鸡胚1、尿囊腔接种2、绒毛尿囊膜接种 3、卵黄囊等接种方式
流感病毒的鸡胚培养,收获及血凝效价测定实验报告
篇一：鸡胚培养法鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。
鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。
根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。
本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。
鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材spf鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。
二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。
特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。
将鸡卵置于380c---390c孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。
受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。
若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。
也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。
如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。
2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。
死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。
鸡胚1、尿囊腔接种2、绒毛尿囊膜接种 3、卵黄囊等接种方式资料
室端 3）用钢锥在气室中央锥 一 小孔
4） 用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小
孔垂直刺入3cm，注入0.1-0.5ml病毒液。
5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，
每天翻卵1-2次，24h内死亡者废弃。
方法二：
1）2）同一 3）将卵横放在卵座上， 胚胎位置向下。在卵长 径的1/2处用碘酊和酒 精消毒。 4）用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm， 注入病毒液0.1-0.5ml 5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵
十二、收毒
收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上， 冻死胚胎，防止出血。 根据接种途径的不同，收获相应的材料
1、绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜
2、尿囊腔接种 收获尿囊液（5-8ml）
3、卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体
4、羊膜腔接种 收获羊水（0.5-1ml）
4、将注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入
0.1-0.2ml接种物
5、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻
卵并检卵一次，24h内死亡者废弃。
十一、NDV接种鸡胚后对鸡胚的影响
NDV以尿囊腔接种于9-10日龄鸡胚，强毒株 在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的鸡胚 以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、 足趾、翅膀出血尤为明显。
卵黄 在胚胎发育早期供给鸡胚营养。
卵白 在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。
材料
1、鸡胚 10日龄
2、病毒 鸡新城疫病毒（NDV） 3、照蛋灯 4、打孔器 5、石蜡 6、注射器 7、蛋座 8、酒精棉球、碘酊棉球
鸡胚的选择
最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 受精卵的壳最好是白色的
受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，
实验八 病毒鸡胚接种与细培养
（动物医学本科专业）
动物医学系
实验八 病毒鸡胚接种与培养
目的要求：
1、了解不同日龄鸡胚接种的途径和应用。 2、掌握鸡新城疫病毒鸡胚尿囊腔接毒、收毒方法。 3、掌握鸡胚成纤维细胞培养和新城疫病毒接种、病变观察及收毒。
实验内容：
1、鸡胚的选择和接种途径：鸡胚发育正常时，可见清晰的血管和活 的鸡胚，血管及其主要分支均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。 卵黄囊接种：6-8日龄的鸡胚； 绒毛尿囊腔接种：9-13日龄的鸡胚； 鸡胚血管注射：12-13日龄鸡胚； 羊膜腔和脑内注射：10日龄鸡胚。 2、鸡新城疫病毒接种液或接种病料的处理；照蛋、打孔；接种。接 种后的检查和收毒。 3、鸡胚成纤维细胞培养和新城疫病毒接种、病变观察及收毒。
病毒分离培养
分离培养：动物接种——原动物/实验动物 鸡胚接种——尿囊腔、卵黄囊、尿囊膜、羊膜腔等
细胞培养——原代细胞
二倍体细胞 传代细胞
cpe观察空斑
基因克隆/扩增
组织块培养——肠管、气管环等
鸡 胚 成 纤 维 细 胞 培 养 程 序 ：
