杂交瘤技术的实验原理及其操作演示(4学时)

教案

课程名称细胞生物学实验授课题目（章、节）实验八：杂交瘤技术的实验原理及其操作演示授课老师刘庆平授课对象2002级生物工程授课时间第十三周教学方法理论教学选用教具多媒体教学实验内容提要：

杂交瘤技术的实验原理及其操作演示（4学时）

第一节实验介绍150分钟

（一）、实验原理；

（二）、实验目的；

（三）、实验用品；

（四）、实验方法和过程；

（五）、实验结果分析；

第二节．实验多媒体示教30分钟

教学重点、难点及基本要求：

重点及难点：

杂交瘤获得成功的基本要素。

1、动物免疫

2、细胞融合

3、杂交瘤细胞的融合

基本要求：

1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法

2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体

教研室主任意见：

单元教学小结（经验效果、问题、改进措施、信息反馈等）

本教案以讲授一个单元（2-4学时）一次实验（实习）为单位填写。填写要用钢笔。字迹要清晰、工整。按表项目逐一填写。

实验二杂交瘤技术的实验原理及其操作演示

（多媒体教学演示4学时）

杂交瘤技术是1975年Kohler和Milstein用于制备单克隆抗体而创建的一项重要技术，被誉为“免疫学上的一次革命”。此技术被广泛用于各种单克隆抗体的制备。抗体是由B淋巴细胞分泌的，一个B淋巴细胞只能分泌一种抗体。把B淋巴细胞和骨髓细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌的杂交瘤细胞，如果把单个杂交瘤细胞克隆化，扩增传代，其分泌的抗体即为高度纯一的单克隆抗体。单克隆抗体具有高度专一性，一种单克隆抗体只能结合一种特定的抗原决定簇。正是由于其这种高度专一性，因此被广泛用于疾病的论断和治疗，生物大分子的鉴定、定位和分离纯化，以及一些细胞器，特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离等方面, 具有极其远大的应用前景, 因此，用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要，应用范围越来越广。

实验目的

1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法

2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体

实验原理

杂交瘤技术的建立基于以下三种关键技术。

一、动物免疫

动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。

二、细胞融合

B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。

脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官, 取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞, 自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。

通过细胞融合技术

脾脏B淋巴细胞骨髓瘤细胞

(特异性抗原刺激) 不分泌抗体

分泌特异性抗体寿命长寿命短

杂交瘤细胞

分泌特异性单克隆抗体

Köh l e r和M i l s t e i n,获得1984年Nobel奖

创立抗原选择抗体学说，发明单克隆抗体技术

杰尼Niels K. Jerne科勒Georges J.F. Köhler米尔斯坦César Milstein

三、杂交瘤细胞的筛选

在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂, 能有效地阻断DNA合成的内源性途径。B淋巴细胞具有HGPRTTK这两种酶, 因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活, 但B淋巴细胞是正常细胞, 故不能长期存

活。杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-缺陷型, 缺乏HGPRT 酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行DNA的外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。杂交瘤细胞由于继承了B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT养基中能长期存活。因此将融合后的混合细胞在HAT培养基中培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活下来，成为制造单克隆抗体的细胞源。

实验用品

一、器材

1. 主要设备: 无菌室一间(或超净台一台), 普通离心机一台, 倒置显微镜一架, 酶联免疫检测仪一台, CO2恒温培养箱一台, 恒温水浴一台, 高压灭菌名锅一个。

2. 小型器材: 血细胞计数板二块, 25ml和50ml培养瓶20个, 96孔和24孔培养板各10块, 40孔酶标板20块, 50ml塑料离心管6支, 10ml玻璃离心管10支, 1ml、5ml和10ml吸管各4支, 6cm培养皿2套, 100ml和50ml培养液瓶各10个, 1ml、5ml和10ml注射器各2支, 小滴管8支, 玻璃套管4, 中、小型手术剪刀各2把, 中、小型手术镊各2把, 6号针头8个, L 型6号针头2个, 500ml和1000ml杯各2个, 酒精灯一盏, 不锈钢网(55cm 200目)2块, 解剖盘2个, 培养液抽滤灭菌装置一套, 橡皮塞若干, 70%酒精棉若干。

二、材料

8~12周龄BALB/c纯系小鼠10只；SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞；灭活人轮状病毒(用作抗原)。

三、试剂

RPMI 1640培养基, 小牛血清(FCS), GKN液, 50%PEG液, HT培养液, HAT培养液, 0.5% 台盼蓝(trypan blue), 1 mol/L NaOH, 1 mol/L HCl, 包被液, 底物反应液, 辣根过氧化物酶羊(或兔)抗鼠IgG, 青霉素, 链霉素。

[附] 各种试剂配方如下：

1. RPMI 1640基本培养液

RPMI 1640粉10g, 青、链霉素各10万单位，加三蒸水最终至1000ml, 用1 mol/L NaOH和

1 mol/L HCl将pH调至7.0，用0.22μm滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。

2. RPMI 1640完全培养液

RPMI 1640基本培养液80ml

无菌的灭活小牛血清(FCS) 20ml

(新鲜小牛血清在56℃灭活30min后，抽滤除菌)

3. 100×HT母液

次黄嘌呤(H) 136.1mg

胸腺嘧啶(T) 38.8mg