丁基苯酞对双孔钾离子通道TREK-1的作用及在低灌注脑缺血中相关药理学研究

丁基苯酞对双孔钾离子通道TREK-1的作用及在低灌注脑缺血中
相关药理学研究
双孔钾离子通道(Tandem-Pore-Domain Potassium Channels, K2P)是近年发现的一类新型钾离子通道超家族。

它们在结构上与传统的钾离子通道不同,具有独特的4次跨膜片段(M1～M4)和两个孔道结构域(P1和P2),即4TMS/2P结构。

目前发现的双孔钾通道共包括17个成员,根据结构和调节方式的不同可分为TWIK、THIK、TASK、TALK、TREK和TRESK六大类。

TREK-1是双孔钾离子通道中研究最为广泛的一类离子通道。

该钾通道电流具有自发性、无电压和时间依赖性、无失活并且对于经典的钾通道阻断剂(如4-AP、TEA、Cs+)不敏感等特性。

既往研究发现,TREK-1通道在中枢神经系统的神经元上具有特异性的分布。

它既可以被许多种物理和化学因素调节,还可以被多种神经保护剂所调节,在脑缺血、癫痫、疼痛和抑郁等多种疾病状态中发挥着重要的作用。

丁基苯酞(或丁苯酞,3-n-butylphathlide, NBP)是中国医学科学院药物研究所开发的一类新型神经保护药物,可以通过作用于脑损伤病理生理过程中的多个靶点而发挥脑保护作用。

本研究组以往研究也已表明TREK-1双孔钾通道在急性和慢性脑缺血中都发挥着重要作用。

然而抗脑缺血药物丁基苯酞是否能够调节TREK-1双孔钾通道,双孔钾通道TREK-1是否是丁基苯酞抗脑缺血中一个新的作用靶点,目前都还未见报道。

本研究中我们首先研究了丁基苯酞三种旋光异构体对TREK-1双孔钾离子通道电流的调节作用,并探讨了相关机制,然后建立了急性大鼠低灌注脑缺血损伤
模型,研究左旋丁基苯酞对TREK-1双孔钾通道基因和蛋白表达变化的影响。

第一部分丁基苯酞旋光异构体对TREK-1双孔钾通道电流的调节作用及相关机制研究1.丁基苯酞旋光异构体对TREK-1双孔钾通道电流的调节作用首先观察TREK-1
双孔钾通道的基本特性并验证花生四烯酸(AA)对TREK-1电流的开放作用。

结果表明：野生型CHO细胞(CHOWT)静息膜电位为-17.6±4mV(n=7),而稳定转染了TREK-1通道(TREK-1/CHO)后可将细胞的膜电位超极化到-55±2.36
mV(n=25,P<0.001)。

全细胞膜片钳记录下,CHO上记录到的外向钾电流为pA 水平,而稳定转染TREK-1的CHO细胞上外向钾电流可达0.5-3 nA。

应用10μM AA可使TREK-1电流增大约50-70%(n=6)。

研究中我们发现,丁基苯酞(左旋,右旋和消旋体)三种旋光异构体可以浓度依赖性的抑制CHO细胞转染的TREK-1双孔钾通道,右旋(d-NBP)和消旋丁苯酞(dL-NBP)抑制TREK-1电流的IC50分别是3μM和10μM,左旋丁基苯酞(L-NBP)对TREK-1电流的抑制作用明显强于右旋和消旋体,IC 50是0.42μM。

丁基苯酞旋光异构体对TREK-1双孔钾通道的电压依赖性没有影响。

电流钳下,丁基苯酞旋光异构体可使TREK-1/CHO细胞膜电位向去极化移动,而对CHO细胞膜电位无影响。

2.左旋丁基苯酞对TREK-1通道电流的调节机制研究首先观察10μM L-NBP 对花生四烯酸激活的TREK-1电流的抑制作用；其次研究温度和丁基苯酞对TREK-1钾电流和细胞膜电位的协同作用；最后应用细胞内微透析方法观察10μM L-NBP对TREK-1 f电流调竹作用。

结果表明：10μMAA能够稳定激活转染于CHO 细胞上的TREK-1钾通道,加入浓度1,3和10μM L-NBP可使TREK-1电流分别减小15.9%、24%和28.5%,细胞外液冲洗后,电流部分恢复。

采用细胞内微透析术,全细胞记录模式下观察20 min后,TREK-1电流密度减小53%。

当细胞周围的温度从23-25℃升高到33-35℃时,TREK-1电流幅度显著增加,达到300%-400%,加入10μM L-NBP可以使电流抑制60%左右。

当温度升高到33-35℃后,CHO和TREK-1/CHO细胞膜电位都向超极化移动,绝对值升高分别为9 mV和15 mV,给与10μM L-NBP后,TREK-1/CHO细胞膜电位向去极化移动,下降约10 mV,而CHO细胞膜电位没有发生明显变化。

