表达载体优秀课件
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以pET-28a表达载体PPT课件
然或近天然构象，恢复活性
CHENLI
13
以pET-28a（+）表达载体，克隆受体菌为E.coliDH5α，表 达宿主为E.coli BL21(DE3)为例简单介绍实验过程
• 构建重组表达载体 1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶
（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收 Kit或冻融法回收载体大片段。 （2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。 连接反应体系为：
CHENLI
14
• 重组蛋白的诱导
（1）挑一个转化重组质粒的单菌落接种于LB液体培养基中（含 100μg/m卡那霉素和），于37℃过夜培养。
（2）取1ml过夜培养物，转接于100ml含100μg/ml卡那霉素的LB液体培 养基中，于37℃培养1.5～2小时至对数生长期。
（3）在培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.2 mM ，按照预先建立的最佳表达条件进行诱导表达。
析柱，用去离子水进行缓慢洗脱，避免在柱床中引入气泡。
（2）用10倍柱床体积的starting buffer进行预平衡，上样， 将细胞破碎后的上清液注入Ni2+-NTA亲和层析柱中。
（3）用10倍ml的starting buffer进行漂洗，收集滤过液。 （4）开始用5倍柱床体积的含20 mM咪唑的starting buffer进
2 含T7噬菌体启动子的表达载体（例如pET系列载体） 外源基因表达受T7噬菌体RNA聚合酶调控，具有氨苄或者卡 那抗性，多克隆位点置于T7噬菌体RNA聚合酶启动子之后
3 带有&噬菌体PL 启动子的表达载体（ pPLc系列 pKC30 等） 受温度敏感性阻抑物cIts857调控，低温时能抑制PL 驱动的转录，高温不能
CHENLI
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以pET-28a（+）表达载体，克隆受体菌为E.coliDH5α，表 达宿主为E.coli BL21(DE3)为例简单介绍实验过程
• 构建重组表达载体 1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶
（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收 Kit或冻融法回收载体大片段。 （2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。 连接反应体系为：
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• 重组蛋白的诱导
（1）挑一个转化重组质粒的单菌落接种于LB液体培养基中（含 100μg/m卡那霉素和），于37℃过夜培养。
（2）取1ml过夜培养物，转接于100ml含100μg/ml卡那霉素的LB液体培 养基中，于37℃培养1.5～2小时至对数生长期。
（3）在培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.2 mM ，按照预先建立的最佳表达条件进行诱导表达。
析柱，用去离子水进行缓慢洗脱，避免在柱床中引入气泡。
（2）用10倍柱床体积的starting buffer进行预平衡，上样， 将细胞破碎后的上清液注入Ni2+-NTA亲和层析柱中。
（3）用10倍ml的starting buffer进行漂洗，收集滤过液。 （4）开始用5倍柱床体积的含20 mM咪唑的starting buffer进
2 含T7噬菌体启动子的表达载体（例如pET系列载体） 外源基因表达受T7噬菌体RNA聚合酶调控，具有氨苄或者卡 那抗性，多克隆位点置于T7噬菌体RNA聚合酶启动子之后
3 带有&噬菌体PL 启动子的表达载体（ pPLc系列 pKC30 等） 受温度敏感性阻抑物cIts857调控，低温时能抑制PL 驱动的转录，高温不能
高中生物课件《目的基因获取和基因表达载体的构建 》
d．要求
□ 模板： 23 _目_的__基__因__两__条_链___
原料：dNTP
酶：热稳定□24 __D_N_A__聚__合_酶_____(□25 ____T_aq__酶_______) 引物：人工合成的两条□26 __D__N_A__片_段______(引物 1，引物 2)
知识点一
知识点二
课时精练
②利用 PCR 技术扩增目的基因
a．PCR 含义：是多聚酶链式反应的缩写，是一项在生物体外 □19
__复__制__特__定__D_N_A__片__段______的核酸合成技术。
□ b．PCR 原理： 20 __D_N__A_双__链__复__制__。
知识点一
知识点二
课时精练
c．前提条件：有一段已知目的基因的□21 _____核_苷__酸______序列，以便根 据这一序列合成□22 ____引__物________。
知识点一
知识点二
Hale Waihona Puke 课时精练d．构建过程
知识点一
知识点二
课时精练
e ． 提 取 依 据 ： 根 据 基 因 的 有 关 信 息 ， 如 □17 _基_因__的__核__苷__酸_序__列_ 、 □18
__基__因__的__功_能_____、基因在染色体上的位置、基因的转录产物 mRNA 以及基因 的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
提示：PCR 过程中，DNA 双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶； 由于 PCR 过程温度较高，所以需要能耐高温的 DNA 聚合酶。
