褐藻胶裂解酶的研究进展

。
根据酶的初级结构， 褐藻胶裂解酶被划分为七 （ polysaccharide lyase ， PL ） 族： 5 、 6、 7、 种多 糖 裂 解 酶 14 、 15 、 17 和 18［5］ ， 与其它多糖裂解酶相比具有广泛 多样性。大多数的褐藻胶裂解酶为 PL－5 和 PL－7 。 前者多具有 polyM 底物特异性， 后者多具有 polyG 底 ［6 ］ 物特异性 。鲍鱼和小球藻病毒的褐藻胶裂解酶属 而 Sphingomonas sp.A1 菌株基因转录合成 于 PL－14 ， ［7 ］ 的褐藻胶裂解酶 A1－ IV 属于 PL－15 。
图2
vAL－1 的立体结构
4
褐藻胶裂解酶酶活测定方法
褐藻胶裂解酶酶活测定方法包括定性测定和定
量测定两种方式。 定性测定主要采用唯一碳源生长法或平板鉴定 M 嵌段或 法。唯一碳源生长法是使用含有褐藻胶 、 G ， 者 嵌段作为唯一碳源的培养基 通过观察微生物 的生长和液体培养基粘稠度的降低初步确定酶的活 性。更加灵敏的测定方法则使用 95% 乙醇、 饱和氯 仿蒸汽或 者 钌 红 试 剂 等 处 理 有 微 生 物 生 长 的 培 养 ［13 ］ 皿， 在一定的背景下观察水解圈的大小 。 定量测 定 方 法 有 很 多， 其 中 苔 黑 酚 法 （ Orcinol Assay ） 、 硫代巴比妥酸法（ Thiobarbituric Acid Assay ） 、 紫外 吸 收 法 （ Ultraviolet Absorption Assay ） 、 黏度法 （ Viscometry Assay ） 等是较为常用的方法 。 苔黑酚法是根据未降解褐藻胶在热碱性溶液中 短暂处理的稳定性， 中间产物还原性寡糖和终产物 单糖几乎不发生苔黑酚反应 。 硫代巴比妥酸法的原 理是 4－ 脱氧－5－ 酮糖醛酸和作为中间产物的不饱和 而 糖醛酸经高碘酸氧化处理后产生 β － 甲酰丙酮酸， ［14 ］ 。 紫外吸收法最为简 未降解的褐藻胶不发生反应 单方便， 根据酶解产生的不饱和糖醛酸在 235nm 处 具有强烈吸收的特点直接进行比色测定 。 褐藻胶在 降解过程中溶液黏度下降， 黏度法测定的灵敏度高 ［2 ］ 但操作较为困难 。此外， 还有还原糖法等。在实际 酶活测定中， 常同时测定黏度、 还原糖和吸光值等指 标综合反映酶的降解特性
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褐藻胶裂解酶作用方式
目前发现的能够降解褐藻胶的酶均为裂解酶 ，
尚未发现水解酶。褐藻胶裂解酶通过 β 消去机制催 化褐藻胶降解， 其作用位点是 1 →4 糖苷键。 在水解 形 糖苷键所在的糖环的 C4 和 C5 位置间形成双键， 成了 4－ 脱氧 － L－ erythro－ hex－4 － 烯醇式吡喃糖醛酸 的非还原末端， 在 235nm 处有特征性强吸收。 Gacesa［8］ 提出一种褐藻胶裂解酶的催化机制 ， 这 种机制包括三步反应 ： a. 通过盐桥的中和作用移去羧 基阴离子上的负电荷； b. 从 5 位碳上获得质子的基质 催化反应； c. 羧基基团提供电子在 C4 与 C5 之间形成 双键， 导致发生在 4－ O 糖苷键上的 β 消去反应。
［11 ］ 了酶广泛的底物结合和催化特性 。 Yamamoto 等［9］ 通 过 点 突 变 置 换 了 PL － 14 族 HdAly 上一些保守序列的残基 ， 结果发现， 置换 Lys95
Arg110 和 Arg119 导致 HdAly 完全失活， 置换 Arg92 ， 导致 了 65% 甚 至 更 多 的 失 活。 说 明 从 Arg92 到 Arg119 的 序 列 与 HdAly 的 催 化 活 性 密 切 相 关 。 PL－14 族裂解酶 vAL － 1 具有葡萄糖醛酸裂解活性 ， 同时在碱性条件下具有褐藻胶酶裂解活性 。 其催化 组分 vAL－1 （ S ） 在 pH7.0 时降解褐藻胶释放双糖至 pH 10.0 时主要释放双糖。 说明此酶的外切和 己糖， 内切作用方式依赖于 pH。 vAL－1 （ S ） 的立体结构具 其上有裂口作为催化中 有两条逆向平行的 β 夹板， ［12 ］ ， 2 。 心 如图 所示