在无菌条件下采取9－10日龄鸡胚 ↓ 除去头(或仅除去喙和眼)、爪和内脏，并剪成块 ↓ 用Hanks液等充分冲洗 ↓ 剪将其剪成lmm大小的碎块 ↓ 加入Hanks液或其他洗液，充分冲洗 ↓ 约4倍量的0.25％胰酶，并调整pH至7.6－7.8 ↓ 37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次 ↓ 吸弃上层胰酶溶液 ↓ 用洗液轻洗2次后 ↓ 吸管充分吹打，直至形成均匀的细胞悬液 ↓ 准备细胞计数 ↓ 单层细胞培养
鸡胚成纤维细胞培养
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞培养的特点：
每个细胞的生理特性基本一致； 感染病毒的细胞可通过细胞病变观察结果； 免疫学和核酸技术检测细胞内有无培养病毒； 从感染的组织分离病毒和病毒克隆。
制造工培训-鸡胚
2、手工接种方法
单孔接种：在胚蛋气室的中心位置打一 小孔，垂直刺入针头2cm,注入接种物，封孔， 放孵化器孵化。 双孔接种：在离气室0.3~0.5cm无大血 管处作一标记，作为接种孔的位置， 在气室 和标记处各打一个孔，自接种孔注入接种物， 封上 两个孔，放入孵化器孵化。
绒毛尿囊膜 气 室
卵膜
羊膜腔
卵黄的收获：打开气室，撕开内壳膜，用镊 子夹出卵黄膜，放入灭菌平皿中，也可以 将整个卵黄物倒入平皿中，选取卵黄囊。* 2、照胚：接种后的温度一般设置于36.537℃，不翻蛋，根据产品的不同选择孵化 的时间和照胚的时间，一般2~7天。照胚前 要检查孵化器的温度、湿度是否正常。
然后再照胚，照蛋灯从气室部位向下照，死胚 发白发亮，血管脱落或血管变细，活胚发红， 蛋体布满血管，可见到活动的鸡胚。绒毛尿 囊膜接种的鸡胚，绒毛膜上可见明显的斑点。 根据产品的要求，留下所要的死胚、活胚， 及时取出并做好标记，放入0~4℃冷库，冷 却4~24h,准备收获。
鸡 胚
卵黄囊 尿囊腔 卵 白
尿囊腔鸡胚接种图
尿囊膜接种
羊膜鸡胚接种图
卵黄囊鸡胚接种图
3、蛋胚消毒 常用的消毒方法： 喷雾消毒、表面擦拭消毒脱 碘的消毒方法、浸泡消毒法。 喷雾消毒：将消毒剂喷于蛋胚表面的消毒方法。 表面擦拭消毒： 用4%的碘酒擦拭蛋壳接种 部位和气室部位，在用75%的酒精脱碘的消 毒方法。 浸泡消毒：将胚蛋浸泡在消毒液中的消毒法。
【操作技能】手工接种 常用物品的准备：注射器、锥子、止血钳、碘 酒棉、酒精棉、酒精灯、 喷壶、废弃缸、冰 袋、种毒，稀释液、白蜡。 操作步骤: 按要求取出适龄的胚蛋，画接种点， 进行表面消毒。在胚蛋的接种部位和气室部 位打孔，绒毛尿囊膜接种要做人工室。 安装连续注射器，调节使用刻度，排出空气。 在胚蛋的接种部位接种。
实验一 鸡新城疫疫苗(一)
尿囊膜贴在卵壳内壁上，用镊子夹住将其撕脱下来即
可。
胚胎：消毒、打开气室卵壳后，用镊子撕破卵壳膜和
绒毛尿囊膜，夹起胚胎，用剪刀剪断卵黄带，将胎儿
放灭菌容器内即可。
8.鸡胚接种注意事项
（1）接种材料一般都应按每毫升1000ＩＵ或μg加入 青、链霉素。
（2）接种位点应避开鸡胚、血管和胚头，以免针头 刺伤鸡胚而造成接种后的损伤性死亡。
实验一 鸡新城疫油乳剂灭活苗的制备技术（一）
新城疫病毒可以在鸡胚中大量增殖，收获的鸡胚
尿囊液中即含有新城疫活病毒，将收获的尿囊液经过
灭活，并加入佐剂，便制成了新城疫灭活疫苗。
目的和要求：
1.掌握鸡胚的孵化过程和鸡胚的接种途径、接 种方法； 2.掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔的增殖过程， 掌握接毒和收毒的方法。
头约1cm左右。
4.病料接种：
若用鸡胚分离、培养病毒，则应选9～12日龄之
间的发育鸡胚。许多病毒，特别是大多数禽病毒都能
在鸡胚或鸭胚中生长繁殖。接种时应先在照蛋器下检 查鸡胚是否健康、活泼，并划出气室和接种部位。然 后严格消毒接种部位和气室（先用碘酊消毒，再用 70%酒精消毒），用打孔器打孔后，每胚接种处理好
水瓶中，使两种抗生素在生理盐水中的含量均
达到1000-2000 IU(μg)/ml。将注射用生理盐
水3-4ml注入一瓶新城疫Ⅳ系弱毒疫苗中，稀释。
3.照蛋定位 ： 接种前应在照蛋器下检查鸡胚，挑出死胚 和弱胚。对所有健康胚应先用红铅笔画出气室 位臵，再于胚胎侧画出接种位点（进针点）， 接种点应避开大血管，靠近气室边缘处，离胚
此法适用于马立克氏病毒、披膜病毒、衣
原体及立克次氏体的分离、培养。接种方法：
气室端蛋壳消毒后，在气室中央打一小孔，用
动物疫病防控知识竞赛复习题
动物疫病防控知识竞赛复习题动物疫病防控知识竞赛复习题一、法律法规及防疫政策篇1、新修订《中华人民共和国动物防疫法》（以下简称新《动物防疫法》）于何时由第十届全国人大常委会第二十九次会议审议通过？答：2007年8月30日。
2、新《动物防疫法》是胡锦涛主席签署的第几号主席令予以发布的？答：第七十一号主席令。
3、《重大动物疫情应急条例》是何时颁布实施的？答《重大动物疫情应急条例》是2005年11月16日国务院113次常务会议通过，自2005年11月18日起施行。
4、新修订《中华人民共和国动物防疫法》何时正式实施？答： 2008年1月1日。
5、新修订《中华人民共和国动物防疫法》（以下简称新《动物防疫法》）与原《动物防疫法》章节和条款上有何差别？答：新修订的《动物防疫法》共十章八十五条。
增加了三章二十四条。
6、《动物防疫法》的制定目的是什么？答：制定目的有５点，加强对动物防疫活动的管理；预防、控制和扑灭动物疫病；促进养殖业发展；保护人体健康；维护公共卫生安全。
7、《动物防疫法》所称动物防疫的含义？答：是指动物疫病的预防、控制、扑灭和动物、动物产品的检疫。
8、动物疫病分为哪几类？答：根据动物疫病对养殖业生产和人体健康的危害程度，动物疫病分为以下三类：一类动物疫病是指对人和动物危害严重，需要采取紧急、严厉的强制预防、控制、扑灭等措施的；二类动物疫病是指可能造成重大经济损失，需要采取严格控制、扑灭等措施，防治扩散的；三类动物疫病是指常见多发、可能造成重大经济损失，需要控制和净化的。
9、《中华人民共和国动物防疫法》所称动物是指哪些动物？答：家畜家禽和人工饲养、合法捕获的其他动物。