知识点一
知识点二
课时精练
提示
典题分析 题型一 目的基因获取方法的辨析 [例 1] 下列有关获取目的基是工作量 大，具有一定的盲目性 B．由于真核细胞的基因中含有不表达的 DNA 片段，所以一般使用人工 合成的方法获取真核细胞中的目的基因 C．如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以利用化学方法直接人工 合成 D．PCR 技术的原理是 DNA 复制，需 DNA 连接酶催化 DNA 合成
□ 模板： 23 _目_的__基__因__两__条_链___
原料：dNTP
酶：热稳定□24 __D_N_A__聚__合_酶_____(□25 ____T_aq__酶_______) 引物：人工合成的两条□26 __D__N_A__片_段______(引物 1，引物 2)
知识点一
知识点二
课时精练
②利用 PCR 技术扩增目的基因
a．PCR 含义：是多聚酶链式反应的缩写，是一项在生物体外 □19
__复__制__特__定__D_N_A__片__段______的核酸合成技术。
□ b．PCR 原理： 20 __D_N__A_双__链__复__制__。
知识点一
知识点二
课时精练
c．前提条件：有一段已知目的基因的□21 _____核_苷__酸______序列，以便根 据这一序列合成□22 ____引__物________。
知识点一
知识点二
Hale Waihona Puke 课时精练d．构建过程
知识点一
知识点二
课时精练
e ． 提 取 依 据 ： 根 据 基 因 的 有 关 信 息 ， 如 □17 _基_因__的__核__苷__酸_序__列_ 、 □18
__基__因__的__功_能_____、基因在染色体上的位置、基因的转录产物 mRNA 以及基因 的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
提示：PCR 过程中，DNA 双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶； 由于 PCR 过程温度较高，所以需要能耐高温的 DNA 聚合酶。
知识点一
知识点二
课时精练
提示
典题分析 题型一 目的基因获取方法的辨析 [例 1] 下列有关获取目的基是工作量 大，具有一定的盲目性 B．由于真核细胞的基因中含有不表达的 DNA 片段，所以一般使用人工 合成的方法获取真核细胞中的目的基因 C．如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以利用化学方法直接人工 合成 D．PCR 技术的原理是 DNA 复制，需 DNA 连接酶催化 DNA 合成
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT)【优秀课件】
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT )【优 秀课件 】
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
基因表达载体的构建课件-高二下学期生物人教版(2019)选择性必修3
二.基因表达载体的构建 【小结】 基因表达载体的组成：
启动子
终止子 标记
首端 RNA聚合酶
转录
尾端 RNA聚合酶
转录 目的基因
【变式训练】以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是( B )
A.基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的 B.基因表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNA C.基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记 基因等 D.基因表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因
获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在， 并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用。
构建基因表达载体（核心工作）
基因表达载体由哪些部分组成
二.基因表达载体的构建 ——核心步骤 1.目的
① 使目的基因在受体细胞中稳定存2016·全国课标卷Ⅰ，40)某一质粒载体如图所示，有人将此质粒用BamH Ⅰ酶切 后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用
得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被 转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了 目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
。
2.组成
启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基
因转录出mRNA。
终诱止导子型：启终动止子目：的当基诱因导转物录存的脱在氧时核，苷可酸以序列。 标激记活基或因抑：制便目于重的组基D因N的A分表子达的筛选。
目的四基环因：素能抗控性制基表因达、所氨需要苄的青特霉殊性状。 注素意抗：性目基的因基、因荧必须光插蛋入白到基启因动子与 终止子之间。
复制原点： DNA复制所需的结构。
