杂交瘤技术的实验原理及其操作演示(4学时)
杂交瘤技术流程
杂交瘤技术流程引言：杂交瘤技术是一种重要的细胞和分子生物学研究方法，可以用于合成抗体、研究蛋白质功能以及筛选抗肿瘤药物等领域。
本文将介绍杂交瘤技术的流程，包括细胞融合、筛选和鉴定杂交瘤等环节。
一、细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的第一步，旨在将抗体产生细胞与肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
具体步骤如下：1.1 收集抗体产生细胞和肿瘤细胞：抗体产生细胞可以来自小鼠或人类免疫系统，而肿瘤细胞则常使用骨髓瘤细胞等。
1.2 调整细胞浓度：将抗体产生细胞和肿瘤细胞分别离心，去除培养基，然后重新悬浮在含有多种营养物质的培养基中，使其浓度适宜。
1.3 细胞融合：将抗体产生细胞和肿瘤细胞按照一定比例混合，加入聚乙二醇等融合剂，使细胞融合。
1.4 培养杂交细胞：将融合后的细胞放入含有适宜培养基的培养皿中，利用恒温培养箱进行培养，以促使杂交细胞的生长和繁殖。
二、筛选杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞是为了从大量的融合细胞中筛选出能够产生特定抗体的杂交瘤细胞。
具体步骤如下：2.1 选择培养基：准备含有适宜培养条件的培养基，其中可能包含抗生素等物质以抑制非杂交细胞的生长。
2.2 稀释细胞：将培养皿中的杂交细胞适当稀释，使其分散在培养基中。
2.3 培养杂交细胞：将稀释后的杂交细胞转移到含有适宜培养基的培养皿中，继续在恒温培养箱中培养。
2.4 筛选条件：根据所需抗体的特性，设置相应的筛选条件，如添加特定抗原、采用酶联免疫吸附实验等。
2.5 筛选结果：通过观察培养皿中细胞的形态、颜色等特征，确定是否产生了目标抗体的杂交瘤细胞。
三、鉴定杂交瘤细胞鉴定杂交瘤细胞是为了确认所筛选出的细胞确实具有产生特定抗体的能力，并且可以稳定地传代。
具体步骤如下：3.1 克隆化：将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化，即分离成单个细胞，并分别培养在不同培养皿中。
3.2 培养单克隆细胞：将克隆化后的单克隆细胞继续在恒温培养箱中培养，观察细胞生长情况，筛选出生长良好的细胞。
单克隆抗体制备的杂交瘤技术
单克隆抗体制备的杂交瘤技术XXX,YYY,ZZZ(版权所有，仅限个人)一、实验目的：1.掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法。
2.能运用杂交瘤技术来制备自己的单克隆抗体。
二、实验原理：（一）动物免疫动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。
脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。
当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。
动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。
（二）细胞融合B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。
如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。
脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官,取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞,自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。
其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。
（三）杂交瘤细胞的筛选在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。
细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。
内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase,HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断DNA合成的内源性途径。
杂交瘤技术(hybridoma technique)基本程序与方法 6
杂交瘤技术（hybridoma technique）基本程序与方法 6（2）杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。
复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的 -5℃?0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。
通常情况下，冻存时细胞数量多，生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法，这也是各个实验室普遍采用的程序。
即复苏时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。
用5-10ml HT培养基稀释，1000r/min 10分钟，弃上清，再悬浮于适量HT培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5% CO2培养。