第二部分：左旋丁苯酞对大鼠低灌注脑缺血模型中双孔钾离子通道基因和蛋白表达的影响1.大鼠低灌注脑缺血组织病理学改变大鼠低灌注脑缺血大脑皮层、海马和纹状体HE和Nissel染色结果显示：假手术组和假手术组+左旋丁苯酞药物对照组,细胞数量较多,排列整齐规则,单个神经细胞核呈圆形,核膜清楚,核仁明显,并且两组相比较,形态学没有差别；模型组和30mg/kg L-NBP治疗组神经元细胞出现明显的减少或消失,排列紊乱,胞浆呈深染。

核膜不清楚,尼氏小体逐渐分解甚至消失,出现空泡及增生的胶质细胞。

少数细胞发生核溶解,核消失。

但是30ng/kg L-NBP治疗组与模型组相比较,神经细胞数量增多,组织形态学有一定改善。

2.大鼠皮层、海马和纹状体组织中双孔钾通道亚型TREK-1 mRNA
水平的改变应用实时定量PCR方法研究大鼠低灌注脑缺血3天后,L-NBP对大鼠皮层、海马和纹状体三个组织中TREK-1 mRNA表达水平的影响。

与假手术组相比,脑缺血后三个组织中TREK-1 mRNA表达都有不同程度的显著升高,P<0.001具有显著性差异；假手术组+左旋丁苯酞药物组和假手术组相比较,TREK-1 mRNA表达没有明显变化；30 mg/kg L-NBP治疗后,与模型组相比,皮层和海马组织TREK-1 mRNA表达水平出现不同程度的下降趋势,而纹状体组织
TREK-1 mRNA表达水平显著下降,P<0.05具有显著性差异。

3.大鼠皮层、海马和纹状体组织中双孔钾通道亚型TREK-1蛋白水平的改变蛋白免疫印迹杂交(Western blot)的方法研究了大鼠低灌注脑缺血模型中L-NBP对TREK-1通道在大鼠皮层、海马和纹状体中蛋白表达水平的改变情况。

Western blot分析显示脑缺血后皮层、海马和纹状体组织,TREK-1蛋白表达都有不同程度的显著升高,P<0.001具有显著性差异。

左旋丁苯酞药物对照组,TREK-1蛋白表达没有变化。

30 mg/kg L-NBP治疗后,与模型组相比,皮层和海马组织中TREK-1蛋白表达都有不同程度的下降,而纹状体内TREK-1蛋白出现显著下降,P<0.05具有显著性差异。

从以上结果可以得到以下结论：1. TREK-1双孔钾离子通道能够稳定细胞膜电位,对调节细胞的兴奋性发挥着重要的作用。

2.丁基苯酞三种旋光异构体可以浓度依赖性的抑制CHO细胞上转染的
TREK-1通道电流,但对通道的电压依赖性没有影响,左旋丁苯酞是TREK-1通道较强的抑制剂。

3.丁基苯酞旋光异构体可使TREK-1/CHO细胞膜电位向去极化方向移动,对CHO细胞膜电位没有影响。

提示丁基苯酞旋光异构体对细胞膜电位的影响与其对通道的抑制作用相关。

4.细胞内微透析结果及以前实验证明左旋丁基苯酞能通过细胞内和细胞外对TREK-1双孔钾通道共同发挥抑制作用。

5.左旋丁基苯酞能部分对抗由花生四烯酸引起的TREK-1通道电流的病理性激活。

6.当温度由24℃-25。

C升高到33℃-35℃度后,TREK-1电流幅度显著增加。

TREK-1/CHO细胞膜电位向超级化移动,绝对值上升,大约每升高1℃,细胞膜电位上升1-1.5 mV,细胞膜
电位与温度间存在线性关系。

但温度升高对左旋丁基苯酞抑制TREK-1通道的作用可能没有影响。

7.大鼠低灌注脑缺血模型中,30 mg/kg L-NBP治疗组对缺血后脑组织形态学有定改善,
进一步证实了左旋丁基苯肽具有抗脑缺血神经元保护作用。

8.大鼠低灌注脑缺血模型中,TREK-1双孔钾通道基因和蛋白表达都显著增加,表明该通道与脑缺血疾病有紧密关联。

9.抗脑缺血药物30mg/kg L-NBP治疗后,同与模型组相比,皮层、海马组织TREK-1基因和蛋白表达都出现下降趋势。

而纹状体组织双孔钾通道亚型TREK-1基因和蛋白表达出现显著下降趋势,
推测丁基苯酞对TREK-1通道的作用可能与抑制性神经元上的该通道的活性有关。

这很可能也是丁基苯酞发挥抗脑缺血作用的机制之一。