2023届高三一轮复习生物：基因表达载体的构建、目的基因的导入课件
谢谢聆听
知新： 阅读书本P81资料卡，解决农杆菌转化法的相关问题：
资料1: 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子 叶植物和裸子植物，而对绝大多数单子叶植物没有侵染能力。
资料2: 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上 的T—DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其 整合到该细胞的染色体DNA上
图中质粒没有标明的结构是___________，该结构的作用是_____________________T。—DNA
（2）过程②常用农杆菌转化法将重组质粒导入愈染伤色组体织D，NA该方法能够借助Ti质粒上的_______
将BT毒蛋白基因整合到愈伤组织的________________________。
2、如何处理受体细胞？
吸收
Ca2+处理
3、处理后的细胞具备什么样的特点？
细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
Ca2+ 感受态细胞
【典例】下列关于目的基因导入受体细胞的方法中，不正确的是( D )
A.我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉 B.用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞 C.将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法 D.利用农杆菌转化法培育大多单子叶转基因植物
【习题检测】下图是基因工程培育抗虫植物的示意图。下列叙述正确的是( D )
A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与B．③ 侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C．④的染 色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．⑤只要表现 出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
【习题检测】玉米是二倍体植物，某科研人员将BT毒蛋白基因导入玉米细胞，培育转基因抗虫玉
《载体构建流程》课件
度。
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述
载体介绍 ppt课件
重组克隆的 “插入失活”筛选方法
pBR322—→插入在Tetr中，基因型为Tets 、Ampr—— →在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培 养基上不生长； pBR322—→插入在Ampr中，基因型为Tetr 、Amps、 ——→在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环 素培养基可生长；
cosmid（cos site-carring plasmid） 人工构建的含有λDNA的cos（cohesive-end site）
位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
柯斯质粒载体pHC79的形体图 由pBR322质粒DNA与λ噬菌体DNA的cos位点及其控制包装作用的序
列构成
cosmid vector的特点
分类： 酵母人工染色体载体（YAC） 细菌人工染色体载体（BAC） P1人工染色体载体（PAC）
酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC）
YAC的特点： 1.只能在酵母细胞中扩增 2.克隆容量大，一般为200kb-500kb 3.构建原理，按染色体结构构建
力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在 1kb-200kb以上不等。
细菌质粒的一般生物学特性
1. 很多细菌中已发现； 2. 是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大
部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异； 3. 大多数质粒的宿主范围较窄； 4. 已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷
噬菌粒载体（phagemid vector)
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载 体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）
几种常用的噬菌粒载体的一般特征
pUC118 (MCS)
基因表达载体构建优秀课件
（一 ）基因表达载体的构建
1 基因工程操作中，构建基因表达载体之目的 是什么？
确保目的基因在受体细胞中稳定存在、 复制、遗传和表达，使其发挥作用。
2 请你定义：基因表达载体构建之含义？
将目的基因、启动子和终止子科学按装 在经修饰和改造完备的载体之上。
3 基因表达载体之基本组成是什么？
（1）结构基因——即提取的目的基因核苷酸序列，负责 编码目标蛋白质。
农杆菌
农杆菌转化法示意图
农杆菌
T—DNA Ti质粒
EcoRI酶
核—DNA 目 标
目标细胞
DNA 重组
侵染 转化 转基因植物
三 将目的基因导入受体细胞
基因导入受体细胞的标志是什么？