10、《中华人民共和国动物防疫法》所称动物疫病仅指动物传染病吗？答：不是，包括动物传染病和寄生虫病。
11、一类动物疫病共有几种，请列举8种以上的动物疫病名称？答：一类动物疫病共有14种，包括：口蹄疫、猪水疱病、猪瘟、非洲猪瘟、非洲马瘟、牛瘟、牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫）、牛海绵状脑病（疯牛病）、痒病、蓝舌病、小反刍兽疫、绵羊痘和山羊痘、禽流行感冒（高致病性禽流感）、鸡新城疫。
病毒的鸡胚培养法
（四）收获病毒
鸡胚为活的有机体，因此要严格无菌操作， 同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种 后24小时内死亡应不计结果。
病 毒 的 鸡 胚 培 养 法
刘映乐
1911年 Rous首先将鸡胚应用于Rous肉瘤病 毒的培养 1938年 Cox应用卵黄囊培养立克次氏体
鸡胚培养法的优点：
1. 组织分化程度低
2. 有神经血管的分布及脏器的构造
3. 来源充足，操作简单 4. 胚体通常无菌
5. 对接种的病毒不产生抗体
鸡胚培养法的缺点：
（三）接种途径
尿囊腔接种
该途径一般用于病毒的（流感、新城鸡瘟病毒 和腮腺炎）适应和传代。
尿囊腔接种
卵黄囊接种
该途径主要用于抗病毒（流感）的药物实验。
羊膜腔接种
该途径主要用于临床材料（如患者的鼻洗液及咽 漱液）的病毒分离。
绒毛尿囊膜接种
该途径主要用于病毒滴定、中和试验和药物实验。
1. 病毒通常不能使鸡胚产生特异性的感染指征。 2. 常规饲养方式的不足
3. 培养病毒的种类有限
鸡胚的结构与生理
鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，中胚
层和内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官
鸡 胚 培 养 的 病 毒 接 种（一）活胚检查 Nhomakorabea1.血管
2.胎动 3.绒毛尿囊膜
（二）实验材料
鸡受精卵, 照蛋灯, 打孔器或剪刀, 蛋盘, 无菌注 射器和针头, 消毒酒精, 酒精灯, 石腊 病毒毒种用生理盐水稀释备用
鸡胚造就法[精华]
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鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。
鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。
根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。
本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。
鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材SPF鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。
二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。
特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。
将鸡卵置于380C---390C孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。
受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。
若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。
也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。
如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。
2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。
死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。
3绒毛尿囊膜发育界限：生活良好的胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜，与胚胎的另一面形成良好的界限须将上面三个方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张，或折断沉落，绒毛尿囊界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
实验一 鸡胚接种
五、孵育
1. 孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 孵卵箱内的温度应保持在37.5 37.52. 相对湿度：50%-60% 相对湿度：50%3. 必须保证具有充 分的新鲜空气流 通，特别是在孵 天以后。 化5-6天以后。 4. 从孵育后第3天 从孵育后第3 开始， 开始，每天翻卵 一次。 一次。
方法二： 方法二： 1. 2. 同方法一 将卵横放在卵座上，胚胎位置向下。 3. 将卵横放在卵座上，胚胎位置向下。在卵长 径的1/2处用碘酊和酒精消毒。 1/2处用碘酊和酒精消毒 径的1/2处用碘酊和酒精消毒。 4. 用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm，注 用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm 1.5cm， 入病毒液0.1 0.5ml。 0.1入病毒液0.1-0.5ml。 5. 用熔化的石蜡封孔， 用熔化的石蜡封孔， 置孵卵箱内继续孵育， 置孵卵箱内继续孵育， 24h内死亡者废弃 内死亡者废弃。 24h内死亡者废弃。
实验一