如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加104-105/ml小鼠腹腔细胞进行培养。
不过，冻存的细胞并不都能100%复苏成功，其原因较多，如冻存时细胞数量少或生长状态不良，或复苏时培养条件改变或方法不当，也可能细胞受细菌或支原体污染，以及液氮罐保管不善等。
在出现上述情况时，可采用一些补救方法复苏这些细胞，如小鼠皮下形成实体瘤法，脾内接种法，小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法，以及96孔板培养法等。
6、单抗特性的鉴定（1）单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。
①杂交瘤细胞的染色体分析对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。
另一方面，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。
杂交瘤技术和单克隆抗体技术PPT课件模板
制备单克隆抗体
从筛选得到的杂交瘤 细胞中提取单克隆抗 体，进行纯化和定量 。
应用单克隆抗体
将单克隆抗体应用于 临床诊断、治疗和基 础研究等领域。
单克隆抗体技术的实验操作流程
免疫原制备
制备免疫原，如抗原蛋白或多糖等，并进行 纯化和定量。
免疫动物
将免疫原注射入动物体内，刺激机体产生特异 性抗体。
制备杂交瘤细胞
杂交瘤技术和单克隆
抗体技术ppt课件模
板
汇报人：可编辑
2024-01-11
目录
• 杂交瘤技术简介 • 单克隆抗体技术简介 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的比
较 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的实
验操作流程 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的应
用案例
01
杂交瘤技术简介
杂交瘤技术的定义
杂交瘤技术是一种将免疫系统的B淋巴细胞与骨髓瘤细 胞融合，形成杂交瘤细胞的技术。
单克隆抗体的应用领域
01 肿瘤诊断与治疗
用于肿瘤的早期诊断、靶 向治疗、免疫治疗等。
03
免疫性疾病。
02 感染性疾病
用于诊断和治疗病毒性肝 炎、艾滋病等感染性疾病 。
04 心血管疾病
用于诊断和治疗冠心病、
心肌梗死等心血管疾病。
杂交瘤技术与单克隆抗体技
杂交瘤技术与单克隆抗体技
04
术的实验操作流程
杂交瘤技术的实验操作流程
准备免疫动物
选择适宜的免疫动物 ，如小鼠或大鼠，并 进行免疫接种，刺激 机体产生特异性抗体 。
制备杂交瘤细胞
将免疫动物的脾细胞 与肿瘤细胞融合，形 成杂交瘤细胞。
克隆化筛选
通过选择性培养基筛 选出能够产生所需抗 体的杂交瘤细胞，并 进行克隆化培养。
杂交瘤技术的实验原理及其操作演示
杂交瘤技术的实验原理 及其操作演示
整理ppt
一、杂交瘤技术产生的3个技术关键
1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：
B淋巴细胞(B lymphocytes)：
接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性 抗体，在体液免疫中具有重要功能。
B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再
进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命
单克隆抗体优点：
• 高度纯一 • 高度专一
应用：
✓疾病的论断和治疗(生物导弹) ✓生物大分子的鉴定、定位和分离纯化 ✓细胞器的鉴定、定位和分离 ✓特定细胞或病毒的整理鉴pp定t 、定位和分离
五、大规模培养——批量生产单克隆抗体
常用的大规模培养方法：
动物接种法 转瓶培养法 细胞培养罐法
整理ppt
动物免疫 BALB/c
B淋巴细胞大量增殖
整理ppt
常用免疫方法：
☺常规免疫法 “稳妥；优势克隆” ☺脾内一次性免疫法 “省时；省抗原” ☺短程免疫法 “省时” ☺体外免疫法 “操作繁琐”
免疫途径： 皮下注射 腹腔注射 静脉注射
整理ppt
常规免疫法：
第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂 (皮下注射) 第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂 (皮下注射)
整杂理pp交t 瘤技术操作流程图解
谢 谢
本实验内容到此结束
洗脱液
支持物
亲
被分离物的抗体
合
层
被分离物质
析
原
理
图
其它物质
解
整理ppt
Köhler和Milstein, 1975
1984 年 整理ppt N obel 医 学 奖
3. 杂交瘤细胞的筛选 ：
第十一章动物细胞融合和杂交瘤技术 演示文稿ppt课件
• 单克隆抗体（McAb）的应用：
• 主要用于疾病的诊断、治疗和预防。 • 如各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血 吸虫等数百种疾病的诊断。 • 在疾病治疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士，能 识别“自己”与“异己”，一旦发现致病因素便 与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗癌药物制 成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部 位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。 • 与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高的优 点。
