目的基因导入受体细胞
基因工程基本操作过程(目的基因与运载体结合)
2） 在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使 插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。
3）选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过 程中的编码区读框不改变。
当载体和外源DNA用同样的限制性内切酶切割时，所形成的 DNA末端就能够彼此相匹配，可以被T4连接酶共价地连接起 来，形成重组体分子。 但是,当靶片段的末端与载体不匹配时， 必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。这种 末端的转换通常用以下三种方式转换：
载体DNA和目的基因DNA的连接,按DNA片 段末端性质不同，可有下述不同的连接方法：
① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法
1. 同一限制酶切位点连接:
由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完 全相同的末端。只要酶切割产生单链突出的粘性末端 和酶切位点附近的DNA序列不影响连接 .在连接酶的 作用下即可形成重组DNA分子.
人工接头（DNA寡核苷酸连杆）是人工合成 的具有一个或数个特定 限制性内切酶识别和 切割序列的双股平端DNA 短序列。 由平端加 上新的酶切位点，再用限制酶切除产 生粘性 末端，而进行粘端连接。
优点：是进行DNA重组的一种既有效又实用的手 段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法的优 点，而且它可以根据实验的不同要求，设计出具 有不同限制酶位点的人工接头。若在体外连接反 应中增加人工接头的浓度，还会大大提高平末端 DNA片段间的连接效率。
不会自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大 多数携带有目的基因的重组质粒。
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生DNA的 片段没有粘性末端，而是平末端。 具有平末端的 酶切载体只能与平末端的目的基因连接。 T4DNA 连接酶可催化相同或不相同的限制性内切酶切割 的平端间的连接。 平端连接比粘性末端连接要困 难的多，其连接效率很低，约有粘性末端连接的 1%。
高中生物第3章基因工程第节基因工程的基本操作程序教案选择性3
第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
1。
科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。
（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
目的基因导入受体细胞
（6）利用遗传选择标记筛 选哺乳动物转基因细胞
• 在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移 酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基 因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。
• 常用的标记基因还有： • -- 胸腺核苷激酶基因（tk）、 • -- 二氢叶酸还原酶基因（dhfr） • -- 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因
斑点杂交法
狭缝式点样器
斑点及狭缝印迹杂交的特点
1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量
4、菌落（或噬菌斑）原位杂交
基本原理 直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上 溶菌、变性 DNA暴露并于滤膜原位结合
第六章 目的基因导入受体细胞
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程 中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必 须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选 出期待的克隆子。
• 概念
–克隆子 –转化子 –重组子
将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的 受体细胞统称为克隆子。
把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化 子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为 转化子 ），现在这两者有通用的趋向。
含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组 子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组 子。
经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得 所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。
一、遗传表型直接筛选法
• （一）根据载体选择标记初步筛选转化子
• 在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分 子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细 胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性， 作为筛选转化子的依据。
动物基因工程—目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细胞
二、基因导入方法
（1）显微注射法 利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化
方法。 一般是微管吸取供体DNA溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将
DNA注入进去。此法常用于转基因动物的基因转移。
将外源基因用微玻璃管在显微镜下注射入受精卵细胞核中
目的基因导入受体细胞
一、受体细胞（receptor cell）
作为基因工程的宿主细胞必须具备的条件： 便于重组DNA分子导入；能使重组DNA分子稳定 存在；便于便于重组体的筛选；遗传稳定性高，易于扩 大培养；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生 物污染；利于外源基因蛋白产物高效表达。
目的基因导入受体细胞
入的外源基因进行遗传分析。
目的基因导入受体细胞
一、受体细胞（receptor cell）
原核生物受体细胞缺点
原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基 因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。
原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质 的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。
