分子遗传图谱构建

一，合适群体大小的确定与作图的内容有关。
从作图效率考虑，作图群体所需样本容量的大小取决于以下两个方面： ① 是从随机分离结果可以辨别的最大图距。 ② 是两个标记间可以检测到重组的最小图距。
二，作图群体大小还取决于所用群体的类型。
在分子标记连锁图的构建方面，为了达到彼此相当的作图精度，所需的 群体大小的顺序为F2>RI>BC1和DH。
（四）DH群体 群体 高等植物的单倍体（ 高等植物的单倍体（Haploid）是含有配子染色体 ） 数的个体。 数的个体。单倍体经过染色体加倍形成的二倍体 称为加倍单倍体或双单倍体（ ）。 称为加倍单倍体或双单倍体（DH）。 优点： 优点： a) DH植株是纯合的，自交后即产生纯系，因此DH 群体可以稳定繁殖，长期使用，是一种永久性群 体。 b) DH群体的遗传结构直接反映了F1配子中基因的 分离和重组，因此DH群体与BC1群体一样，作 图效率是最高的。 c) DH群体跟RI群体一样，可以反复使用，重复试 验，因此也特别适合于QTL定位的研究。
全部亲组合占94％ 全部亲组合占 ％
• 重组型配子所占的比例取决于减数分裂细胞中发 生交换的频率。交换频率越高，则重组型配子的 比例越大。 • 重组型配子最大可能的比例是50%，这时在所有 减数分裂的细胞中，在两对基因的连锁区段上都 发生交换，相当于这两对基因间无连锁，表现为 独立遗传。 • 重组型配子占总配子的比例称为重组率，用r表示。 重组率的高低取决于交换的频率，而两对基因之 间的交换频率取决于它们之间的直线距离。重组 率的值变化于完全连锁时的0%到完全独立时的 50%之间。因此重组率可用来表示基因间的遗传 图距，图距单位用厘摩（centi-Morgan，cM）表 示，1cM的大小大致符合1%的重组率。
这两种概率之比可以用似然比统计量来表 示，即L（r）/L（0.5），其中L（）为似然 函数。为了计算方便，常将L（r）/L（0.5） 取以10为底的对数，称为LOD值。
要确定两对基因之间存在连锁，一般要求似然比大于1000:1，即LOD>3； 要否定两对基因连锁的存在，则要求似然比小于100:1，即LOD<2。
三、图谱制作的统计学原理 （一）两点测验
如果两个基因座位于同一染色体上且相距较近， 如果两个基因座位于同一染色体上且相距较近，则在分离后代中通常表现为 连锁遗传。对两个基因座之间的连锁关系进行检测，称为两点测验。 连锁遗传。对两个基因座之间的连锁关系进行检测，称为两点测验。 两点测验
了解各基因座位的等位基因分离是否符合孟德尔分 离比例，这是连锁检验的前提： 在共显性条件下，F2群体中一个座位上的基因型分 离比例为1:2:1，而BC1和DH群体中分离比例均为 1:1； 在显性条件下，F2群体中分离比例为3:1，而BC1和 DH群体中分离比例仍为1:1。 检验DNA标记的分离是否偏离孟德尔比例，一般采 用χ2检验。
（二）BC1群体 群体 优点： 优点： a) BC1群体中每一分离的基因座只有两种基因型， 群体中每一分离的基因座只有两种基因型， 群体中每一分离的基因座只有两种基因型 它直接反映了F1代配子的分离比例 它直接反映了 代配子的分离比例 。 b) 可以用来检验雌、雄配子在基因间的重组率上 是否存在差异 。 缺点： a) 不能长期保存。 b) 对于一些人工杂交比较困难的植物，BC1群体 也不太合适，因为一是难以建立较大的BC1群 体，二是容易出现假杂种，造成作图的误差。
1，在C=1的假定下，图距x与重组率r之间的关系服 从Haldane作图函数： x=-（1/2）ln（1-2r） 其中x以M为单位。这里M读作Morgan（摩尔 根），它是用著名遗传学家摩尔根的姓命名的， 并取第一个字母表示1M=100cM（厘摩），1cM 为一个遗传单位，即1%的重组率。 根据Haldane作图函数， 20%的重组率相当于图距为 -（1/2）ln（1-2×0.20）= 0.255M，即25.5cM。 Haldane作图函数的不合理之处在于假定了完全 没有交叉干扰。
