实验化脓性球菌的分离鉴定
《病原微生物学》致病球菌(化脓性细菌)
UP
2、毒素性疾病
（1）食物中毒 （2）毒性休克综合 征毒素 （3）烫伤样皮肤综
合征
UP
（三）微生物学检查
1．直接镜检 2．分离培养鉴定 3．药物敏感性实验 4．葡萄球菌肠毒素的检测
（四）防治原则
2．注意卫生，防止医源性感染
3．根据药敏试验结果，选用敏感抗菌药物治疗, 一般可选用：红霉素、新型青霉素、庆大霉素、
1．合理使用抗生素，耐青霉素G者高达90%以上。
万古霉素或先锋霉素Ⅵ治疗 。
链球菌
二、链球菌
分布：链球菌广泛分布于自然界、人及动
物粪便和健康人鼻咽部，大多数不致病 。 链球菌属是链球菌科中最大的属，该 属现有90个种（亚种），与人类健康密切 的近10个种。
最常见的为化脓性链球菌和肺炎链球菌。
（一）生物学性状
（二）致病性
1、致病物质 荚膜 2、所致疾病 大叶性肺炎 中耳炎、乳突炎、 副鼻窦炎、脑膜炎
溶血素
神经氨酸酶
（三）诊断与防治
1、微生物学诊断：
标本采集：痰液、脓汁、血液、脑脊液
检测方法：涂片镜检
分离培养：血平板+鉴定试验
2、防治：
疫苗：多价荚膜多糖疫苗
抗菌素：青霉素（耐药菌株日益增多），头
孢菌素类等。
2．存放地点：通风不良氧分压低易形成肠毒素；
3．食物种类：含蛋白质丰富，水分多的食物
特性：小分子蛋白质，耐热，耐蛋白酶。
中毒机制 ：
1．作用于胃肠粘膜，引起充血、水肿、甚至糜烂
等炎症改变及水与电解质代谢紊乱，出现腹泻
2．刺激迷走神经的内脏分支而引起反射性呕吐。
UP
2、所致疾病
1、化脓性疾病
（1）局部感染：疖、痈、毛囊炎、伤口化脓等。 （2）全身性感染：败血症、脓毒血症等。
脓液及创伤感染分泌物的细菌学检验
标本的形态学检验
1.湿片检查 脓液标本或以无菌生理盐水稀释的标 本，加盖盖玻片。或取一滴脓液于载玻片上，然后 滴加一滴卢戈碘或0.1%亚甲蓝染液混合，加盖盖 玻片。用高倍镜观察细胞和细菌的分布、细菌的数 量和运动特性等情况。 2.固定染色检查 将标本制成涂片，进行革兰染色 或抗酸染色，必要时再加其他染色方法，用油镜观 察细菌形态结构及染色特征。
采集方法
3.特殊类型化脓性炎症 ①导管治疗引起的感染， 无菌操作将导管尖端用无菌生理盐水或培养基冲洗， 洗液立即送检培养，应同时采血培养。②蜂窝组织 炎、坏疽，用无菌生理盐水或75%乙醇擦拭清洁感 染部位，然后用注射器将少量无菌生理盐水注入病 灶，自病灶中心抽取标本。③烧伤感染部位细菌定 量培养，清洁感染部位后清创，切取3～4mm3的 活组织块送检。④手术切口部位感染，以注射器抽 取脓液或将拭子插入伤口深处采集标本。
细 菌 检 验 操 作 流 程
2.病原菌的鉴定
（1）形态染色特征鉴定 根据患者的临床表现、 细菌的形态染色特点，可以初步判断出细菌的类 属，有些细菌的特殊形态特点具有鉴定意义。如 泌尿生殖道来源的标本中，发现双肾或咖啡豆样， 凹面相对，无动力，无芽胞，或有荚膜的革兰染 色阴性双球菌时，可以判定是淋病奈瑟菌。
2.病原菌的鉴定
（4）分子生物学鉴定 分子生物学技术方法可用 于检测纯培养菌株，还可以直接检测未经分离培 养的标本中的细菌。有多种技术类型可供选择， 目前临床标本检测常用的主要是聚合酶链式反应 （PCR）方法。
2.病原菌的鉴定
（5）药物敏感试验 获得纯培养菌株或疑似致病 菌的优势生长菌株后，应该尽快通过药物敏感试 验选择有效药物，在大面积烧伤感染或脓毒血症 等危重疾病时显得尤为迫切。
标本的分离培养
化脓性细菌
第十章化脓性细菌(purulent bacterium)一、概念：化脓性细菌是一类能够感染人体并引起化脓性炎症的细菌。
二、分类：1．化脓性球菌：G+，葡萄球菌属，链球菌属G-，脑膜炎奈瑟菌，淋病奈瑟菌2．化脓性杆菌：G-，大肠埃希菌属，假单胞菌属第一节葡萄球菌属(Staphylococcus)在自然界分布广泛，是最常见的化脓性球菌。
模式代表菌株：金黄色葡萄球菌(S. aureus)一、生物学性状1．形态与染色：G+球菌，典型排列方式为葡萄串状，无特殊结构（体外）2．培养特性温度：28-38℃（37℃）；pH：4.5-9.8（7.4）培养基：普通培养基生长良好.血琼脂平板上生长繁茂并形成全透明溶血环（β溶血）菌落：中等大小（1-2mm），圆形，光滑，不透明，各种脂溶性色素3．生化反应4．分类根据色素，生化反应等不同类型，分为三种：主要性状金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌菌落色素金黄色白色白色或柠檬色血浆凝固酶＋－－α溶血素＋－－SPA ＋－－甘露醇发酵＋－－致病性强弱无5．抗原结构（1）葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A, SPA）性质：①细菌细胞壁的表面蛋白②可与人类、豚鼠、小鼠等多种哺乳动物IgG的Fc段非特异性结合，结合后的抗原抗体复合物有以下作用：a.