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的不同可分为甘露糖醛酸裂解酶 EC4.2.2.3 （ （ 1 →4 ） － α － D － 甘露糖醛酸裂解酶 ） 和古罗 糖 醛 酸 裂 解 酶 EC4.2.2.11 （ （ 1 →4 ） － α － L－ 古罗糖醛酸裂解酶 ） 。 酶 的特异性 可 能 取 决 于 产 生 褐 藻 胶 裂 解 酶 的 生 存 环 境。迄今为止发现的褐藻胶裂解酶多数具有 M 特异 性， 只有少数具有 G 特异性的酶被发现和分离。 一 些粗酶提取物常表现为多种底物特异性 ， 可能因为 此种生物产生多种褐藻胶裂解酶或此酶具有多种底 ［2－3 ］ 。 物特异性 不管是甘露糖醛酸裂解酶还是古罗糖醛酸裂解 酶， 多表现出内切酶活性， 但也有一些外切酶从菌株 Sphingomonas sp. 和鲍鱼中分离出来。 根据 酶 分 子 量 大 小 可 以 分 为 三 类： 25 ～ 30kDa ， 40kDa 左右和 60kDa 左右。40kDa 左右的酶多具有 M 底 物 特 异 性， 25 ～ 30kDa 类 酶 具 有 多 种 底 物 特 异性
［4 ］
PL－7 褐藻胶裂解酶的活性中心根据其底物特异性 ［5 ］ A1 － II' 具有广泛底物特异性， 高度保守 。 其中， 能 polyM 和 polyMG。 A1 － II' β 夹板结构 够裂解 polyG、 中作为催 化 中 心 的 裂 口 上 覆 盖 着 两 个 可 伸 缩 的 盖 环。盖环的柔韧性使得底物可以灵活进入 ， 并决定
纺织、 印染、 医疗、 化工等行业 。 研究 泛用于食品、 证明褐藻胶寡糖具有抗癌、 抗肿瘤、 促进植物生长等 多种生理功能。褐藻胶裂解酶作为生产褐藻胶寡糖 的工具酶， 反应效率高， 反应条件温和， 可控性强， 便 于定向制备褐藻胶寡糖， 其研究具有深远理论意义 和应用前景。
收稿日期：2010－07－05 * 通讯联系人
［2 ］
作者简介：陈俊帆（ 1988－ ） ， 女， 硕士研究生， 研究方向： 食品科学。 ） ； “十一五 ” 基金项目： 国家自然科学基金 （ 30972286 科技支撑计划项 “新世纪优秀人才支持计划” 。 目（ 2007BAD83B03 ） ； 教育部
图1
褐藻胶的化学结构
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褐藻胶裂解酶分类
根据降解褐藻胶上 M 段和 G 段 （ 底物专一性 ）
［15 ］
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褐藻胶裂解酶的结构
PL － 5 （ Sphingomonas sp. A1 － III ） ，PL － 7
（ Corynebacterium sp. ALY－1 ） ， PL－14 （ Chlorella virus ， vAL－1 ） 和 PL－18 （ Alteromonas sp.272 ） 族褐藻胶裂解 酶的三维结构目前已被阐述清楚。 尽管 PL － 7 的 β 夹板结构与 PL－5 的 α / α 套筒结构很不同， 但发现色 氨酸、 组氨酸、 天冬酰胺（ 谷氨酰胺 ） 和精氨酸几乎出 说明这几 现在 PL－5 和 PL－7 催化位点的同一位置， ［9 ］ 种氨基酸参与了酶的催化反应 。 PL－5 族褐藻胶裂解酶 A1 － III 的三维结构中具 有大量螺旋， 在 α6 / α5 套筒结构中有隧道型裂口 ， 与 如图 2 葡萄糖淀粉酶和纤维素酶的套筒结构相 似 ， 所示
［10 ］
。
PL－7 的褐藻胶裂解酶， 如 Corynebacterium sp. 的 G 段裂解酶 ALY－1 ， Sphingomonas sp.A1 的 A1 － II' 和 Pseudomonas aeruginosa 的 M 段降解酶 PA1167 ， 都有 β 夹板结构作为底座， 其中有作为催化中心的裂口 。
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1， *