2、聚乙二醇诱导融合
•
继高国楠(Kao) 用PEG成功诱导植物原生
质体融合后，1975年，Potecrvo用该法成功
融合动物细胞。该法以其特有的优势迅速取代
病毒诱导动物细胞融合。
3、电诱导融合
• 同植物原生质体融合
聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤
（1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1
一、动物细胞融合技术
•Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无 脊椎动中发现了细胞合并现象。 •1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触 发动物细胞融合的效应。 •1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG） 化学融合法。
•1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细 胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤 细胞。 •20世纪80年代出现了电融合技术。
细胞膜上，并使两细胞相互凝聚； ②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此 时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2； ③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
这一技术的基础是细胞融合技术。
骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术原理及步骤：杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列3个主要步骤阐明。
(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。
细胞融合与杂交瘤技术ppt课件
成功年代
1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972
1972
植物融合细胞成长状态对比，右瓶为地面融合的 细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞。
细胞融合与杂交瘤技术
动物细胞融合实验使用的小白鼠
技术
原生质体融合
细胞拆合——人为方法，人为组合
细胞融合Байду номын сангаас杂交瘤技术
1. 生物法——仙台病毒法
仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：
① 两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附 着在细胞膜上，并使两细胞相互凝聚；
② 在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环， 此时需要Ca2+和Mg2+，最适pH为8.0一8.2；
勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合 过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。
细胞融合与杂交瘤技术
聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程 细胞融合与杂交瘤技术
细胞融合与杂交瘤技术
聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤
① 将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； ② 离心沉淀，吸去上清液； ③ 加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1
第六章 细胞融合与杂交瘤技术
细胞融合与杂交瘤技术
第一节 细胞融合技术 第二节 杂交瘤技术与
单克隆抗体的生产
细胞融合与杂交瘤技术
第一节 细胞融合技术
一、细胞融合概述 二、细胞融合的基本原理 三、细胞融合的常用方法 四、融合细胞的筛选
细胞融合与杂交瘤技术
一、细胞融合概述
1. 定义
杂交瘤技术制备单克隆抗体
80%
筛选与培养
筛选出能产生所需抗体的杂交瘤 细胞，进行培养和扩增。
杂交瘤细胞的筛选与克隆化
抗体检测
采用酶联免疫吸附试验等方法 检测杂交瘤细胞产生的抗体。
阳性克隆筛选
筛选出能产生所需抗体的阳性 克隆。
克隆化
采用有限稀释法等方法对阳性 克隆进行克隆化，获得单克隆 抗体。
03
单克隆抗体的制备
细胞培养与单克隆抗体的产生
抗体鉴定
通过抗原-抗体反应、免疫电泳、质谱分析等方法，对单克隆抗体 的特异性、亲和力和分子量进行鉴定。
单克隆抗体的应用
01
02
03
04
生物医学研究
用于研究生物体内抗原、抗体 反应机制，以及疾病发生、发 展的机制。
诊断试剂
用于检测生物样本中的特定抗 原或抗体，辅助临床诊断。
靶向治疗
利用单克隆抗体与特定抗原的 结合能力，将药物或放射性物 质导向肿瘤等病变组织，提高 治疗效果和降低副作用。
杂交瘤技术的原理