抗吞噬b.损伤血小板，引起超敏反应c.可用于协同凝集试验（2）荚膜：黏附作用（3）多糖抗原：存在于细胞壁，为磷壁酸中的组分，分为两群A群――金黄色葡萄球菌B群――表皮葡萄球菌 (S.epidermidis)6．抵抗力（1）抵抗干燥，热（80℃，30min），盐（10-15％）（2）碱性染料敏感（结晶紫，龙胆紫）（3）耐药菌株迅速增多二、致病性（一）致病物质1．侵袭力（1）表面结构：SPA，荚膜等（2）酶类：①凝固酶(coagulase)：能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质。
是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。
医学微生物学实验指导
1．通透性学说革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。
2．等电点学说革兰阳性菌等电点（pI 2 ~3）比革兰阴性菌（pI 4 ~5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。
2．革兰染色：
⑴初染：将已固定的涂片标本，加结晶紫染液于涂面上染色1 min，然后水洗。
⑵媒染：加革兰氏碘液媒染1 min，水洗。
⑶脱色：滴加95%酒精，频频摇动载玻片，斜持载玻片，使脱下的染液流下，再次滴加酒精脱色，直至流下酒精无色或稍呈淡紫色为止，水洗。
⑷复染：用稀释复红或沙黄染液复染30 s至1 min，水洗，自然干燥或吸水纸印干。
3．观察结果：
用油镜观察染好后的标本片，记录所见结果，染成紫兰色者为革兰氏阳性菌，染成红色者为革兰氏阴性菌。
注意事项
1．玻片一定要清洁无油。
2．加生理盐水切莫贪多以免难于干燥，涂片要均匀且薄。
3．固定标本时切勿过热，以免菌体变形。
4．要掌握好染色时间，尤其是酒精脱色的时间，不宜过长或过短，以脱色至涂片为灰色为宜。
高等医学院校实验教材
医学微生物与免疫学
三峡大学医学院病原生物与免疫学教研室
二00五年六月
高等医学院校实验教材
医学微生物与免疫学
实验指导
主编韩莉
副主编张昌菊宋利琼
编者（以姓氏笔画为序）
王磊朱平刘嘉刘英
宋利琼吴红艳杨建林周永芹
张颖张昌菊韩莉
三峡大学医学院生物病原部
2005年6月29日
前言
本教材由医学微生物学和医学免疫学两部分组成，通过实习课教学使学生了解和掌握医学微生物学、医学免疫学的基本实验技能操作和基本研究方法，同时也能获取相应的感性知识。为培养学生的思维能力和独立操作能力，在进行设计性实验课教学时，学生也能利用本实习指导作为工具，顺利地进行实验操作，以节省学生获取知识的时间。为此目的，对每项实验的目的及实际意义都有所交代，对实验结果的观察与分析，也予以必要的辅导。限于教学时数和条件，有些内容将以示教、电视或电影教学方式教学，这部分尤其需要加强复习，以弥补未能亲自操作之不足。有关实验课的改革设想，仍须不断地接受实践考验，发扬成绩克服缺点，以不断地充实和提高。
化脓性细菌
C反应蛋白(C reactive protein，CRP)所沉淀，CRP正常人只含微 量，急性炎症时剧增，故可用C多糖测定CRP，辅助诊断活动性风 湿热（急性炎症）
3. 分解菊糖
4. 抵抗力
– 较弱，对一般消毒剂敏感
– 对青霉素、红霉素敏感
– 表皮葡萄球菌 – 腐生葡萄球菌
金黄色色素，致病菌 凝固酶（+） 耐热核酸酶（+） 甘露醇（+） SPA （+）
白色色素，条件致病菌
白色或柠檬色，不致病
三种葡萄球菌的主要性状
性状 色素 血浆凝固酶 α溶血素 耐热核酸酶 SPA 磷壁酸类型 分解甘露醇 致病性
金黄色葡萄球菌 金黄色 + + + + 核糖醇型 + 强
2.直接涂片染色镜检 3. 分离培养与鉴定
鉴别试验：胆汁溶菌试验 菊糖发酵试验
4. 动物试验
小白鼠毒力试验：肺炎链球菌阳性，甲型链球菌阴性
（四）防治原则
• 由于肺炎球菌对多种抗生素敏感，早期治 疗通常患者可很快恢复
• 青霉素G为首选治疗药物
第三节 奈瑟菌属
奈瑟菌属（neiseria）主要寄居在人类的鼻咽部、胃 肠道和泌尿生殖道，一般不致病。
（二）培养特性
– 营养要求不高，耐盐（10%）
– 需氧或兼性厌氧 – 液体培养基中呈均匀混浊生长 – 固体培养基中菌落特征
有色菌落: 金黄色、白色、柠檬色 血平板: 透明溶血环
– 能缓慢分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖产酸 致病菌触酶阳性、分解甘露醇
（三）分类 根据色素、生化反应分3种
– 金黄色葡萄球菌
– 甲型溶血性链球菌(α-hemolytic streptococci) – 乙型溶血性链球菌(β-hemolytic streptococci) – 丙型链球菌(γ-streptococci)