1目的基因与载体在受体细胞共同复制、遗 传和表达。或目的基因插入细胞染色体上DNA分 子之中，随同受体细胞DNA分子复制、遗传和表 达。
2 实际上外源目的基因变成了受体细胞的一部 分，这种现象叫做转化。
2 目的基因导入受体细胞遵循的基本原理是什么？ 通常借鉴细菌或病毒侵染细胞和寄生之途径。
基因表达载体构建优秀课件
4 从苏云金芽孢杆菌细胞DNA分子中提取得到 Bt毒蛋白基因能否直接进入普通棉细胞中？ 如果把目的基因人工注射到普通棉细胞中， 那么该基因在棉细胞中会稳定存在，复制和表 达吗？
5 假如你是一个基因工程操作者，若使目的基因 进入棉细胞，并能在棉细胞中遗传和表达，你 应当采取什么办法？你能说出其中的理由吗 ？
（3）依据目的基因表达的特点和位置，用限制 酶切割受体细胞相应终止子与目的基因连 接起来，成为一个整体。
（5）将目的 基因 插入质 粒切口处，用 E•coli DNA连接酶把基因与质粒缝合起来，成功 创建一个重组DNA分子。
第三章载体ppt课件
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的
载体应该有两种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源
DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（2）长度: 约2.7kb （3）克隆位点: 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的
5’端。
（4）选择标记：Ampicillin 抗性和 lacZ的肽 互补（蓝白斑）相结合。
蓝白斑选择原理： ① Xgal ② -半乳糖苷酶Xgal显色反应：-半乳糖苷
酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一 个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 ③ lacZ的肽互补
加到1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内 部。如pDF41、pDF42、pBR329。
（5） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的 性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大 肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆 菌的转录—翻译信号控制之下。
六、其它质粒载体
1. pGEM-3Z
由pUC派生而来。与pUC的主要区别是 在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子 T7和SP6。可被T7和SP6的RNA聚合酶识 别转录。
2. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）
（1）穿梭质粒载体的结构
人工构建的具有两种不同复制起点和选 择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存 活和复制的质粒载体。
1）-肽（ lacZ’ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨
克隆载体表达载体(课件)PPT课件
详细描述
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
第5章 表达载体
西南大学生物技术专业 基因工程 1
2）终止子：依赖于ρ 因子或不依赖于ρ 因子（遇茎环结构
而终止）。
3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)：
Shine-Dalgarno (SD)序列，ATG与RBS之间的距离很重要， 一般3-11bp。
2、表达形式 完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。 融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编码区的串联体，
但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白 的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达 了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶 连两个或多个相关基因的表达。
西南大学生物技术专业 基因工程
2
3、表达的控制
诱导表达系统：IPTG 防渗漏表达系统：lacIq PL启动子受cⅠ的调控，低温(30℃)下阻抑转录， 高温(40-45℃)下解除抑制。 二、利用T7噬菌体启动子的表达载体 pET系列，表达能力强，可控性好，只受T7噬 菌体RNA聚合酶识别，不受大肠杆菌RNA聚 合酶识别，可用IPTG诱导表达。
西南大学生物技术专业 基因工程
22
2 ） 植 物 Ac-Ds 转 座 子 双 因 子 插 入 突 变 ： 玉 米 Ac (activator) 因子是一个转座子，含有完整的转 座酶， Ds (dissociation) 是 Ac 缺失转座酶基因 的缺失体，但具两端的反向重复序列。
分别构建含Ac 和Ds 的质粒载体载体并分别转化植物， 转基因植株杂交 (Ac×Ds) 后代中会发生转座事件 而产生突变体。 利用Ac-Ds序列作探针或引物克隆目标基因。
西南大学生物技术专业 基因工程 6
