实验方案(双歧杆菌的分离)
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌实验操作双歧杆菌（Lactobacillus）是一种常见的革兰氏阳性菌，广泛存在于人体的肠道、口腔、阴道等部位，对人体具有重要的生理功能和健康益处。
在实验室中，通过培养双歧杆菌，我们可以进一步研究它的特性、代谢途径、功能以及应用价值。
以下是一个关于双歧杆菌实验操作的示例，包括菌株的分离、培养、保存和鉴定等步骤。
1.菌株的分离和纯化从人体标本或商业产品中获得含有双歧杆菌的样品，例如：粪便、口腔漱口水、乳制品等。
将样品悬浮于无菌PBS（磷酸盐缓冲溶液）中，并进行10倍序列稀释。
将适量的悬浮液均匀涂布在含有适宜培养温度和营养成分的琼脂平板上。
经过孵育后，从单个菌落中刺取分离得到的单菌株。
2.菌株的培养将分离得到的单菌株接种到含有适宜培养基（如MRS培养基）的液体培养物中。
培养条件包括适宜的温度（通常在30-37℃之间）、PH值和氧气供应等。
静态培养通常在试管中进行，而摇床培养则需提供常规的摇床条件。
3.菌株的保存为了长期保存双歧杆菌菌株，常常采用冷冻保存和干燥保存。
其中，冷冻保存利用甘油或液氮冷冻对菌株进行保藏。
干燥保存是将菌株培养物在适当的保护剂（如蔗糖、蛋白质）的作用下，通过真空或喷雾冻干处理。
冷冻保存要求贮存于低温（-70℃至-80℃）环境中，而干燥保存则可在室温下进行。
4.菌株的鉴定确定菌株是双歧杆菌的一种，需要通过鉴定方法进行确认。
传统的鉴定方法包括菌落形态观察、革兰氏染色、形态学特征、生理和生化试验等。
另外，分子生物学技术也可以用于鉴定双歧杆菌，如PCR扩增特定的双歧杆菌基因片段或测序分析菌株的16SrRNA基因序列。
5.功能研究在鉴定菌株后，可以进一步研究双歧杆菌的功能特性和代谢途径。
例如，可以采用培养基成分和环境参数的调整来研究双歧杆菌的生长条件。
也可以评估双歧杆菌在产生保健益生素、抑制致病菌、增强免疫等方面的功能。
总结：通过以上的实验操作，可以实现对双歧杆菌菌株的分离、培养、保存和鉴定。
细菌分离提纯实验报告
细菌分离提纯实验报告细菌分离提纯是一项常见的实验技术，通过这项技术可以从混合菌液中分离出单一的、纯净的细菌菌落。
这项技术在生物学、医学、环境科学等领域都有广泛的应用。
细菌分离提纯的实验步骤主要包括：取样、制备稀释液、涂布平板、培养菌落、筛选菌落、鉴定细菌。
首先，取样是细菌分离提纯的第一步。
当我们需要分离某种细菌时，我们需要从含有该种细菌的样品中取样。
比如，我们可以从水样、土壤样、食品样、人体样等中取样。
然后，制备稀释液。
我们对取样物进行稀释，使得其中的细菌数目降到一定范围内，以便于后续的细菌分离。
通常我们会选择使用生理盐水、缓冲液等来制备稀释液。
接下来，将稀释液涂布在平板上。
我们通常会使用琼脂平板来进行细菌分离提纯实验。
将稀释液均匀涂布在琼脂平板上，然后用培养皿盖好，放入恒温培养箱中进行培养，通常在适宜的温度下进行培养24-48小时。
培养过程中，我们可以观察到平板上出现的不同形态的菌落。
可以根据菌落的形态、颜色、大小等特征来进行筛选。
一般我们会选择孤立的、圆形的、透明或者白色的菌落作为目标菌落。
当我们筛选出目标菌落后，我们需要进行鉴定。
通常我们可以根据细菌的生理生化特性、抗生素敏感性、分子生物学特征等来鉴定细菌的种属。
可以使用生理生化试剂盒、PCR技术、16S rRNA测序等方法进行鉴定。
最终，根据鉴定结果，我们可以获得目标细菌的纯种菌株。
这些纯种菌株可以用于进一步的实验研究，如基因克隆、发酵生产等。
细菌分离提纯实验需要注意以下几点。
首先，取样要注意无菌操作，避免采样器具的污染。
其次，涂布平板时要注意均匀涂布，以避免菌落的融合。
另外，培养过程中要注意恒温，避免细菌在高温或低温下死亡。
总之，细菌分离提纯是一项重要的实验技术，在微生物学研究中起到了至关重要的作用。
通过细菌分离提纯技术，我们能够从混合菌液中得到纯净的细菌菌落，为后续的实验提供了可靠的菌种资源。