脓汁和粪便标本中病原菌的检测
脓汁和粪便标本中病原菌的检测（作者：bibi）目的从脓汁和粪便标本中分离、培养和检测病原体。
方法培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定。
结果脓汁标本形成黄、白两种颜色菌落，均为革兰氏阳性菌，均对青霉素和链霉素敏感；粪便标本形成紫黑和粉红色两种菌落，均为革兰氏阴性菌，对青霉素不敏感，对链霉素敏感。
四种细菌均对广谱抗菌素庆大霉素敏感。
关键词：脓汁粪便微生物细菌菌落生化鉴定药敏试验引言：常见的化脓性病原菌有葡萄球菌、链球菌、淋球菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、假单胞菌、流感杆菌等。
浓汁标本在做细菌分离培养的同时，均须直接涂片检查，观察是否有典型形态的菌体，芽孢有无，为临床提供最初的诊治依据。
粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌属、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。
粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基（如SS、伊红美蓝平板、碱性蛋白胨水），尽可能抑制杂菌，以利于病原菌的检出。
这次实验我们从浓汁标本中检出的是金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌，从粪便标本中检出的是大肠埃希菌、痢疾志贺菌。
更重要的是我们了解了，医学微生物学主要的研究方法和手段，掌握了微生物试验的基本技能和基本原理，树立了牢固的无菌观念。
同时培养学生自学能力、科学思维能力、动手能力和表达能力。
培养学生从临床标本中分离细菌以查找与疾病有关的病原体，为临床治疗预后调查提供一定的价值1.实验器材：接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯 CX21型生物显微镜、1500W电炉、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵管、灭菌平皿、试管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋、尺子2.实验方法：2.1培养基的制备、消毒和灭菌培养基制备的一般程序：①调配→溶化→矫正pH →分装→灭菌→检定→保存。
微生物学实验设计_案例导入_皮肤化脓性病原菌的分离和鉴定
化脓性球菌的防治原则
注意个人卫生，要及时用消毒药物处理皮肤创伤（如碘酊）等 预防交叉感染，减少同带菌者或有相似症状的人有皮肤接触，
可疑体现在： （1）菌落周围出现溶血环 （2）菌落颜色为金黄色
生物化学反应鉴定： 甘露醇分解试验（+） 血浆凝固酶试验（+） 耐热核酸酶试验（+）
血清学检测SPA：协同凝集 试验（+）
引起皮肤化脓 性感染的细菌 为金黄色葡萄
球菌
致病性葡萄球菌的鉴定—血浆凝固酶实验
实验原理：许多病原性的葡萄球菌菌株在代谢过程中能产 生一种血浆凝固酶样物质，可使含有枸橼酸钠或肝素抗凝 剂的兔或人血清发生凝固，而非致病病株一般不产生此酶， 故凝固酶可作为鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。
勤洗手，勤洗澡，对于脸部的化脓，不要将其抓破或挤出，因 脸部的化脓位于危险三角区及其附近，极易引起颅内感染引起 严重后果 由于金黄色葡萄球菌易产生耐药性，治疗因根据药敏实验结果 针对性的选用窄谱抗生素，防止耐药性菌株扩散 对于反复发作的顽固性疖疮，宜采用自身菌苗进行人工自动免 疫，有一定疗效（原理是重建皮肤微生态平衡，粪菌移植也是 运用这个原理） 少熬夜，养成正常的作息习惯，多吃蔬菜水果，帮助机体恢复
皮肤化脓性病原菌的分离与鉴定
案例导入
机械学院王斌同学皮肤表面有一化脓感染病灶， 经久不愈。请设计一个方案：从脓汁中分离、鉴定 化脓性病原菌，并提出防治原则。
分析原因
皮肤表面的正常细菌群：皮肤表面常见的细菌有类白喉杆菌、凝固酶 阴性葡萄球菌、丙酸杆菌、假单孢菌、分枝杆菌、变形杆菌、大肠埃 希菌、不动杆菌、克雷伯菌等
脓汁和粪便标本中病原菌的检测
脓汁和粪便标本中病原微生物的检测[摘要]通过革兰氏染色并在油镜下观察细菌形态结构、细菌的生化反应和细菌的血清学反应等手段区别和鉴定脓汁标本中和粪便标本中细菌，检测病原微生物，并进行细菌药物敏感性试验。
[关键词]脓汁标本、粪便标本、分离培养、革兰氏染色、细菌生化反应鉴定、细菌动力学试验、细菌血清学试验、细菌药物敏感性试验前言医学微生物学检查的目的是通过病原体的分离鉴定及检测病人的免疫应答等，以达到对传染性疾病做出病原学诊断，并根据实验室检查结果进行合理的药物治疗与防护。