杂交瘤技术的原理是利用细胞融合技术将免疫细胞与肿瘤细胞融合，形成 杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞既具有免疫细胞的抗体分泌能力，又具有肿瘤细胞的无限 增殖能力。
通过选择性培养基筛选出能够稳定分泌所需抗体的杂交瘤细胞，并进行克 隆化培养，最终获得高纯度、高亲和力的单克隆抗体。
02
杂交瘤的制备
商业前景与市场应用
诊断试剂
单克隆抗体可用于诊断试剂的研发来自提高检测的 特异性和灵敏度。生物治疗
单克隆抗体可用于肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾 病治疗等领域。
药物研发
单克隆抗体可用于药物靶点的发现和验证，加速 新药研发进程。
未来发展方向与展望
01
杂交瘤技术
整理课件
4
10.1.1 融合用骨髓瘤细胞
用于融合的骨髓瘤细胞大多能耐受抑制细胞代谢的毒性药物 8- 氮 鸟 嘌 呤 ， 是 一 种 缺 乏 次 黄 嘌 呤 鸟 嘌 呤 磷 酸 核 糖 转 移 酶 （hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT） 的遗传缺陷型肿瘤细胞,在HAT选择培养液中不能生长。
饲养细胞要达到一定的浓度才具有促进细胞生长的 作用。每孔的数量不应少于104个。
整理课件
18
10.3.6 免疫脾细胞的制备
处死小鼠，消毒后固定于解剖架上打开腹腔， 在左后腹部取出脾脏。
按上述研磨胸腺的办法，获取单个脾脏细胞。 计数有核细胞（用苔盼蓝液作活细胞计数），
一个脾脏可获约108个细胞，1000rpm×5min离 心，沉淀细胞重悬于适量的培养液中备用。
融合用的小鼠骨髓瘤细胞株有NS-1、SP2/0和X63等。 HAT代表次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基碟呤
（aminopterin，A）和胸腺嘧啶（thymidine, T）三种物质。
整理课件
5
10.1.2 HAT选择性培养
肿瘤细胞的DNA生物合成有两条途径，一是生物合成的主要 途径，即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进而合 成DNA。在核酸合成过程中，叶酸衍生物为合成核苷酸所必 需，氨基碟呤是一种叶酸拮抗物，它可阻断细胞内DNA生物 合成的主要途径。
动物免疫
免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合
HAT选择培养
阳性杂交瘤筛选
克隆化培养
整理课件
11
10.3.1 免疫抗原
抗原物质主要分为可溶性抗原和颗粒性抗原。 可溶性抗原包括蛋白质、碳水化合物和核酸等。常与福
简述利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体的基本原理
简述利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体的基本原理杂交瘤细胞制备单克隆抗体是一种重要的生物技术手段。
本文将介绍杂交瘤细胞制备单克隆抗体的基本原理、流程及其应用。
一、原理单克隆抗体是指来自同一B细胞克隆的抗体，它具有高度的特异性和稳定性，广泛应用于生物医学、生命科学和工业等领域。
杂交瘤细胞制备单克隆抗体的基本原理是将体外免疫的B细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，使其继承了B细胞产生抗体的能力和骨髓瘤细胞的不死性，从而长期稳定的产生单克隆抗体。
二、流程制备单克隆抗体的流程主要分为以下五个步骤：1. 免疫动物：将抗原注射于小鼠等哺乳动物体内，诱导其产生抗体。
2. 分离B细胞：从免疫动物体内获取脾脏，制备成单细胞悬浮液。
3. 融合细胞：将分离的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 筛选杂交瘤细胞：用选择性培养液筛选并纯化杂交瘤细胞，使其长期稳定的产生单克隆抗体。
5. 鉴定鉴定单克隆抗体：对产生的单克隆抗体进行鉴定，并获取其蛋白质序列，以便制备大规模的单克隆抗体。
三、应用杂交瘤细胞制备的单克隆抗体已广泛应用于许多领域。
在医学上，单克隆抗体已成为重要的诊断和治疗工具。
例如，抗癌单克隆抗体可以选择性地靶向癌细胞，疗效显著。
在生命科学领域，单克隆抗体也广泛应用于分子生物学、组织学和免疫学等方面。
在工业领域，单克隆抗体可以用于生化工业、食品工业和环保等方面。
综上所述，杂交瘤细胞制备单克隆抗体是一种重要的生物技术手段。
它的原理简单、流程清晰，经过鉴定的单克隆抗体具有高度的特异性和稳定性，有着广泛的应用前景。
杂交瘤技术制备单克隆抗体PPT医学课件
HAT选择作用：
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要 途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT和TK 缺乏，DNA合成的替代途径受阻 融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋 巴细胞的HGPRT和TK，可采用补救途径合成DNA， 因此可在HAT培养基上存活和繁殖。
免疫脾细胞
处于免疫状态脾脏中的B淋 巴母细胞或浆母细胞
动 物：
6～12周龄 20g～25g体重
2、骨髓瘤缺陷细胞株的培养和选择
对骨髓瘤细胞的要求：