二、分离群体类型的选择
根据其遗传稳定性可将分离群体分成两大类： • 一类称为暂时性分离群体，如F2、F3、F4、BC、 三交群体等，这类群体中分离单位是个体，一经 自交或近交其遗传组成就会发生变化，无法永久 使用。 • 另一类称为永久性分离群体，如RI、DH群体等， 这类群体中分离单位是株系，不同株系之间存在 基因型的差异，而株系内个体间的基因型是相同 且纯合的，是自交不分离的。这类群体可通过自 交或近交繁殖后代，而不会改变群体的遗传组成， 可以永久使用。
二、基因重组和连锁理论 连锁图谱构建的理论基础是染色体的交换 与重组。 与重组。 基因的连锁是位于同一染色体上的基因在遗 传过程中一般倾向于维系在一起。 基因的重组是通过一对同源染色体的两个非 姊妹染色单体之间的交换来实现的。
• 假设某一对同源染色体上存在Sh-sh ，C- c 两对连锁基因，现有两个亲本P1 和P2，它 们的基因型分别为ShShCC和shshcc，两 亲本杂交产生ShshCc双杂合体。F1在减数 分裂过程中应产生4种类型的配子，其中两 种为亲型配子ShC和shc，两种为重组型配 子Shc和shC。由于Sh-sh和C-c位于同一染 色体上，要产生重组型配子必须在这两个 基因的连锁区段上发生交换。
两个连锁座位不同基因型出现的频率是估算重组值 的基础：
在一般的遗传学教材中，重组值的估计是根据分离群体中重组型个体占 总个体的比例来估计的。这种估计方法无法得到估计值的标准误，因而无法 对估值进行显著性检验和置信区间估计。采用最大似然法进行重组率的估计 可解决这一问题。最大似然法以满足其估计值在观察结果中出现的概率最大 为条件。
在人类遗传学研究中，由于通常不知道父母的基因 型或父母中标记基因的连锁相是相斥还是相引， 因而无法简单地通过计算重组体出现的频率来进 行连锁分析，而必须通过适当的统计模型来估算 重组率，并采用似然比检验的方法来推断连锁是 否存在，即比较假设两座位间存在连锁（r < 0.5） 的概率与假设没有连锁（r = 0.5）的概率。
作图函数： 作图函数：
要计算两个相距较远的基因座之间的图距 如果中间没有其它基因座可利用， 时，如果中间没有其它基因座可利用，则 两个基因座之间实际发生的双交换就不能 被鉴别出来，因此， 被鉴别出来，因此，采用一些数学方法进 行矫正是必要的，否则， 行矫正是必要的，否则，从重组率估计出 的图距就会比真实图距小。 的图距就会比真实图距小。这种矫正可通 过作图函数来实现。 过作图函数来实现。
（三）RI群体 群体 RI（重组自交系）群体是杂种后代经过多代 （重组自交系） 自交而产生的一种作图群体，通常从F2代 自交而产生的一种作图群体，通常从 代 开始，采用单粒传的方法来建立。 开始，采用单粒传的方法来建立。 优点：可以长期使用，可以进行重复试验。 优点：可以长期使用，可以进行重复试验。 缺点： 缺点： a) 构建RI群体要花费很长时间 b) 异花授粉植物由于存在自交衰退和不结实 现象，建立RI群体也比较困难。
理论双交换值是指两个相邻的单交换同时独立发生的概率。 其中r1和r2分别为两个 相邻染色体区段发生单交换的概率。符合系数C的值变动于0~1之间。 当C=0时，表示完全干扰，没有双交换发生； 当C=1时，表示没有干扰，两单交换独立发生。 一般而言，两单交换的位置相距越远，则彼此干扰的程度就越低，符合系数就越大。
缺点： a) 有些植物的花药培养非常困难，就无法通 过花培来建立DH群体。 b) 植物的花培能力跟基因型关系较大，因而 花培过程会对不同基因型的花粉产生选择 效应，从而破坏DH群体的遗传结构，造 成较严重的偏分离现象，这会影响遗传作 图的准确性。
三、群体大小的确定
遗传图谱的分辨率和精度，很大程度上取决于群体 大小。群体越大，则作图精度越高。但群体太大，不仅 增大实验工作量，而且增加费用。因此确定合适的群体 大小是十分必要的。
在其它生物遗传图谱的构建中，似然比的 概念也用来反映重组率估值的可靠性程度 或作为连锁是否真实存在的一种判断尺度。