3 、内含肽表达载体：如 NEB 公司的 Impact-Twin 系 统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽 (intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白 酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切 除。 4 、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙， 可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠， 或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。 信号肽(signal peptide) 有碱性磷酸酶信号肽、蛋 白质 A 信号肽（如 Amersham 公司的 pEZZ18 系统）。
2）终止子：依赖于ρ 因子或不依赖于ρ 因子（遇茎环结构
而终止）。
3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)：
Shine-Dalgarno (SD)序列，ATG与RBS之间的距离很重要， 一般3-11bp。
2、表达形式 完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。 融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编码区的串联体，
但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白 的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达 了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶 连两个或多个相关基因的表达。
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2
3、表达的控制
诱导表达系统：IPTG 防渗漏表达系统：lacIq PL启动子受cⅠ的调控，低温(30℃)下阻抑转录， 高温(40-45℃)下解除抑制。 二、利用T7噬菌体启动子的表达载体 pET系列，表达能力强，可控性好，只受T7噬 菌体RNA聚合酶识别，不受大肠杆菌RNA聚 合酶识别，可用IPTG诱导表达。
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22
2 ） 植 物 Ac-Ds 转 座 子 双 因 子 插 入 突 变 ： 玉 米 Ac (activator) 因子是一个转座子，含有完整的转 座酶， Ds (dissociation) 是 Ac 缺失转座酶基因 的缺失体，但具两端的反向重复序列。
分别构建含Ac 和Ds 的质粒载体载体并分别转化植物， 转基因植株杂交 (Ac×Ds) 后代中会发生转座事件 而产生突变体。 利用Ac-Ds序列作探针或引物克隆目标基因。
西南大学生物技术专业 基因工程 6
3 、内含肽表达载体：如 NEB 公司的 Impact-Twin 系 统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽 (intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白 酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切 除。 4 、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙， 可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠， 或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。 信号肽(signal peptide) 有碱性磷酸酶信号肽、蛋 白质 A 信号肽（如 Amersham 公司的 pEZZ18 系统）。
课件2：3.2.1 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建
因 文
单链互补DNA
库 （
DNA聚合酶催化
如
双链cDNA片段
cDNA
与载体连接
文
导入受体菌中储存
库
）
体内全部DNA
限制酶
许多DNA片段
与运载体连接导入受体菌群体 基因组某种生物某个时期的mRNA
反转录
cDNA
与运载体连接导入受体菌群体 部分基因（cDNA）PCR技术
DNA复制
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
解旋方式 DNA在高温下变性解旋
不 场所 同 点酶
结果
体外复制 耐高温的DNA聚合酶
大量的DNA片段
解旋酶催化
细胞内（主要在细胞核内） 解旋酶、DNA聚合酶 形成整个DNA分子
第
二
基关于因公表司达载体的构建
步
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使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸
3 扩增方式： 以指数方式扩增，即__2_n_（n为扩增循环的次数）
4 扩增过程：
4 扩增过程：
PCR扩增的计算：
（1）若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的 子代DNA数目为 2n 个。 （2）若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子 代DNA数目为 N0∙2n个。
〘思考〙用DNA连接酶处理后会出现几种产物？