（1）与免疫动物属同一品系（融合效率高、便于接种杂交瘤细胞在同一品 系小鼠腹腔中产生大量的单克隆抗体。） （2）选择HGPRT—株（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型)或TK（胸 腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞（细胞系在核酸类似物存在时会产生 HGPRT缺乏的突变株，该突变株不能在HAT培养基上生长。） (3)在细胞融合前两周复苏骨髓瘤细胞，保证骨髓瘤细胞处于对数 生长期。
骨髓瘤细胞的培养
1、采用一般的动物细胞培养液，小牛血清的浓度一般 在10%~20%，细胞的最大密度不得超过106cells/mL。
2、骨髓瘤细胞可以悬浮或半贴壁形一 般扩大培养以1:10稀释传代。）
HAT选择培养基的原理
HAT培养基：
H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要 途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替 代途径合成DNA
杂交瘤细胞的选择性培养
细胞DNA合成途经：
1.正常途径： 糖、氨基酸 核苷酸 DNA(可被A-氨基蝶呤阻断) 2、补救途径： 核苷酸前体 核苷酸 DNA （需要次黄嘌呤鸟嘌呤
简述杂交瘤技术的基础原理
简述杂交瘤技术的基础原理
杂交瘤技术的基础原理可以概括为以下几个方面:
一、杂交瘤的形成
杂交瘤是指两种不同生物体的细胞融合形成的细胞混合体。
它依赖于两种细胞膜的融合,两种不同的细胞质和细胞核融合在一起,并具有双重遗传成分,可以长期生存和复制。
二、制备杂交瘤的关键技术
1.获得parental 细胞株。
选取两种细胞株作为杂交的亲本细胞,需要进行纯化和克隆,获得遗传性状稳定的细胞。
2.化学杀伤亲本细胞。
使用环己二醇、离子敏感性抗生素等药物处理亲本细胞,破坏细胞膜完整性。
3.PEG 等化学融合介质处理。
使两种损伤的亲本细胞紧密结合,促进细胞膜融合。
4.筛选杂交细胞。
根据生长需要筛选能存活的杂交细胞,获得杂交瘤细胞株。
三、杂交细胞的遗传性状
杂交细胞集合了双亲细胞的遗传成分,具有以下特征:
1. 表现出双亲细胞的部分性状。
2. 具有大于亲本细胞的生存能力、耐药性等。
3. 细胞核具有双重染色质,细胞质中存在异源细胞器。
4. 可稳定地进行有丝分裂, maintains hybrid traits。
5. 具有治疗肿瘤的双重免疫原性。
四、杂交瘤技术的应用
杂交瘤技术应用于制备杂交瘤疫苗、抗体的生产、基因功能研究等领域。
是一项融合了细胞生物学、免疫学、遗传学等多学科知识的前沿技术。
综上所述,这基本概括了杂交瘤技术形成的过程和原理,它通过细胞融合产生新型的杂交细胞株,实现亲本细胞性质的优化组合,在生物医学研究中有重要应用价值。
杂交瘤技术对2019-nCoV抗体生产实验构想
杂交瘤技术对2019-nCoV抗体生产实验构想摘要：杂交瘤细胞是一种在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞。
杂交瘤细胞一般通过瘤细胞培养来制备。
杂交瘤技术是指两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的现象，可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能。
此次针对2019-nCoV进行杂交瘤细胞培养的实验构想。
关键词：2019-nCoV 杂交瘤技术单克隆抗体1.方法1.1细胞融合杂交瘤技术是在体细胞融合的技术基础上发展而来的，把B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，形成B淋巴细胞-骨髓瘤细胞杂合体，这种杂合体既能在体外培养中无限地快速增殖且存活，又能分泌单克隆抗体。
B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，最多存活两周便死亡；骨髓瘤细胞不分泌抗体，却能在体外无限增殖存活。
将这两种细胞的特性结合起来，就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。
B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型：未融合B细胞，未融合骨髓瘤细胞，B细胞-B 细胞融合体，骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞融合体，B细胞-骨髓瘤细胞杂合体（杂交瘤细胞）。
B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞可大量繁殖并产生所需抗体。
1.2 HAT培养基筛选法细胞DNA合成途径分为主要合成和补救合成途径两种方式。
主要合成就是利用糖和氨基酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而补救合成途径则是通过次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和胸腺嘧啶激酶将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成原料。
HAT培养基含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶。
HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断DNA合成的内源性途径。
融合前的骨髓瘤细胞不能产生抗体，并且缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）基因，使得它们对HAT培养基敏感，阻断了DNA补救合成途径。
HAT培养基使未融合的以及自身融合的骨髓瘤细胞死亡。