酶能够通过 β 消去机制催化褐藻胶降解产生具有多种生物活性的褐藻胶寡糖。对于酶的鉴定分析将会拓展酶和寡糖 农业等领域的应用范围。因此本文简要阐述了酶的分类、 测定方法、 构效关系以及生物学功能， 并就其应用的 在食品、 最新进展进行了展望。 关键词：褐藻胶， 褐藻胶裂解酶， 褐藻胶寡糖
陈俊帆 ， 石 波 ， 范红玲 ， 赵聪聪 ， 程永强 （ 1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院 ， 北京 100083 ； 2. 中国农业科学研究院饲料研究所 ， 北京 100081 ）
摘 要：褐藻胶是一种由 L－ 古罗糖醛酸和其 C5 差向异构体 D－ 甘露糖醛酸结合而成的线性高分子多糖。 褐藻胶裂解
褐藻胶是一种由 α － L－ 古罗糖醛酸 （ G ） 和其 C5 差向异构体 α － D－ 甘露糖醛酸 （ M ） 随机结合而成的 线性高分子多糖， 聚合方式包括三种： 聚古罗糖醛酸 （ polyG ） 、 聚 甘 露 糖 醛 酸 （ polyM ） 和 异 聚 MG 段
［1 ］ （ polyMG） ， 其化学结构见图 1 。 褐藻胶来源丰富， 以其螯合金属离子、 溶液高黏性、 凝胶性等特点被广
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. 华东六省一市生物 性质和固定化发酸纳豆激酶的研究［C］ 2003 ： 19－20. 化学与分子生物学会学术交流会论文 ， ［ 41］ 陈树俊， 苏静， 张海英， 等 . 山西老陈醋功效成分的研究 J］ . 农产品加工， 2009 （ 12 ） ： 45－46. 进展［ ［ 42］ 杜双奎， 吕 新 刚， 于 修 烛， 等 . 锐孔法制作食醋微胶囊 ［ J］ . 食品与发酵工业， 2009 ， 35 （ 5 ） ： 85－88.
The latest progress of alginate lyase
* CHEN Jun－ fan1 ， SHI Bo2 ， FAN Hong－ ling1 ， ZHAO Cong－ cong1 ， CHENG Yong－ qiang1 ，
（ 1.College of Food Science ＆ Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083 ， China； 2.Feed Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081 ， China） Abstract： Alginate lyases catalyze the degradation of alginate， a complex copolymer of L － guluronate and its C5 epimer D － mannuronate with β － elimination mechanism， yielding oligosaccharides with special bioactivities. Characterization of alginate lyases will expand the potential use of novel oligosaccharides in various industrial and agricultural fields. The methods for analyzing these enzymes， the structure－ function relationship of these lyases， as well as their biological roles were cataloged. The applications and future prospects of this important enzyme were also explored. Key words： alginate； alginate lyase； alginate oligosaccharides 中图分类号：TS254.1 文献标识码：A 文 章 编 号：1002－0306 （ 2011 ） 08－0428－04