如何避免质粒的自我环化和目的基因反向连接的问题？
质粒
目的基因
将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的
连接方式有：
目的基因自连
自连
目的基因
质粒自连 目的基因与质粒连接
质粒
语言表达得体公开课PPT课件
贵恙：称对方的病。
贵子：称别人的儿子（多含祝福 之意）。喜得贵子。 贵国：称对方国家； 贵校：趁对方学校。
惠 用于对方对待自己的行为动作 惠存：请保存（多用于送人照片 书籍等所题的上款）。
惠临：对方到自己这来。
惠顾：惠临（多用于商店对顾 客）。敬请惠顾。
惠允：对方允许自己做事。
惠赠：对方赠予（财物）。
芳 芳邻：称别人的邻居。真羡 慕你巧得如此儒雅之芳邻。
芳龄：用于询问年轻女子的 年龄。敢问令妹芳龄几何？
芳名：一般用于询问年轻女 子的姓名。可否一知小姐芳 名？
华 称对方的有关事物。 华诞：称人的生日。恭祝祖 国56华诞。
华翰：称对方的书信。华翰 已收，勿念！
华堂：称对方的房屋。
华宗：称人同姓。
语)、感情色彩(褒义与贬义)、交际目的、交际场合、交际对象、交
际手段的差异，还要注意敬词、谦词的使用(用语要注意礼貌的要
求)、转述语言得体等。这是比“简明、连贯”更高一层的要求。
11/18/2019
15
目录
CONTENTS
一、透析命题——2大考查方式 二、学通方法——5大设误角度
专题检测·高考过关
1划1/18”/201；9 ⑤“正遇上”改为“正值”。
18
题组二 2017年客观题
3．(2017·全国卷Ⅰ)下列各句中，表达得体的一句是(3分)( )
A．真是事出意外！舍弟太过顽皮，碰碎了您家这么贵重的
花瓶，敬请原谅，我们一定照价赔偿。
B．他的书法龙飞凤舞，引来一片赞叹，但落款却出了差
错，一时又无法弥补，只好连声道歉：“献丑，献
会扩大，从更广阔的层面上考查日常用语的交际和特定场合下的书
面表达得体，弘扬传统文化。
贵子：称别人的儿子（多含祝福 之意）。喜得贵子。 贵国：称对方国家； 贵校：趁对方学校。
惠 用于对方对待自己的行为动作 惠存：请保存（多用于送人照片 书籍等所题的上款）。
惠临：对方到自己这来。
惠顾：惠临（多用于商店对顾 客）。敬请惠顾。
惠允：对方允许自己做事。
惠赠：对方赠予（财物）。
芳 芳邻：称别人的邻居。真羡 慕你巧得如此儒雅之芳邻。
芳龄：用于询问年轻女子的 年龄。敢问令妹芳龄几何？
芳名：一般用于询问年轻女 子的姓名。可否一知小姐芳 名？
华 称对方的有关事物。 华诞：称人的生日。恭祝祖 国56华诞。
华翰：称对方的书信。华翰 已收，勿念！
华堂：称对方的房屋。
华宗：称人同姓。
语)、感情色彩(褒义与贬义)、交际目的、交际场合、交际对象、交
际手段的差异，还要注意敬词、谦词的使用(用语要注意礼貌的要
求)、转述语言得体等。这是比“简明、连贯”更高一层的要求。
11/18/2019
15
目录
CONTENTS
一、透析命题——2大考查方式 二、学通方法——5大设误角度
专题检测·高考过关
1划1/18”/201；9 ⑤“正遇上”改为“正值”。
18
题组二 2017年客观题
3．(2017·全国卷Ⅰ)下列各句中，表达得体的一句是(3分)( )
A．真是事出意外！舍弟太过顽皮，碰碎了您家这么贵重的
花瓶，敬请原谅，我们一定照价赔偿。
B．他的书法龙飞凤舞，引来一片赞叹，但落款却出了差
错，一时又无法弥补，只好连声道歉：“献丑，献
会扩大，从更广阔的层面上考查日常用语的交际和特定场合下的书
面表达得体，弘扬传统文化。
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一、大肠杆菌表达载体的结构
原核表达载体：适用于在原核细胞中表达 外源基因的载体。
均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的 基本要求，然后增加表达元件。
1、表达元件(expression elements)
1）启动子(promoter)：三类，即 lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或trc，
cI857
p15A ori
KanR
19
T7 表达系统存在的问题
T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达 系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底 转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会 影响细胞的生长。
解决办法
在表达系统中低水平表达 T7 溶菌酶基因，能与T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。通过共转化质粒 导入表达系统，它能明显降低本底转录。
cI857
双质粒系统
一 个 质 粒 带 有 T7 RNA 聚合酶基因，另一个质粒带 有 T7 启动子和目的基因
两个质粒的复制子和抗 性标记不能相同，调控方式 为控制 T7 RNA 聚合酶的启 动子调控类型
ColE1 ori
AmpR
T7 启动子
目的基因
热诱导
T7 RNA 聚合酶
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
遏蛋白（阻遏转录过程）的 lacI 基因的突变体。 PL启动子受cⅠ基因（阻遏溶菌周期基因表达）产物
的抑制，在λ噬菌体溶原的大肠杆菌中表达。 cⅠ基因的温度敏感突变体cI857（ts）：低温(30℃)下
阻抑转录，高温(40-45℃)下解除抑制。 T7噬菌体启动子：较复杂
二、利用T7噬菌体启动子的表达载体