临床的标本常含有很多杂菌，必须进行分离和纯化。
常见的化脓性病原菌有葡萄球菌，链球菌脑膜炎球菌等。
脓汁标本在做细菌分离培养的同时，均需直接涂片检查，观察是否有典型形态的菌体、芽孢有无，为临床提供最初诊断。
粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基，尽可能抑制杂菌，以利于病原体的检出。
通过革兰氏染色并在油镜下观察细菌形态结构、细菌的生化反应和细菌的血清学反应等手段可以区别和鉴定细菌的种类。
细菌药物敏感性实验可以防止细菌产生耐药性和确保治疗效果，同时也为细菌种类的鉴别提供了佐证。
1.材料与方法1.1培养基制备1.11材料天平、称量纸、药勺、干粉培养基、酒精灯、三角烧瓶、量筒、试管、试管架、5ml吸管、吸头、棉塞、标签纸、牛皮纸、皮筋1.12方法称取一定量的肉汤培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸一次，趁热分装；称取一定量的营养琼脂培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸三次（煮至刚刚冒泡，立刻置于台面，半分钟后再煮），使完全溶解，趁热分装。
（平板培养基：以无菌操作，倾注平皿10ml，琼脂完全凝固后，平板倒放，4℃冰箱保存备用。
斜面培养基：培养基趁热斜放，培基不超过试管长度的2/3，琼脂凝固以后，4℃冰箱保存备用。
）贴上标签后灭菌使用。
1.2细菌分离培养1.2.1材料脓汁标本、粪便标本、普通营养琼脂培平板、伊红美蓝琼脂平板、接种环、酒精灯1.2.2方法接种前，接种环烧灼灭菌。
医学微生物学 实验考试
单染色1、涂片：用接种环沾取细菌培养液，在玻片上涂成直径约为1.0cm 的菌膜。
（Tip:菌量不宜过多，以免标本过厚，影响染色结果）2、干燥：最好在室温中自然干燥，也可在远离火焰上方微微烘干，但切勿靠近火焰以免烤焦标本。
（注意：如烘干，以玻片不烫手为宜。
）3、固定：火焰固定。
将标本涂片在火焰外层内来回通过3次。
固定的作用一是杀死细菌，同时可改变对染料的通透性（因为活的细菌一般不让各种染料进入细胞内）。
再者使细菌与玻片粘附牢固，三是使细菌蛋白凝固后保持其固有的外形。
4、染色：滴加结晶紫、稀释复红或碱性美兰液1～2滴，使染液盖满涂膜，1～2分钟后，用细小流水洗去多余的染液，在空气中自然干燥或用吸水纸轻轻吸干（切忌拖、拉）。
5、镜检结果：用结晶紫染色的细菌葡萄球菌、大肠杆菌呈紫色；用复红染色者均为红色；用碱性美兰染色者均为蔚蓝色。
复染革兰染色法过程：初染：结晶紫1分钟媒染：碘液1分钟脱色：95%酒精半分钟复染：稀释复红半分钟每步染色完后均需水洗。
葡萄球菌的革兰染色变形杆菌的革兰染色链球菌的革兰染色紫碘酒红一一半半球阳杆阴阳紫阴红注：脑淋卡白抗孢除外过程1、涂片：用棉签或接种环沾取细菌培养液，在玻片上涂成直径约为1.0cm 的菌膜。
2、干燥：最好在室温中自然干燥，也可在远离火焰上方微微烘干。
但切勿靠近火焰以免烤焦标本。
3、固定：火焰固定。
4、革兰染色过程：初染：结晶紫1分钟媒染：碘液1分钟脱色：95%酒精半分钟复染：稀释复红半分钟5、镜检：球阳杆阴阳紫阴红化脓性球菌分离鉴定化脓性球菌主要有葡萄球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。
触酶实验原理：产生过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和氧分子-出现气泡。
操作步骤：在洁净玻片上滴一滴生理盐水，用接种环取少许细菌培养物与生理盐水中乳磨均匀，然后加3％过氧化氢数滴；或直接滴加3％过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。
结果观察：有大量气泡产生者为阳性。
化脓性球菌的分离鉴定
葡萄球菌的鉴定
• ii.SPA菌诊断液的制备即将上述稳定液与已知的抗血清结合。 1) 取10%SPA菌稳定液1ml，离心弃上清，再用PBS洗菌体一次，并加PBS至
1.2 固体培养基菌落性状观察 在营养琼脂平板上，葡萄球菌菌落性状：菌落直径1~2mm，
圆形、凸起、边缘整齐，表面光滑、湿润、不透明的菌落。根据 其产生的色素不同，可分为：金黄色葡萄球菌—菌落金黄色，表 皮葡萄球菌——菌落呈白色或柠檬黄色（含白色葡萄球菌，柠檬 色葡萄球菌）
在血平板上，金黄色葡萄球菌菌落呈金黄色且周围可形成完 全透明的溶血圈（β溶血）；而白色、柠檬色葡萄球菌菌落周围则 无溶血圈。
用生理盐水以适当比例稀释脓汁，以平板划线分离培养 法分别接种在血平板及营养琼脂平板上，在37℃恒温培养 箱中培养过夜；次日，观察营养琼脂平板及血平板上菌落 性状，并挑单克隆菌落至营养肉汤培养基中培养18~24h；