二、基因导入方法
（4）基因枪法
又称微弹轰击法，是利用高速运行的金属颗粒（微弹，1um）轰击细胞时能进入细胞内的 现象，将包裹在金属颗粒（钨或金颗粒）表面的外源DNA分子随之带入细胞进行表达的基 因转化方法。
基本做法：先将外源DNA溶液与钨或金颗粒（直径0.5-um）共同保温，使DNA吸附于金 属颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之以400m/s的速度直接喷射受体细胞，外源 DNA随金属颗粒进入细胞内部。
具有趋化性的农杆菌移向这类植物受伤细胞，并将其Ti质粒上的T-DNA转移至细 胞内部。根据这一性质，将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介导进入 植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表达。
人教版高中生物选修3检测目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定
第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、选择题题型一目的基因导入受体细胞1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是()选项受体细胞导入方法A 棉花细胞花粉管通道法B 大肠杆菌农杆菌转化法C 羊受精卵显微注射技术D 小麦细胞基因枪法答案 B解析花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入微生物细胞，常采用感受态细胞法(Ca2＋处理法)，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；双子叶植物和裸子植物常用农杆菌转化法导入目的基因，单子叶植物(如小麦)可用基因枪法导入目的基因，D正确。
2．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是() A．Ti质粒上B．受体细胞染色体的DNA上C．T-DNAD．农杆菌的拟核答案 B解析在农杆菌转化法中利用农杆菌的T-DNA将目的基因整合到受体细胞染色体的DNA上。
3．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是()A．显微注射法B．农杆菌转化法C．基因枪法D．花粉管通道法答案 A解析显微注射法是迄今为止将目的基因导入动物细胞中采用最多、最有效的一种方法。
4．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的环节是()A．目的基因的提取和导入B．目的基因与载体结合C．将目的基因导入受体细胞D．目的基因的表达答案 C解析如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，使其成为感受态细胞，使含有目的基因的重组DNA分子更容易进入受体细胞，目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的复制而复制。
5．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞的主要原因是()A．结构简单，操作方便B．繁殖速度快C．遗传物质含量少，易操作D．性状稳定，变异少答案 B解析微生物一般具有以下几个特点：①个体微小，结构简单；②繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代；③代谢类型多，活性强；④易变异，相对于高等生物而言，较容易发生变异。
高中生物专题1基因工程1.2第2课时将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定教案高二生物教案
第2课时 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定[学习目标] 1.熟悉目的基因导入受体细胞的方法。
2.了解农杆菌转化法。
3.画出DNA 分子杂交示意图。
4.目的基因的检测方法的比较。
知识点一 将目的基因导入受体细胞知识梳理1.转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内□01维持稳定和表达的过程。
2．将目的基因导入植物细胞(1)□01农杆菌转化法：将目的基因导入□02双子叶植物和裸子植物最常用的方法 ①农杆菌特点：当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的□03酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的□04Ti 质料上的T －DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的□05DNA 上。
②受体细胞：植物□06体细胞或受精卵。
③操作过程：将目的基因插入到□07Ti 质粒的TDNA 上―→转入□08农杆菌―→导入□09植物细胞―→目的基因整合到□10受体细胞染色体的DNA 上―→目的基因表达。
(2)基因枪法：适用于□11单子叶植物，成本较高。
是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的□12表达载体DNA 打入受体细胞中，使目的基因与其整合并□13表达的方法。
(3)花粉管通道法：我国科学家独创的方法花粉管通道法，就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去□14柱头；然后，滴加□15DNA(含目的基因)，使目的基因借助□16花粉管通道进入受体细胞。
该方法十分简单经济。
我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的。
3．将目的基因导入动物细胞(1)方法：□01显微注射技术，采用最多、最有效的方法。
(2)受体细胞：动物的□02受精卵。
(3)操作过程：将含有□03目的基因的表达载体提纯―→取卵(□04受精卵)―→□05显微注射―→受精卵经胚胎早期培养后，□06移植到雌性动物的□07输卵管或子宫内―→获得□08新性状的动物。
4．将目的基因导入微生物细胞(1)方法01Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细①用□胞称为□02感受态细胞)。
人教版 选择性必修三 将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 教案
二将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定一、将目的基因导入受体细胞1．转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．将目的基因导入植物细胞的方法3．将目的基因导入动物受精卵的方法：利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中。
4．将目的基因导入微生物细胞的方法：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。
先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，再将重组的基因表达载体导入大肠杆菌细胞中。
[提醒]微生物(大肠杆菌、酵母菌等)具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等优点。