（二）多点测验
对多个座位进行联合分析， 对多个座位进行联合分析，利用多个座位间的共分离信息来确定它 们的排列顺序，也就是多点测验 多点测验。 们的排列顺序，也就是多点测验。
在未知各基因座位于哪条染色体的情况下： 两点测验，根据两点测验的结果，将那些 基因座分成不同的连锁群，然后再对各连 锁群（染色体）上的座位进行多点连锁分 析。 在一条染色体上，经过多次多点测验，就 能确定出最佳的基因排列顺序，并估计出 相邻基因间的遗传图距，从而构建出相应 的连锁图。
（一）F2代群体 代群体 优点： 优点： a) 自花授粉植物，还是异花授粉植物，建立 群 自花授粉植物，还是异花授粉植物，建立F2群 体都是容易的。 体都是容易的 缺点： a) 存在杂合基因型。对于显性标记，将无法识别 显性纯合基因型和杂合基因型。 b) 由于这种基因型信息简并现象的存在，会降低 作图的精度。 c) 为了提高精度，减小误差，则必须使用较大的 群体，从而会增加DNA标记分析的费用。 d) 不易长期保存，有性繁殖一代后，群体的遗传 结构就会发生变化。
（三）交换干扰与作图函数
随着间距的增加，两个基因座之间便可能在两处同时发生遗传物质的 交换，即双交换。 在染色体某区段上发生的双交换，其实际频率往往少于由单交换概率 相乘所估得的理论值。这是因为一个位置上所发生的交换会减少其周 围另一个单交换的发生，这种现象称为交叉干扰。
干扰的程度可用符合系数C表示，符合系数 C为实际双交换值与理论双交换值的比值。
第三章 分子图谱的构建
分子图谱构建的步骤：
1. 选择适合作图的DNA标记； 2. 根据遗传材料之间的DNA多态性，选择用 于建立作图群体的亲本组合； 3. 建立具有大量DNA标记处于分离状态的分 离群体或衍生系； 4. 测定作图群体中不同个体或株系的标记基 因型； 5. 对标记基因型数据进行连锁分析，构建标 记连锁图。
Sh C Sh C
P1
Sh C Sh C sh c F1
P2
sh ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ sh c
6%细胞
Sh C sh c Sh C
交换
94％ 细胞 无交 换
sh c Sh C Sh C sh c sh c C Sh c sh C Sh c sh 四 分 体 二 分 体 新
Sh c sh C sh c C Sh c sh 3％亲组合 ％ c 新 Sh C sh 新 3％重组合 ％
第一节 作图群体的建立
要构建DNA标记连锁图谱，必须建立作图群 体。建立作图群体需要考虑的重要因素包 括亲本的选配、分离群体类型的选择及群 体大小的确定等。
一、亲本的选配
① 首先要考虑亲本间的DNA多态性。 ② 选择亲本时应尽量选用纯度高的材料，并 进一步通过自交进行纯化。 ③ 要考虑杂交后代的可育性。 ④ 选配亲本时还应对亲本及其F1杂种进行细 胞学鉴定。
第二节 图谱构建的理论基础
一、染色体遗传理论 1903年W. S. Sutton和T. Boveri分别提出了遗传因子位于染 色体上的理论，他们将染色体看作是孟德尔基因的物理载 体。该理论亦称为Sutton-Boveri染色体遗传理论 ： (1) (1)体细胞核内的染色体成对存在，其中一条来自雌亲，一条 来自雄亲，成对染色体的两个成员是同源的。 (2)每条染色体在个体的生命周期中均能保持其结构上的恒定 性和遗传上的连续性，因而在个体的发育过程中起着一定 的作用。 (3)在减数分裂中，同源染色体的两个成员相互配对，随后又 发生分离，走向细胞的两极，从而形成两个单倍体性细胞。
2，为了将交叉干扰的因素考虑进去，一种比较合理的假设 是，双交换符合系数与重组率之间存在线性关系，即C=2r。 该式表示，C值随r的增加而增加，干扰相应减弱。当 r=0.5（即没有连锁）时，C=1（即没有干扰）。根据这一 假设推导出了如下作图函数（Kosambi作图函数）：
• 根据上式可以算出，当r=0.2时，x=21.2cM。