这项技术的应用涵盖了多个领域，对于推动生物科学的发展具有重要的意义。
双歧杆菌的分离与鉴定_吴拥军
作者单位:贵州农学院食品科学系 贵阳 550025 中国收稿日期:1997-01-03双歧杆菌的分离与鉴定吴拥军 王嘉福 尹峻峰摘 要 研究了适宜的双歧杆菌分离方法,从婴儿、成人粪便中分离到36株疑似双歧杆菌,经过属和种的系统生化鉴定,确认为青春双歧杆菌(B if idobacterium adoles -centis )20株和长双歧杆菌(Bif idobacterium longum )6株。
关键词 双歧杆菌 分离 鉴定 双歧杆菌是人类肠道正常菌群中一种重要的微生物,它有益于健康的原因被逐渐弄清。
它以生成醋酸为主,同时生成乳酸和少量的甲酸,在肠道中造成低pH 环境,抑制肠道中有害菌和致病菌的生长[1]。
双歧杆菌不能使硝酸盐还原为亚硝酸盐,其代谢产物可抑制肠道中的硝酸盐还原细菌,可消除或显著减少亚硝酸盐致癌物质对人体的危害,并能合成多种维生素,促使酪蛋白消化,调节菌群失调,激活吞噬细胞活性,消除自由基、过氧化脂质及腐败菌产生的吲哚胺、氨、硫化氢有害物质[6]。
双歧杆菌为专性厌氧菌,对营养条件要求很高,对低pH 的抵抗能力极差,活性保持比较困难。
目前文献报道的方法[2][3][6]大多需要较高的实验条件或重复性差。
因此,研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 样品 分离样品采自贵阳地区婴儿、成人的粪便。
1.1.2 培养基分离培养基(%):蛋白胨2.0,酵母浸膏粉0.25,葡萄糖0.5,磷酸氢二钠0.25,氯化钠0.5,硫代乙醇酸钠0.1,L -半胱氨酸0.1,天冬氨酸0.01,重铬酸钾0.2,琼脂 1.5,牛肉汤50ml,肝汤50ml 。
调至p H7.5,0.7×105Pa 灭菌20min,冷至55℃加入5%～6%的无菌兔血或羊血制成培养皿平板。
增殖、纯化培养基:参照 1.2.1(不加兔血或羊血)。
糖发酵培养基(%):氯化钠0.5,蛋白胨 1.0,酵母浸膏0.25,硫代醇酸钠0.1,20%糖溶液 5.0m l,调节pH7.5,1kg /cm 2,30min 。
益生菌的分离实验报告
一、实验目的本实验旨在从自然界中分离出具有特定功能的益生菌，并对其生长特性进行初步研究。
通过本实验，我们希望了解益生菌的分离和鉴定方法，以及不同培养基对益生菌生长的影响。
二、实验材料1. 实验材料：- 新鲜蔬菜样品（如白菜、菠菜等）- 灭菌生理盐水- 不同培养基（如LB培养基、MRS培养基等）- pH计- 显微镜- 实验室常用仪器（如无菌操作台、高压灭菌锅、移液器等）2. 实验试剂：- 蛋白胨- 酵母提取物- NaCl- K2HPO4- MgSO4·7H2O-琼脂- 碳酸钙- 磷酸氢二钠- 柠檬酸铁- 酚红指示剂三、实验方法1. 样品处理：- 将新鲜蔬菜样品洗净，用无菌剪刀剪碎。
- 将剪碎的蔬菜样品加入灭菌生理盐水中，充分搅拌。
- 用无菌纱布过滤，收集滤液。
2. 菌落分离：- 将滤液接种于不同培养基上，如LB培养基、MRS培养基等。
- 将接种好的培养基在37℃恒温培养箱中培养24小时。
- 观察并记录菌落特征。
3. 菌落纯化：- 将具有明显特征的菌落挑取，接种于新的培养基上。
- 重复上述步骤，直至获得纯菌落。
4. 菌落鉴定：- 观察菌落形态、颜色、大小等特征。
- 对纯化后的菌落进行革兰氏染色，观察菌体形态。
- 通过显微镜观察菌体的排列、大小、形态等特征。
5. 生长曲线测定：- 将纯化后的菌种接种于LB培养基中，在37℃恒温培养箱中培养。
- 定时取样，测定菌液的浊度，绘制生长曲线。
四、实验结果1. 菌落分离：- 在LB培养基上，分离出多个具有明显特征的菌落。
- 在MRS培养基上，分离出少量菌落。
2. 菌落纯化：- 通过挑取纯菌落，获得多个纯化菌株。
3. 菌落鉴定：- 革兰氏染色结果显示，分离出的菌株为革兰氏阳性菌。
- 通过显微镜观察，发现菌体为杆状，排列呈链状。
4. 生长曲线测定：- 生长曲线显示，分离出的菌株在LB培养基中生长迅速，具有一定的生长潜力。