二、目的基因的检测与鉴定[提醒]PCR不仅可用于获取和扩增目的基因，还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。
(1)将目的基因导入植物细胞一般采用农杆菌转化法。
()(2)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。
()(3)常用卵细胞作为培育转基因动物的受体细胞。
()(4)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测。
()(5)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。
()(6)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中，可用抗原—抗体杂交技术。
()答案：(1)√(2)×(3)×(4)×(5)√(6)×知识点一将目的基因导入受体细胞1．农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒转入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
2．受体细胞的选择(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。
(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。
基因工程中使用的限制酶其特点
基因工程中使用的限制酶其特点基因工程中使用的限制酶其特点是什么在日常生活或是工作，学习中，大家一定都或多或少地接触过一些生物知识，下面是店铺为大家收集的有关基因工程中使用的限制酶其特点相关内容，仅供参考，希望能够帮助到大家。
基因工程中的限制酶的特点特异性地识别和切割DNA关于基因工程中的限制酶(1)“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA的片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
即，当限制性内切酶作用于特定的DNA时，把这段序列沿着特定的切点切开的这个过程分两种情况：a、沿着中轴线切口(即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键)切开，得到的就是两个平末端;b、在中轴线的两端切口切开，得到的就是两个黏性末端。
例如：EcoRⅠ限制性内切酶就可以识别G/AATTC的DNA序列，然后在G和A间切开，得到的就是两个黏性末端(之间可以根据碱基互补配对原则重组)限制酶的切口不都是一长一短的，一长一短的叫黏性末端，一样长的叫平末端。
“粘性末端”在高中教材中也作“黏性末端”。
基因工程的操作步骤工具(1)酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、(2)载体：质粒载体、噬菌体载体、Ti质粒、人工染色体1.提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒，抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因;另一条是人工合成基因。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。
鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增，如使用PCR技术)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA的片段分离出来。
高中生物选修 基因工程 目的基因的导入、检测与鉴定
第8课时目的基因的导入、检测与鉴定[学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。
2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。
[核心素养] 1.科学思维：结合生产实际，举例说出基因工程的基本程序。
2.社会责任：针对生产生活中的某一需求，尝试提出基因工程构想，完成初步设计。
一、将目的基因导入受体细胞1.转化的含义目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.转化的方法(1)导入植物细胞①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用的方法。
a.土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。
b.方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。
表达载体DNA包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达。
③花粉管通道法：在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
(2)导入动物细胞①方法：显微注射技术。
②常用受体细胞：受精卵。
③步骤：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→胚胎早期培养→移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的转基因动物。
(3)导入微生物细胞①原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
②常用的方法a.用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。
b.感受态细胞和重组表达载体DNA分子在缓冲液中混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子。
1.将胰岛素基因的表达载体导入大肠杆菌，从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性，导致这种差异的原因可能是什么？提示大肠杆菌是原核生物，无内质网、高尔基体等细胞器，大肠杆菌中基因表达获得的蛋白质未经加工。
5-目的基因的重组导入
转化 加入 1mLSOC 培养液
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
（3） 平板 培养细菌
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
4.转化率和影响转化率的因素
每gDNA转化成功的细菌克隆数 总受体细胞所获的转化成功的细菌数
（1）重组质粒
①环形质粒数 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片段进入细菌会被降解。
收DNA复合物，球状细胞复原并分裂增殖。在选择性培 养基平板上可挑选所需的转化子。简单，但转化效率不
高（106-108/gDNA）。
10ng载 体DNA 100L感 受态菌 10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42º C 1.5分钟
二乙氨乙基葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外 源DNA。
1
葡聚糖 DEAE
预处理
细胞
摄入
外源DNA
2
外源DNA
混合
细胞
吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可 以进入到细胞核里。 DEAE对细胞有毒!