病毒培养的宿主系统： 病毒培养的宿主系统： 本动物 实验动物：家兔、小 实验动物：家兔、 白鼠、大白鼠、豚鼠、 白鼠、大白鼠、豚鼠、 鸡胚 体外培养的器官、 体外培养的器官、组 织细胞
鸡胚接种
一、实验目的
了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用 了解鸡胚的基本结构与功能， 的鸡胚接种方法。 的鸡胚接种方法。
方法二：（做人工气室） 方法二：（做人工气室） ：（做人工气室 1. 在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位， 在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位， 用电烙器在卵壳上烙一个直径约3 4mm的烤 用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤 焦圈。 焦圈。 2. 用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳， 用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳， 造成卵窗。 造成卵窗。 3. 在气室端中央钻一个小孔。 在气室端中央钻一个小孔。 4. 用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下 用针尖挑破卵窗中心的壳膜， 的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破处。 的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破处。
病毒的鸡胚接种技术
病毒的鸡胚接种技术目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。
仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。
方法与步骤（尿囊接种为例）1．选择9～12日龄的健康鸡胚，最好是SPF鸡胚。
为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。
选好后用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。
孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。
每日最少翻蛋3次。
健康鸡胚：照蛋时可见清晰的气室、血管及鸡胚的活动。
2．病毒材料的处理怀疑污染细菌的液体材料：加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h→高速离心，取上清液→细菌滤器滤过除菌若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。
3．照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。
4．消毒先碘酊后酒精，由内向外呈同心圆状消毒5．打孔用灭菌小锥子在在气室中心或远离胚胎侧气室边缘，避开大血管进行打孔，孔径以1ml注射器针头容量刺入为宜。
6．注入病毒材料用一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插入气室，刺入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。
7．封孔并继续孵化注射后，用熔化的石蜡封孔，置温箱中直立孵化3～7d。
孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。
弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。
8．收毒收毒原则：（1）先冷藏再收毒。
（2）接种什么部位，收集什么部位。
（3）固液分开收集。
（4）无菌收集。
（5）冷冻保存。
收毒方法：无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，用灭菌镊子夹起并撕开或剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。
鸡胚接种的方法与步骤
鸡胚接种的方法与步骤
鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法，其基本步骤如下：1. 选择合适的鸡胚：通常选择9-12 日龄的鸡胚，此时鸡胚的免疫系统尚未完全发育，适合病毒的生长和繁殖。
2. 准备接种材料：将待接种的病毒样品稀释到适当的浓度，并准备好接种工具，如吸管、针头、注射器等。
3. 接种鸡胚：将稀释后的病毒样品接种到鸡胚的尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜等部位。
接种时要注意操作规范，避免污染和损伤鸡胚。
4. 孵化鸡胚：将接种后的鸡胚放入孵化箱中，在适当的温度和湿度条件下孵化，让病毒在鸡胚中生长和繁殖。
5. 观察和检测：在孵化过程中，定期观察鸡胚的生长情况和病变特征，如鸡胚是否死亡、是否出现出血点、是否出现痘斑等。
同时，可以进行病毒的分离和鉴定，以确定病毒的种类和特性。
6. 收获病毒：当病毒在鸡胚中生长和繁殖到一定程度时，可以收获病毒。
收获病毒的方法包括离心、过滤、沉淀等，具体方法取决于病毒的种类和特性。
7. 保存病毒：收获的病毒可以保存在适当的温度和湿度条件下，以备后续的实验和研究使用。
需要注意的是，鸡胚接种是一项技术性较强的操作，需要严格遵守实验操作规范和安全注意事项，以确保实验的准确性和安全性。
同
时，在进行鸡胚接种实验时，应该遵循相关的法律法规和伦理规范，确保实验的合法性和道德性。
病毒的鸡胚培养法
（一）实验目的 （二）实验原理 （三）实验器材 （四）实验方法 （五）实验作业
（一）实验目的
1.了解鸡胚培养有哪几种常用的接种方法。 2.掌握鸡胚尿囊腔接种培养鸡新城疫病毒的操作技术