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教案课程名称细胞生物学实验授课题目（章、节）实验八：杂交瘤技术的实验原理及其操作演示授课老师刘庆平授课对象2002级生物工程授课时间第十三周教学方法理论教学选用教具多媒体教学实验内容提要：杂交瘤技术的实验原理及其操作演示（4学时）第一节实验介绍150分钟（一）、实验原理；（二）、实验目的；（三）、实验用品；（四）、实验方法和过程；（五）、实验结果分析；第二节．实验多媒体示教30分钟教学重点、难点及基本要求：重点及难点：杂交瘤获得成功的基本要素。
1、动物免疫2、细胞融合3、杂交瘤细胞的融合基本要求：1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体教研室主任意见：单元教学小结（经验效果、问题、改进措施、信息反馈等）本教案以讲授一个单元（2-4学时）一次实验（实习）为单位填写。
填写要用钢笔。
字迹要清晰、工整。
按表项目逐一填写。
实验二杂交瘤技术的实验原理及其操作演示（多媒体教学演示4学时）杂交瘤技术是1975年Kohler和Milstein用于制备单克隆抗体而创建的一项重要技术，被誉为“免疫学上的一次革命”。
此技术被广泛用于各种单克隆抗体的制备。
抗体是由B淋巴细胞分泌的，一个B淋巴细胞只能分泌一种抗体。
把B淋巴细胞和骨髓细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌的杂交瘤细胞，如果把单个杂交瘤细胞克隆化，扩增传代，其分泌的抗体即为高度纯一的单克隆抗体。
单克隆抗体具有高度专一性，一种单克隆抗体只能结合一种特定的抗原决定簇。
正是由于其这种高度专一性，因此被广泛用于疾病的论断和治疗，生物大分子的鉴定、定位和分离纯化，以及一些细胞器，特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离等方面, 具有极其远大的应用前景, 因此，用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要，应用范围越来越广。
实验目的1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体实验原理杂交瘤技术的建立基于以下三种关键技术。
一、动物免疫动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。
脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。
当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。
动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。
二、细胞融合B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。
如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。
脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官, 取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞, 自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。
其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。
通过细胞融合技术脾脏B淋巴细胞骨髓瘤细胞(特异性抗原刺激) 不分泌抗体分泌特异性抗体寿命长寿命短杂交瘤细胞分泌特异性单克隆抗体Köh l e r和M i l s t e i n,获得1984年Nobel奖创立抗原选择抗体学说，发明单克隆抗体技术杰尼Niels K. Jerne科勒Georges J.F. Köhler米尔斯坦César Milstein三、杂交瘤细胞的筛选在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。
细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。
内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂, 能有效地阻断DNA合成的内源性途径。
B淋巴细胞具有HGPRTTK这两种酶, 因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活, 但B淋巴细胞是正常细胞, 故不能长期存活。
杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-缺陷型, 缺乏HGPRT 酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行DNA的外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。
杂交瘤细胞由于继承了B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT养基中能长期存活。
因此将融合后的混合细胞在HAT培养基中培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活下来，成为制造单克隆抗体的细胞源。
实验用品一、器材1. 主要设备: 无菌室一间(或超净台一台), 普通离心机一台, 倒置显微镜一架, 酶联免疫检测仪一台, CO2恒温培养箱一台, 恒温水浴一台, 高压灭菌名锅一个。