3.革兰染色
取洁净玻片一张，在玻片中央滴一小滴菌液，均匀涂布、 自然干燥并固定后进行革兰染色（或直接取脓性分泌物涂 片染色镜检）
1ml，悬浮菌体，然后加沙门氏菌AFO多价血清0.1ml，(注：血清预先放56℃水浴加 热30min，进行灭活处理)。SPA菌和血清充分摇匀，放37℃水浴中作用30min，此间 应不断振摇，以保持菌体呈悬浮状态，以利于菌体与IgG结合。
2) 将与抗体结合后的SPA菌液以3 000 r/min的转速离心15min，弃上清，并用 PBS悬浮菌体洗离2次，以洗去未给合的剩余血清，最终加含0.05%～0.1%NaN3的缓 冲盐水10ml。这种菌悬液即为1%标记的SPA菌诊断液。 • 在制备稳定液、诊断液的过程中，应同时作不含A蛋白的葡萄球菌及含A蛋白葡萄
一株猪源化脓隐秘杆菌的分离与鉴定
养猪 Ｓ Ｎ Ｒ Ｄ ＴＯＮ ＷＩ Ｅ Ｐ Ｏ ＵＣ Ｉ
一
株 猪 源 化 脓 隐 秘 杆 菌 的 分 离 与 鉴 定
陈 蕾 朱 玲 徐 ， ， 凯 刘孟 良 ， ， 代洪波
６ １０ ） ４ ００
文章编号：０ ２ １５ （０ ｏ 一 １ ０ １０ — ９ ７２ １）５ Ｏ １ ２ １ １－
１ 病 原 菌 的分 离与 纯化 ． ２
将 无菌采集 的病 死猪肺脏划线接 种 Ｔ Ａ平 板 ， Ｓ ３ ７℃需氧培养 ４ ８ｈ后挑取单菌落进行纯 化培养 ， 直
收 稿 日期 ：０ １ ０ — ８ ２ １－ ８ ２
作 者简介 ： 陈
蕾（ ９ ９ ） 女 ， １ ８ 一 ， 四川邛崃人 ， 在读 硕士研 究生 ， 研
１ 材 料 和 方 法 １ 试验材料 ． １ １ ． 病料来源 四川 内江某猪场暴发一种 以病死 ．１ １
到菌落 形态稳 定一致 ， 保存菌 种。 ‘
１３ 染 色镜 检 ．
பைடு நூலகம்
挑取单菌落进行 革兰 氏染色 ，在光学显 微镜 下 观察细 菌的形态特 征。
１ 分 离茵 １Ｓ ｒ Ｎ 的 Ｐ Ｒ测 序 鉴 定 ． ４ ６ Ｄ Ａ Ｃ
（． Ｉ １ 四川 农业大学动物医学院 ， 四川 雅 安
中图分类号 ：８ ８２ ２６ ＋ ￥ ５ ．８ ．１ ４
６ ５１；． ２ ０ ４ ２四川省 内江市畜牧食 品局 ， 四川 内江
文献标志码 ： Ａ
摘 要： 四川 内江某猪 场发 生疾病 ， 病猪 的肝 、 出现化脓性结 节， 出血性肿大 ， 肺 脾 无菌采 集病猪 的 病 变组织进行 细菌分 离 ， 到 １ 革兰 氏阳性菌 ， 得 株 形态 多样 ， 呈球状 、 杆状或棒 状 ， 在或成 丛排 单 列， 该菌在 Ｔ Ａ平板 上生长缓慢。经细菌分离培养 、６ Ｎ Ｓ １ Ｓｒ Ａ鉴定 、 Ｄ 动物致病性试验 等 ， 结果显 示 该株分 离菌为致病性化脓 隐秘杆菌。 药敏试验 显示 ， 该分离菌对头孢 呋肟 、 氨苄西林 、 卡那霉 素、 四 环 素、 氟苯尼考 等药物有不 同程度 的敏感性 ， 对于指 导临床用 药具 有积极 的意义。
药敏实验(1)
而染色体外的遗传物质——质粒DNA和转位因子
等，对细菌的遗传与变异也起着重要的作用。
质粒是环状闭合的双链DNA ，经人工抽提后 可变成线状或开环状。质粒基因可编码很多重要 的生物学性状，其中，耐药性R质粒可以通过细 菌间的接合传递某些信息，使细菌对抗菌药物或 某些重金属盐类产生耐药性。质粒可以自我复制， 也可自行丢失或消除。
细菌的变异可分为遗传性与非遗传性变异。 遗传性变异是细菌的基因结构发生了改变，如基 因突变或基因转移与重组等所以又称之为基因型 变异；非遗传性变异是细菌在一定的环境条件影 响下产生的变异，其基因结构未改变，故又称之 为表型变异。基因型变异常发生于个别的细菌， 不受环境因素的影响，变异发生后是不可逆的， 产生的新性状可稳定的遗传给后代。而表型变异 易受环境因素的影响，凡是在此环境因素作用下 的所有细菌都出现变异，而且当环境中的影响因 素去除后，变异的性状又可复原，表型变异不能 遗传。
3. 用灭菌镊子取无菌黑纸片夹放到平板正中 4. 将平板放到紫外线下照射30分钟 5. 照射后放37℃孵箱培养 6. 观察结果 7. 注意操作中始终保持无菌操作
遗传与变异是所有生物的共同生命特征。遗传 使生物的性状保持相对稳定，且代代相传，使其种
属得以保存。另者，在一定条件下，子代与亲代之
间、子代与子代之间的生物学形状可以出现差异，
3. 脓汁标本（乙型链球菌、致病性金葡菌 各1支/6人）
空气中细菌的检查
菌落计数的方法
据推算，每100cm² 培养基在空气中暴露5分钟，其 表面接受自然沉降的细菌数约相当于10升空气中 所含的细菌量。 每块平板的菌落数=4块平板的菌落总数/4
100cm² 面积培养基上的菌落数=（每块平板的菌落 数/ π r² ）x100 每m³ 空气中活菌数= （100cm² 培养基上菌落平均 数/30）x1000
常见病原性细菌的分离鉴定方法1