本章思考题（3）
1、重组DNA分子在导入受体前如何保证插入的正确？ 2、受体的选择有什么要求？ 3、导入大肠杆菌受体的方法有哪些？ 4、导入植物细胞的方法有哪些？ 5、导入动物细胞的方法有哪些？ 6、简述各种重组DNA导入法的优缺点。
但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片段的用量
（2）用碱性磷酸酶处理载体
5’
3’ 插入片段
载体
载体和外源DNA插入片段的连接结果
受体细胞：
原核生物细胞
真核生物细胞 酵母菌细胞
目的基因导入受体细胞及重组子的筛选
活化菌种，扩大培养，使其 处于对数生长后期 （OD600=0.4）
3-4 ml菌液冰水浴中10 分钟，4 ℃离心集菌
转 入 37 ℃ 水 浴 上5 min， 加入 1 ml不含选择性 药 物 的 LB 培 养 基
转入42 ℃水浴 上 2 min ， 使 感受态细胞吸 收重组DNA。
0.2 ml新制备好 的感受细胞中加 入缓冲液溶解的 重 组 DNA ， 置 于冰水浴中1 h 以上，期间轻摇 几次
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受 体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能 进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含 有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或 一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所 致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中 筛选出来。 ■转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转 化子。 ■重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。 具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
3.各种类型受体细胞的优缺点
（1）原核细胞 ■优点 大 部 分 原 核 细 胞 没 有 纤 维 素 组 成 的 坚 硬 细 胞 壁 ， 便 于 外 源 DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA 与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外 源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料， 并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。
专题1 1.2.2 目的基因的导入、检测与鉴定
1．2.2目的基因的导入、检测与鉴定[学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。
2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。
方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。
在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。
方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
这是基因工程的第四步工作。
在完成将目的基因导入受体细胞这一步骤后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。
因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。
检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。
重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。
一、将目的基因导入受体细胞1．转化的含义目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．转化的方法(1)导入植物细胞①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用方法。
a．土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。
b．方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。
目的基因包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达。
③花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加目的基因，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
高中生物(新人教版)选择性必修三课后习题：基因工程的应用(课后习题)【含答案及解析】
基因工程的应用必备知识基础练1.科学家已能运用基因工程技术,让羊的乳腺合成并分泌人体的某些抗体,以下叙述不正确的是()A.该技术可导致定向变异B.表达载体中需要加入乳腺蛋白基因的特异性启动子C.目的基因是抗原合成基因D.受精卵是理想的受体细胞,将目的基因导入受体细胞,可以定向改变生物性状,A项正确;运用基因工程技术,让羊的乳腺生产抗体,则表达载体中目的基因上游要加入羊乳腺蛋白基因的启动子,B项正确;目的基因是人体内控制某些抗体合成的基因,C项错误;受精卵常作为动物基因工程的受体细胞,D项正确。
2.下列关于培育转基因抗虫棉的叙述,正确的是()A.DNA连接酶能把Bt抗虫蛋白基因与噬菌体相连接B.Bt抗虫蛋白基因可借助花粉管通道进入受体细胞C.Bt 抗虫蛋白对害虫和人都有不同程度的毒害作用D.需制备好相应抗原来检测 Bt 抗虫蛋白,可用DNA连接酶将编码Bt 抗虫蛋白的基因与农杆菌的Ti 质粒相连接,构建基因表达载体,A项错误;在植物细胞基因工程中,可利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞,也可以利用花粉管通道法将目的基因导入受精卵中,B项正确;Bt 抗虫蛋白对哺乳动物无毒害作用,C项错误;要检测目的基因是否成功翻译,可用抗原—抗体杂交技术进行检测,目的基因翻译的蛋白质作为抗原,故需制备好相应抗体来检测Bt 抗虫蛋白,D项错误。
3.将某病毒的外壳蛋白(L1)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因连接,构建L1-GFP融合基因,再将融合基因与质粒连接构建下图所示表达载体。
图中限制酶E1~E4处理产生的黏性末端均不相同。
下列叙述错误的是()A.构建L1-GFP融合基因需要用到限制酶有E1、E2、E4B.E1、E4双酶切确保L1-GFP融合基因与载体的正确连接C.若受体细胞中观察到了绿色荧光,说明L1基因已经表达D.培育乳汁中含L1的转基因羊需将表达载体转入乳腺细胞L1-GFP融合基因需要先用限制酶处理获得L1基因和GFP基因,并将二者连接,故需要用到E1、E2、E4三种酶,A项正确;根据题意,限制酶E1~E4处理产生的黏性末端均不相同,E1、E4双酶切可以有效减少载体自身连接和融合基因自身连接,保证L1-GFP融合基因与载体准确连接,B项正确;GFP基因可以认为是标记基因,表达出的绿色荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,利用这一特性可用于检测细胞中目的基因是否表达,C项正确;为了获得L1蛋白,可将表达载体转入受精卵中而不是乳腺细胞中,用于培育乳汁中含有L1蛋白的转基因羊,D项错误。
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④单链DNA转化因子的整合。整合复合物前体中 的单链DNA片段可以通过同源重组，置换受体细胞 染色体DNA的同源区域．形成异源杂合双链DNA
结构。
⑤转化子的形成。受体菌染色体组进行复制，杂合 区段亦随之进行半保留复制，当细胞分裂后，该染 色体发生分离，形成一个新的转化子。
大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进 行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。 在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞的正是 根据人们需要构建的外源重组质粒DNA分子，而非 来自供体菌的游离DNA片段(转化因子)。
蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶 绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ (PS Ⅰ) 和光合系统Ⅱ (PS Ⅱ)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无 细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典 型的原核生物。
蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优 点，具体表现在：
三、动物受体细胞：
优点：
1. 能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切和加工成熟的mRNA。
2. 真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好 的蛋白质免疫原性，约为酵母细胞的16～20倍。
3. 易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。
4. 经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工， 成本低。
和加工。
二、植物受体细胞
优点：全能性，即一个分离的活细胞在合适的培 养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个 获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的 植株或品系。
缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁， 不利于摄取重组DNA分子。
现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、 马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。
②转化因子的吸收。受体菌细胞膜上的DNA 结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构持异 性结合，然后激活邻近的核酸酶，将双链 DNA分子中的一条链逐步降解，同时将另一 条链逐步转移到受体菌内。
③整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链 DNA与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合 物前体，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核 酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。
5.2 重组DNA分子转入原核生物细 胞
5.2.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌
转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入 受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过 程称之为转化。
转化现象最早是由Griffith于1928年在肺炎双球 菌中发现的。
目录
细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体 菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞 中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中， 从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。
缺点：组织培养技术要求高，难度较大。
目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、 猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或 动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。
常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、Hele细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵 巢细胞(CHO)等。以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优 点。
2. 枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的 基因工程菌。Байду номын сангаас
3. 枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。
4. 枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、 分子遗传学背景清楚等优点。
应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、 乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。
三、蓝细菌（蓝藻）
基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA 和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检 测。
细胞壁属G－，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。
营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和 适宜的温度就能满足生长需要。
多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。
酵母菌细胞
是单细胞真核微生物，外源真核基因最理想的表达系统。 优点：
1. 酵母菌是结构最为简单的真核生物之一，其基因表达调控 机理比较清楚，遗传操作相对比较简单。
2. 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。 3. 不含有特异性病毒，不产生毒素。 4. 培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。 5. 能使外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取
因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转化 的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制备感 受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性的方法 之一是Ca2+诱导的大肠杆菌转化法。
（1） Ca2+诱导的大肠杆菌转化法
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因：
①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时 Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内 膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感 受态。
➢以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可 能机制包括如下基本步骤：
①细菌感受态的形成。当转化因子接近细菌细胞 时．受体细胞分泌一种小分子质量的激活蛋白，又 称为感受因子，能诱导使细菌胞壁部分溶解，局部 暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等，此时 细菌细胞处于感受态，极易接纳周围环境中转化因 子以实现转化。
蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品， 在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒 蓝藻，就可达到锦上添花的效果。
真核生物细胞
一、真菌受体细胞
真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达调控机制以及蛋白质的 加工与分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动 植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。
二、枯草杆菌受体细胞
枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。
优点：
1. 枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表 达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表 达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下， 真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有 天然的构象和生物活性。