒素,具体表现在能够防止病菌二次或继发性侵染。

这种非局部化、长期的诱导保护作其抗菌谱很广,极类似于“系统获得性抗性”(systematic acquired resistnace SAR)。玉米(Zea may L.)是世界上重要的粮食、饲料作物,也是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料。

产量居农作物之首,也是重要的遗传模式植物。长期以来,玉米优良基因型高效再生体系的建立一直是人们研究的热点。

我国是世界上仅次于美国的第二大玉米生产国,玉米生产在国民经济中占有非常重要的地位。然而,生产上玉米病害一直是影响玉米产量的重要限制因素,

传统的常规育种由于抗源的缺乏和不同物种间的遗传隔离,使抗病育种工作受到了极大的限制。

利用基因工程技术进行玉米遗传改良,增强玉米抗病虫和耐逆境能力,提高

产量,改善品质,是玉米遗传育种的一个新方向。因此,玉米的基础研究和遗传改良具有重大的理论和现实意义。

为进一步筛选和建立优良玉米自交系的再生和遗传转化体系,本文分别以玉米幼胚,成熟胚,茎尖,根尖及幼叶为外植体进行愈伤诱导,较系统地研究了常规

优良自交系的愈伤组织形成及分化再生的影响因素、农杆菌介导遗传转化体系,并对转化株进行了PCR检测,获得了如下主要结果：1.选用了生产上广泛应用的

10个玉米优良自交系,通过组织培养研究其愈伤诱导及植株再生情况,并优化了玉米愈伤诱导及再生的条件,为开展转基因育种提供了技术基础。结果表明,玉米自交系基因型间的培养能力具有较大的差异,10个玉米自交系幼胚都能诱导出初级愈伤组织,但是形成胚性愈伤组织的能力上具有很大的差异,其中仅6个自交系：H99,丹988,铁7922,1322,7319和PH4CV能形成胚性愈伤组织；以实验室多年来筛选的优良自交系H99,丹988和铁7922的幼胚,成熟胚,茎尖,根尖及幼叶为外植体诱导愈伤,实验证明,根尖和幼叶只能诱导出初级愈伤。

三个基因型中仅丹988的幼胚,成熟胚,茎尖能够诱导出胚性愈伤组织,可见丹988为愈伤诱导的优良自交系。此外,适当浓度的6-BA仅能提高茎尖的愈伤诱导率,培养基种类,胚龄,4℃冷存时间,不同附加物KT,CaCl2, AgNO3的添加对幼胚来源的愈伤也有一定的影响。

2.采用正交试验法,选用丹988的茎尖来源幼胚为受体材料,以

pCAMBIA1301-HrpZpsta和PCAMBIA3301-HrpZpsta为表达载体,对农杆菌转化中的菌液OD值、侵染时间、共培养时间和AS浓度四因素进行了优化。确定了农杆菌介导的转化体系的最优条件为菌液OD值0.6、浸染时间20mi n、共培养时间2d和AS浓度300μmol/L。

此外,鉴定了H99和月988的玉米愈伤组织耐盐碱敏感性和抗草胺磷敏感性,确定玉米愈伤组织盐和草胺磷临界浓度；茎尖来源的愈伤组织的抗性愈伤率,再生率及转化率均略高于幼胚,显著高于成熟胚。将含有HrpZ基因的重组质粒经农杆菌介导法转化玉米愈伤,经PCR检测共获得H99抗盐植株18株,抗草胺磷植株10株,丹988抗盐植株12株,抗草胺磷植株5株。

但并未收获T1代果实。3.对花粉管通道法的外源DNA导入时期和浓度进行

了探讨,仅获得丹988的两棵转基因植株。

花粉管通道法虽然转化效率比较低,但可避开组织培养继代繁琐、再生植株移栽成活较难等障碍,仍不失为一种良好的方法。