在载玻片两端滴加生理盐水一滴，用 接种环挑取待检菌(金葡菌、白葡菌)， 分别与它们研磨、混匀，滴加兔血浆1滴， 立即观察有无凝固颗粒，若有即为阳性。 此法用于测定结合型凝固酶。
二、链球菌属
葡萄球菌菌落观察（教师示教）
分别取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球 菌培养物，用分离划线方法接种血平板， 置37℃培养，18h～24h以后观察结果。
血琼脂平板中18h-24h后形成圆形隆 起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明 的菌落，不同菌种可产生金黄色、白色或 柠檬色色素。某些菌种（株）有溶血现象。
血浆凝固酶试验（教师示教）
（学生操作 ）
小结
1.一般细菌的鉴定流程 2.化脓性球菌的鉴定方法
一般细菌的鉴定流程 细菌学检验Biblioteka 采集标本和注意事项的一般程序
分离与培养 1.培养基的选用
2.培养方法
3.无菌操作
细菌的鉴定 1.涂片，革兰染色，镜检
2.生化反应
3.血清学鉴定
化脓性球菌的生物学性状
葡萄球菌 链球菌（肺炎球菌） 奈瑟菌属
麦芽糖发酵试验：分别取脑膜炎球菌、 淋球菌接种于麦芽糖发酵管中，置 37℃24h～48h观察结果。
细菌学检验的一般程序
涂片染色
初步诊 断报告
增菌
快速诊 断试验
接种平板培养基，分离单个菌落
挑取可疑菌落
涂片染色
各种鉴定试验
生化试验 血清学实验 动物试验 药敏试验
明确诊断报告
血液标本
革兰染色 染色性 形状排列
血平板分离培养 溶血现象、革兰染色
初步诊断
血液标本中常见化脓性球菌的分离培养与鉴定一
标本中可疑菌的鉴定
9）杆菌肽敏感试验 抑菌圈直径＞ 10mm， 敏感 抑菌圈直径≤ 10mm，耐药
A群链球菌 “敏感”
药物敏感试验
检测分离 菌株对各种药物 的敏感性，为临 床治疗提供依据
Diameter of zone of inhibition(mm)
Antibiotic Resistant Intermediate Sensitive
培养基的制备
血液琼脂培养基的制备
将灭菌后的普通琼脂培养基，冷却至50℃左 右，以无菌操作加入5-10%的脱纤维羊血，轻轻 摇匀（避免产生气泡），分装无菌试管或平皿， 凝固后，即成。
血液标本采集
基本原则
即刻采集、在抗菌药物使用前 在病人发热初期或发热高峰时采集 采血量：成人5-10ml、儿童3-5ml、婴儿1-2ml
Penicillin G ≤20
(S*.aureus ≤11 E.coli)
21～28
≥29
12～21
≥22
Streptomycin ≤11
12～14
≥15
Amikacin ≤14 Cefradine ≤14
15～16
≥17
15～17
≥18
Minocyline ≤14
15～18
≥19
七、实验报告
设计检验程序 记录主要实验步骤和实验现象及结 果，根据实验现象、结果进行分析，得 出结论 如不能完成鉴定，或结果异常，试 分析原因
培养基的制备
基础培养基（营养肉汤） 牛肉膏 0.3% 蛋白胨 1% NaCl 0.5% pH 7.2-7.6
营养琼脂：营养肉汤添加1.5%琼脂 半固体培养基：营养肉汤添加0.25%琼脂
培养基的制备
医学微生物学实验指导
微生物学各论自学提纲……………………………………………59
第二篇医学免疫学
实验一天然免疫功能的检测（综合性实验）……………………60
实验二常见抗原抗体反应（综合性实验）………………………67
实验三细胞免疫检测I：细胞因子的检测（设计性实验）………86
1．皮肤破损：先除去异物，用生理盐水或蒸馏水洗净后，涂2 %红汞或2 %碘酊。
2．烧伤：局部涂凡士林、5 %鞣酸或2 %苦味酸。
3．化学药品腐蚀伤：强酸--先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶液洗涤中和。强碱--先用大量清水冲洗，再用5 %硼酸溶液洗涤中和。如受伤处为眼部，经上述步骤处理后，用橄榄油或液体石蜡1～2滴滴眼。
三、细菌动力的观察（悬滴法）
许多杆菌、弧菌具有鞭毛，有动力，在液体中能从一个地方较快速地移动到另一个地方。一般球菌无鞭毛，没有动力，但受到所处环境中液体分子的冲击而仅呈位置变更不大的颤动。
四、电镜观察细菌的菌毛
电子显微镜是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。
第二篇医学免疫学