。
（ 实二验）室培实养验病原毒常理使用动物接种和鸡胚培养两种方
法，而鸡胚培养更为常见。一般而言，禽病毒病大 部分可经鸡胚分离病毒，其他动物病如犬瘟热也可 经鸡胚分离病毒。
（五）实验作业
1.用鸡胚培养病毒，在选用鸡胚时应注意什么问题？ 2.绒毛尿囊腔内接种在培养和收毒过程中应注意哪些
问题？
鸡胚接种技术是养禽业中一种相对新的疫苗接种方法 。这种方法就是对孵化后期的鸡胚接种某些活的病毒 疫苗。这些病毒疫苗不会对孵化率产生不利的影响， 通过这种方式接种疫苗后孵出的雏鸡具有免疫保护力 。
（三）实验器材
1.鸡胚：要选择SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。从 实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所以要 用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽流感病 毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖致死鸡胚 。
法氏囊病毒的分离
取疑似感染病毒的法氏囊，称重，按1:5（w/v）加入 生理盐水，研磨，-20℃，反复冻融2次；每次冷冻时 间以研磨物结冰为准；
将冻融物转入离心管中，3000转/分，离心5分钟，将 上清取出，使用无菌滤器过滤
2.接种
鸡胚接种的方法有几种：
绒毛尿囊腔内接种
★★
绒毛尿囊膜接种
羊膜腔接种
1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜4.羊膜
卵黄囊内接种
选择6-8日龄的鸡胚 ，照蛋检查，划出气 室和胎位，并以气室 向上竖立在蛋托上， 气室端的蛋壳经消毒 后以打孔器钻一小孔 ，将注射针头刺过小 孔，沿着卵的纵轴刺 入约3cm，然后注入 0.2ml的病毒接种液 ，用氧化锌胶布及石 蜡封口后放回孵化器 中培养。
病毒学实验一鸡胚接种培养
实验要求
• 出勤率 • 实验过程中安静、有序、认真、无污染 • 实验报告书写 • 值日生打扫卫生
注意事项
1 最好选用SPF鸡胚。 2 受精卵入孵后要注意翻蛋。 3 检卵时避免照蛋时间过长引起鸡胚温度下
降过大。 4 接种鸡胚时应尽可能避开血管丰富区域。 5 温箱底盘中要加入足够量的蒸馏水以保持
一定的湿度。
思考题
为什么要将接种后孵化24h内死亡的鸡胚剔除？
鸡胚接种
1 选用9～11日龄发育良好的鸡胚。 2 在接种前用检卵器观察并标记出胚胎的气室及胚胎位置，
在气室下边的胚胎附近没有大血管区域标示出尿囊腔接种 部位。 3 把鸡胚气室向上放置于蛋托上，对接种的气室蛋壳表面 用酒精棉和碘酊消毒。 4 将钻孔器在酒精灯火焰下烧灼消毒后，在气室卵壳端打 孔，用1ml注射器吸取接种0.1ml病毒液，从气室下的蛋 壳侧面经气室将针头斜刺入要接种的尿囊腔部位约1.5cm， 注入接种液。 5 用熔化的蜡封闭卵壳上的孔，气室朝上置于温箱内孵育。 6 对已接种的鸡胚每天在检卵灯下检查胚卵，发现鸡胚死亡 立即放入冰箱，将24h内死亡的鸡胚剔除。 7 2～4天后，收获尿囊液。
• 实验原理：尿囊腔接种法广泛应用于病毒 的适应和传代培养，病毒被注射到尿囊腔 后，可在内皮细胞中被复制，复制的病毒 被释放到尿囊液中，因此，在尿囊液中含 有大量的病毒。
实验器材
• 鸡胚、孵化设备、检卵器、钻孔器、蛋托、 超净台、冰箱、酒精灯、碘酒、酒精棉球、 注射器、蜡烛
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2、用碘酊和酒精消毒后，
小心用刀尖撬起卵壳，造
成卵窗。
3、在气室端中央钻一个 小孔。
4、用针尖挑破卵窗中心
的壳膜，切勿损伤其下的
绒毛尿囊膜，滴加生理盐
水于刺破处。
5、用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造 成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷 而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理 盐水迅速渗入。 6、用1ml注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
鸡胚接种方法
鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低， 病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途 径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。
鸡胚的结构与功能
卵壳 壳膜 气室 绒毛尿囊膜 尿囊腔 羊膜与羊膜腔 卵黄 卵白
羊膜腔
卵壳
卵白 尿囊腔
卵壳膜 气室
绒毛尿囊膜
卵壳 上有细孔，进行气体交换 壳膜 使气体分子和液体分子在内外两方 面进行交换。
卵黄 在胚胎发育早期供给鸡胚营养。
卵白 在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。
材料
1、鸡胚 10日龄
2、石蜡 6、注射器 7、蛋座 8、酒精棉球、碘酊棉球
鸡胚的选择
最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 受精卵的壳最好是白色的
受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，
保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
孵育
孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 相对湿度：50%-60%
必须保证有充分的新鲜空气流通，特别是在孵
化5-6天以后
从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。
检卵