2. 小型器材: 血细胞计数板二块, 25ml和50ml培养瓶20个, 96孔和24孔培养板各10块, 40孔酶标板20块, 50ml塑料离心管6支, 10ml玻璃离心管10支, 1ml、5ml和10ml吸管各4支, 6cm培养皿2套, 100ml和50ml培养液瓶各10个, 1ml、5ml和10ml注射器各2支, 小滴管8支, 玻璃套管4, 中、小型手术剪刀各2把, 中、小型手术镊各2把, 6号针头8个, L 型6号针头2个, 500ml和1000ml杯各2个, 酒精灯一盏, 不锈钢网(55cm 200目)2块, 解剖盘2个, 培养液抽滤灭菌装置一套, 橡皮塞若干, 70%酒精棉若干。
二、材料8~12周龄BALB/c纯系小鼠10只；SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞；灭活人轮状病毒(用作抗原)。
三、试剂RPMI 1640培养基, 小牛血清(FCS), GKN液, 50%PEG液, HT培养液, HAT培养液, 0.5% 台盼蓝(trypan blue), 1 mol/L NaOH, 1 mol/L HCl, 包被液, 底物反应液, 辣根过氧化物酶羊(或兔)抗鼠IgG, 青霉素, 链霉素。
[附] 各种试剂配方如下：1. RPMI 1640基本培养液RPMI 1640粉10g, 青、链霉素各10万单位，加三蒸水最终至1000ml, 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl将pH调至7.0，用0.22μm滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。
2. RPMI 1640完全培养液RPMI 1640基本培养液80ml无菌的灭活小牛血清(FCS) 20ml(新鲜小牛血清在56℃灭活30min后，抽滤除菌)3. 100×HT母液次黄嘌呤(H) 136.1mg胸腺嘧啶(T) 38.8mg于50℃溶解后，用0.22蕀滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。
4. 100×A母液氨基喋呤(A) 1.76g三蒸水90ml滴加1mol/L NaOH至完全溶解，再用1mol/L HCl调pH至7.5，加三蒸水至1000ml, 用0.22μm 滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。
5. HT培养液RPMI 1640完全培养液1000ml100×HT母液10ml6. HAT 培养液RPMI 1640完全培养液1000ml100×HT母液10ml100×A母液10ml7. GKN 液配方同实验三，所不同的是需用0.22μm滤膜抽滤除菌。
8. 50% PEG(聚乙二醇)溶液取分子量1000Da的PEG 5g 用高压灭菌溶化，冷却50℃时加入等体积已预热至50℃的无菌GKN，充分混匀后分装冻存备用。
在融合时用1mol/L NaOH调pH至8.0~8.2左右。
9. 包被液Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g加蒸馏水至1000ml，完全溶解后置4℃保存备用。
10. PBSS-Tween20缓冲液NaCl 8.0gNa2HPO4.12H2O 2.9gKH2PO4 0.2gKCl 0.2gTween 20 0.5ml加蒸馏水至1000ml，完全溶解后置4℃保存备用。
11. 底物缓冲液A液: 0.1mol/L 柠檬酸B液: 0.2mol/L Na2HPO4取A液24.3ml + B液 25.7ml，加入蒸馏水至100ml。
12. 底物反应液(使用液)底物缓冲液100ml邻苯二胺(OPD) 40mg实验方法杂交瘤的制备一般应包括动物免疫、细胞融合及HAT筛选、抗体的检测和克隆化几个基本操作步骤(见右图)。
一、动物免疫动物免疫的方法很多，一般有常规免疫法、脾内一次性免疫法、短程免疫法和体外免疫法等。
脾内一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐剂且所得单克隆抗体的特异性较高等特点。
由于单次免疫抗原刺激后数日内就进行细胞融合，因此不存在所谓“优势克隆”的问题，从而更容易获得多种不同特异性的单克隆抗体，也能肋于筛选出差别微小的两种抗原的单克隆抗体。
但该方法的缺点是，其免疫效果要等杂交瘤筛选时才明了, 因此在实验时有一定的随机性；此外对一些免疫原性较差的抗原决原簇的单克隆抗体的筛选较困难。
常规免疫法比较可靠，由于在融合前能通过测定血清中的抗体滴度来证实免疫效果，因此实验成功的把握性较大。
但由于免疫动物多次反复接受相同抗原的刺激, 会使某些特定的淋巴细胞克隆大量增殖, 易形成“优势克隆”, 因此所产生单克隆抗体的种类较少, 很可能多个克隆所产生的单克隆抗体都是针对于同一个抗原决定簇的。
此外此法的免疫程序太长，费时费力。
而短程免疫法和体外免疫法均各有其优缺点，在此不再介绍。
在利用杂交瘤技术制备单克隆抗体时，一般采用常规免疫法。
在本实验中，我们使用人软状病毒脾内一次性免疫法来免疫动物，以达到快速简便的实验效果，也适于学生操作。
具体方法如下。
1. 纯化分离已灭活的人轮状病毒，并精确定量。
2. 用戊巴比妥钠对2只10周龄的BALB/c小鼠进行麻醉，按每克体重注射0.05g戊巴比妥馀的量对小鼠进行腹腔注射，5min后小鼠即进入昏迷状态。
3. 无菌打开小鼠腹腔，暴露出脾脏，用1ml注射器将含有30ng的0.1ml抗原(人轮状病毒)液分别注射到两只小鼠脾脏内。
4. 将脾脏轻轻复位，缝合伤口，饲养备用。
5. 免疫三天后取脾细胞进行融合。
二、细胞融合及HAT筛选细胞融合方法一般有病毒介导的细胞融合、PEG介导细胞融合及电融合等。