实践教学是课程建设的重要环节，培养和提高学生的综合素质与创新能力重要途径。在免疫学实验教学中我们大力改革实验教学的形式和内容，将免疫学的16学时实验内容分为两大部分，第一部分为综合性实验，包括了解天然免疫的组成与生物学功能的检测；常见体液免疫检测指标的设计，使学生能较熟练应用基本的免疫学实验技术，能针对不同的临床病例开展相关免疫学项目的基本检测，并对检测结果进行合理的临床解释和分析。为了学生既能适应一般临床与科研工作，又具有一定的创新工作能力。第二部分我们开设设计性实验：市场有某一生物制剂有免疫增强作用，请设计实验方案证实。在这部分内容要求同学们初步掌握从不同角度证实某产品有免疫增强作用的实验设计，掌握与了解常见细胞免疫的检测技术和应用（ELISA检测细胞因子）、免疫标记技术的种类、原理、特点、应用、淋巴细胞分离记数技术、淋巴细胞增殖等实验。
第一节化脓性球菌
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（2）葡萄球菌溶血素： 有五型，对人致病的主要是 溶血素。
作用：溶血，损伤多种血细胞及组织细胞 （3）杀白细胞素：
攻击中性粒细胞和巨噬细胞的细胞膜。 表现：白细胞运动能力丧失，胞内颗粒排
除，细胞死亡。
法。
2、熟悉常见病原性球菌所致疾病及实验室检查方
3、了解各种病原性球菌标本采送原则及防治原则。
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化脓性球菌：因病原性球菌主要引起化 脓性炎症 主要包括：
革兰阳性菌：葡萄球菌，链球菌，肺炎链球 菌
革兰阴性菌：脑膜炎奈瑟菌，淋病奈瑟菌
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一、葡萄球菌属 (staphylococcus)
是最常见的化脓性球 菌
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（2）根据抗原分类
荚膜
细胞壁 蛋白质
肽聚糖 细胞膜 细胞质
根据蛋白抗原 进一步分类
M抗球菌）
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5、抵抗力：本菌抵抗力不强， 60℃30分钟即被杀死，对一般消毒剂敏感。 乙型溶血性链球菌对青霉素、红霉素、磺 胺等敏感。青霉素是链球菌感染的首选药 物。
(2)毒素性疾病 食物中毒 葡萄球菌性肠炎(假膜性肠炎) 烫伤样皮肤综合征 中毒性休克综实用文合档 征（TSS）
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(三)、微生物检查法
1、标本 脓汁，血液，剩余食物，呕吐物等
2、直接涂片镜检 革兰阳性葡萄球菌
3、分离培养 生长现象
生化反应
毒素检查
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色素，溶血，
血浆凝固酶 发酵甘露醇 耐热核酸酶
名称 溶血 溶血
类别
致病性
血液标本中常见化脓性球菌的分离培养与鉴定一
会引起感染，如心内膜炎和血流感染等。
03
分离培养与鉴定
表皮葡萄球菌在血平板上形成圆形、表面干燥、凸起、灰白色至棕色的
菌落。通过染色镜检和生化试验可对表皮葡萄球菌进行鉴定。
溶血葡萄球菌
生物学特性
溶血葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，直径约1μm，常呈双排列。在固体培养基上生长的菌落直径约1mm，圆形、不透明， 边缘整齐，表面光滑、湿润、凸起、无色。
致病性
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎 、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。
分离培养与鉴定
金黄色葡萄球菌在血平板上形成圆形、表面光滑、湿润、凸起、不透明的菌落，菌落周围 可形成完全透明的溶血环。通过染色镜检和生化试验可对金黄色葡萄球菌进行鉴定。
接种工具
使用无菌接种环或针头将血液标 本接种到培养基上。
接种方法
将血液标本均匀涂布在培养基表面， 或用划线法接种，以促进菌落的生 长。
防止交叉污染
在接种过程中，要严格遵守无菌操 作规程，避免交叉污染。
培养条件
温度
化脓性球菌的生长需要适宜的温 度，一般为35-37℃。
湿度
保持培养箱内的湿度，以防止培 养基干燥。
致病性
溶血葡萄球菌可引起人类和动物感染，如尿道炎、前列腺炎、伤口感染和心内膜炎等。其致病力可能与产生毒素和其 他毒力因子有关。
分离培养与鉴定
溶血葡萄球菌在血平板上形成圆形、表面光滑、湿润、凸起、无色的菌落，菌落周围可形成完全透明的 溶血环。通过染色镜检和生化试验可对溶血葡萄球菌进行鉴定。
06
血液标本中化脓性球菌的感 染与防治
血液标本中化脓性球菌的分离培养与鉴定是临床微生物学实验室的重要工作之一 ，对于及时诊断、治疗和预防疾病具有重要意义。
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录像：消毒灭菌 操作： 1. 紫外线杀菌实验（普通平板 1块/3人） 2. 抗生素敏感试验（普通平板 1块/3人） 3. 化脓性球菌分离鉴定（一）—— 接种血平板 材料：