大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强 的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建 的表达系统称为 T7 表达系统。
14
T7 表达系统
T7噬菌体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活 T7噬菌体启动子的转录。
T7 RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠 杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被 大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。
15动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。
化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统
T7 启动子
目的基因
T7 RNA 聚合酶
？启动子 T7 RNA 聚合酶基因
16
化学诱导型
噬菌体 DE3 是λ噬菌体
表达载体
西南大学生物技术专业 基因工程
1
表达载体构建的一般原则
1、阅读框架 要使目的基因得以表达，最重要的因素是外源目的
基因本身必须置于正确的阅读框架之中。
用人工接头可以调节阅读框架，选择适当的人工接 头，就可使外源基因处于正确的阅读框架中。
2、启动子（关键因素） 有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞
都受IPTG诱导。 T7噬菌体启动子 λ噬菌体的PL启动子。
2）终止子：依赖于ρ因子或不依赖于ρ因子（遇茎环 结构而终止）。
3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)： 是mRNA上的特异性序列，核糖体可以识别并结合这 一序列来启动翻译过程。
2、表达形式
完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。
中高效表达的关键步骤之一。 因此，选择强的启动子及其相关的调控序列
，是构建一个高效表达载体首先要考虑的问题。
3、转录的有效延伸和终止 外源基因的转录一旦被起始，接下来的问题是如何
保证mRNA有效地延伸、终止。 转录衰减和非特异性终止可诱发转录提前终止。
措施： （1）除去衰减子 （2）插入抗转录终止序列 （3）强转录终止序列
融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编 码区的串联体，但构成一个整体的单一ORF， 如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如 果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个 多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可 以偶连两个或多个相关基因的表达。
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3、表达的控制
诱导表达系统：IPTG 防渗漏表达系统：lacIq，一种能产生过量的 LacI 阻
温度诱导型
PL 启动子控制T7 RNA 聚
合酶基因，通过热诱导方式激 发T7 噬菌体启动子的转录。
E.Coli （CE6）
T7 启动子
目的基因
这种方式可以使本底转录 降到很低的水平，尤其适用于 表达对大肠杆菌宿主有毒性的 重组蛋白质。
热诱导
T7 RNA 聚合酶
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
的衍生株，一段含有 lacI启
动子和T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其中。
用 噬 菌 体 DE3 的 溶 源 菌 作 为表达载体的宿主菌，调控方 式为化学诱导型，类似于 Lac 表达系统。
E.Coli （DE3）
T7 启动子
目的基因
IPTG 诱导
T7 RNA 聚合酶
lac 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
4、有效的翻译起始（关键因素） 原核：SD序列，能帮助从起始AUG处开始翻译。 真核：kozak（科扎克）序列，核糖体能够识别
mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。
5、翻译终止密码选择 在原核生物中，翻译的终止由两个释放因子所控
制，RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA。 由于UAA为两个释放因子所识别，因此在基因工程 中，一般采用UAA作为终止码。
6、外源蛋白的稳定性
可采取以下措施避免克隆的蛋白被选择性降解： （1）构建融合基因，产生融合蛋白，使外源蛋白不被
选择性降解
（2）构建成可分泌的蛋白：不是所有的外源蛋白都可 以通过基因操作成为可分泌蛋白。
（3）使外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达
总之，构建表达载体应根据表达体系的特性，选 择性地应用上述原则，删除降低外源基因表达的 一些元件，插入提高外源基因表达的一些必需元 件。
第一节 大肠杆菌表达载体
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA(美国食品药物管理局)批准为安全的基因工 程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素