自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。
孵育4-5日于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育
情况。
室端 3）用钢锥在气室中央锥 一 小孔
4） 用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小
孔垂直刺入3cm，注入0.1-0.5ml病毒液。
5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，
每天翻卵1-2次，24h内死亡者废弃。
方法二：
1）2）同一 3）将卵横放在卵座上， 胚胎位置向下。在卵长 径的1/2处用碘酊和酒 精消毒。 4）用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm， 注入病毒液0.1-0.5ml 5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵
7、用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗 中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小
孔用石蜡密封。
8、胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
（三） 尿囊腔接种
主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感
病毒、新城疫病毒的分离和增殖。 1、选用10-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位 2、在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒 3、用钢锥穿一小孔
气室 呼吸和调节压力
绒毛尿囊膜 起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是 在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。
尿囊腔 胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透 明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液 中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13 天后，尿囊液开始变得混浊。
羊膜与羊膜腔 其中盛有羊水，胎体浸泡于其中
4、将注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入0.10.2ml接种物
5、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻
卵并检卵一次，24h内死亡者废弃。
十一、NDV接种鸡胚后对鸡胚的影响
NDV以尿囊腔接种于9-10日龄鸡胚，强毒株 在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的鸡胚以 尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、足 趾、翅膀出血尤为明显。
接种途径 1、尿囊腔接种 2、绒毛尿囊膜接种 3、卵黄囊接种 4、眼球接种 5、羊膜腔接种 6、脑内接种 7、静脉接种 正粘病毒和副粘病毒 狂犬病毒 蓝舌病毒
（一）卵黄囊接种法 主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克 次氏体等的分离和增殖。 方法一： 1）取6-8日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和胚胎位 置后，垂直放置在卵座上(大头向上) 2）用碘酊和酒精消毒气
未受精卵：只见模糊的卵黄阴影，不见血管和
鸡胚痕迹 活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚 还可见到胚动，但孵育14、15天以后胚动不明 显，甚至无胚动。 死胚：血管昏暗模糊，没有胚动。
接种前处理
用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室 和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。
对鸡胚进行消毒。
育，24h内死亡者废弃
（二）绒毛尿囊膜接种 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 方法一： 1）取10-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒 2）在气室端的卵壳上开一1.5×1.5cm的口 3）用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜 4）滴入接种物 5）用胶布或透明胶纸封闭切口
方法二：（要做人工气室） 1、在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用 电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。
十二、收毒
收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以 上，冻死胚胎，防止出血。 根据接种途径的不同，收获相应的材料
1、绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜
2、尿囊腔接种 收获尿囊液（5-8ml）
3、卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体
4、羊膜腔接种 收获羊水（0.5-1ml）