1. 抗生素纸片（青霉素、链霉素、庆大霉素、黄连素 1套/6人） 2. 大肠杆菌、敏感金葡菌（1支/6人） 3. 脓汁标本（乙型链球菌、致病性金葡菌 各1支/6人） 4. 普通平板、血平板、黑纸片等
思考题
1. 临床上耐药性菌株感染，如何确定其治疗用药？ 2. 抗生素耐药性实验的结果是如何判定？
高压蒸汽灭菌法：
高压蒸汽灭菌法的杀菌效果最好，运用广泛。
优点：1.能够达到较高的温度。 2.穿透力强。 3.蒸气遇冷物凝成水时可放出汽化热， 迅速提高冷物的温度。 4.高压蒸气不会使物品过分潮湿，避 免了水煮的缺点。
物理消毒灭菌法：
干热灭菌法：焚烧、烧灼、干烤（170℃/2h） 热力灭菌法
湿热灭菌法：巴氏消毒法、流动蒸汽消毒法、
煮沸法、间歇蒸汽灭菌法、高压蒸汽灭菌法
紫外线
电磁波辐射杀菌法
滤过除菌法
电离辐射
超声波杀菌
干燥
化学消毒灭菌法：使用消毒剂
原理：
1.使菌体蛋白质变性或凝固：酚类、醇类、重金属 盐等。如石炭酸、来苏、洗必泰
灭菌(sterilization):杀灭物体上所有微生物的 方法。
防腐(antisepsis):防止或抑制细菌生长繁殖的方法， 细菌一般不死亡。同一种化学药品在高浓度时称 为消毒剂，低浓度时为防腐剂。
无菌(asepsis):不含活菌的意思。防止细菌进入人 体或其他物品的操作技术，称无菌操作。
[ 教学目标 ]
了解：各种消毒灭菌的方法及应用 无菌操作技术
掌握：1.化脓性球菌分离鉴定的方法和步骤 2.紫外线杀菌的原理 3.抗生素敏感实验的方法
[ 重点难点 ]
重点：化脓性球菌分离鉴定——接种血平板 难点：化脓性球菌分离鉴定——接种血平板
消毒与灭菌
概念：
消毒( disinfection):杀死物体上病原微生物， 并不一定能杀死含芽孢的细菌和非病原微生物。 用以消毒的药品称为消毒剂。
压力为15磅/寸2，30分钟可杀死一切芽胞，达到灭菌的目的。 （温度可达121℃ )
注意事项：
1. 高压的整个过程必须有专人守侯，并随时排气以 防压力表显示错误及其它原因引起高压锅内压力 剧增而导致爆炸。
2. 高压完毕需等待高压锅内压力降低至零时方可打 开取物。
紫外线杀菌原理:
波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用，其中 以265-266nm最强，这与DNA的吸收光谱范围一致。 紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个 胸腺嘧啶共价结合而形成双聚体，从而改变DNA的 分子构型，干扰DNA的复制与转录，导致细菌的死 亡或变异。
常见的标本有脓汁、咽拭子、痰、血液、脑 脊液等。
本次实验是以脓汁标本进行病原性球菌的分 离鉴定
ห้องสมุดไป่ตู้
化脓性球菌分离鉴定步骤
脓汁 接种 血平板 37℃ 菌落
划线法
24h
革兰染色
葡萄状排列 链状排列
血浆凝固酶试验 甘露醇发酵试验 血清肉汤管
成对排列
操作：
1. 接种血平板（1块/人） 三线法接种分离单个菌落
2.干扰细菌的酶系统和代谢：氧化剂，如过氧化氢， 高锰酸钾，过氧乙酸等
3.损伤细菌细胞膜：表面活性剂，如新洁尔灭
二、抗生素敏感试验
随着抗生素的广泛应用，耐药变异菌株日益 增加（尤其是金葡、肠道杆菌），给医疗工作带 来了不少的困难。
为正确使用抗生素，临床上常在分离致病细 菌的同时做药物敏感试验，以了解该细菌对常用 各种抗生素的敏感性。
药敏试验的常用方法：纸片法
操作：
敏感金葡
贴纸片
结果分析：
如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈 形成，敏感度越高抑菌圈直径越大：
>20mm： 极度敏感 15-20mm： 中度敏感 抑菌圈直径 10-15mm： 轻度敏感 <10mm: 不敏感 无抑菌圈：耐药
三、化脓性球菌分离鉴定（一）
化脓性炎症是临床上常见病，除了病原性球 菌外，其他微生物也可以引起化脓性感染。
紫外线杀菌实验操作
划线、盖纸、照射
电离辐射
β射线和γ射线； 产生自由基或毒性基团，干扰DNA合成,导
致酶系统功能紊乱等; γ射线有较高穿透力； 常用于一次性医用塑料制品的消毒；也用
于食品消毒，不破坏其营养成分。
注意事项:
1.穿透力弱，一般玻璃、纸、布、尘埃、水 蒸气均能阻挡。
2.适用于空气、物体表面的消毒。 3.有效距离在2米左右（紫外灯的安装） 4.紫外线对人的眼睛、皮肤有损害作用。
操作步骤：
1. 取普通平板（1块/3人） 2. 取大肠杆菌斜面培养物在平板上密集划线 3. 用灭菌镊子取无菌黑纸片夹放到平板正中 4. 将平板放到紫外线下照射30分钟 5. 放37℃孵箱培养 6. 观察结果 7. 注意操作中始终保持无菌操作