五、实验讨论1. 菌落分离：- 本实验从新鲜蔬菜样品中分离出多个具有明显特征的菌落，表明蔬菜样品中存在多种益生菌。
高中生物分离菌落教案模板
高中生物分离菌落教案模板
一、教学目标：
1. 了解菌落的概念和形成原因。
2. 掌握分离菌落的方法和步骤。
3. 能够根据不同菌落的形态特征进行鉴定。
二、教学重点：分离菌落的方法和步骤。
三、教学难点：菌落的形态特征鉴定。
四、教学准备：
1. 实验室器材：培养皿、试管、移液管等。
2. 实验原料：不同菌株的培养基。
3. 实验实施前的预习资料。
五、教学过程：
1. 引入：
介绍菌落的概念和形成原因，并说明分离菌落的重要性。
2. 实验操作：
（1）准备试验器材和培养基。
（2）在培养基上均匀涂抹不同菌株，并分别用透明胶带标记。
（3）将培养皿放入恒温培养箱中进行培养。
（4）观察培养皿中的菌落形成情况，选取不同菌落进行分离。
3. 结果分析：
根据不同菌落的形态特征（颜色、大小、形状等），进行鉴定。
4. 总结：
总结实验过程中的经验和教训，强调菌落分离的重要性和应用。
5. 作业：
布置相关的实验报告撰写和练习题。
六、教学延伸：
可以扩大菌落分离的范围，观察不同环境下菌落的形成情况，并进行比较分析。
七、教学反思：
及时总结学生在实验中出现的问题和不足，为下次实验改进提供参考。
希望以上教案范本能够对您有所帮助，祝您教学顺利！。
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌的分离与鉴定一、实验背景双歧杆菌( Bifidobacterium) 系1899 年巴斯德研究院的Tissier首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来[1]。
双歧杆菌是人体肠道内重要的益生菌之一，还具有抗肿瘤、抗衰老、营养等作用。
双歧杆菌为专性厌氧菌，对营养条件要求苛刻，活性保持相对比较困难。
因此，研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
为了丰富双歧杆菌菌种资源及开发双杆菌产品，本实验主要是了进行双歧杆菌分离、纯化、生化鉴定以及PCR检测，进行对双歧杆菌的分离与鉴定。
二、实验步骤（一）材料1、分离源母乳喂养的健康婴儿粪便2、培养基和试剂TPY培养基、生理盐水、革兰染料（结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红液）、厌氧袋（硼氢化钾、柠檬酸、碳酸氢钠）、生化鉴定试剂管（F6PPK 试验、乳糖、葡萄糖、硫化氢、纤维二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸盐、木糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、阿拉伯糖、过氧化氢、联苯胺）、双蒸水、TaKaRa Taq、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、16sRNA 90916 F、16sRNA 90916 R、3、设备PCR仪、紫外分光光度仪、凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱、厌氧罐、无菌操作台、冰箱、显微镜、接种环等微生物实验室所需的常规设备。
（二）实验内容1、样品的采集与处理（1）用灭菌棉签取母乳喂养的健康婴儿的粪便约l g，放入装有9ml生理盐水的无菌试管中，充分振荡摇匀，做成1∶10 的均匀稀释液。
另取1 mL 灭菌的移液管吸取1∶10 的稀释液注入到灭过菌的含有9 mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，做成1∶100 的均匀稀释液。
按上述操作顺序，依次做成1×10- 3～1×10- 7 梯度的均匀稀释液。
（2）分别取1×10- 1~1×10- 7 梯度的均匀稀释液在TPY培养基平板上进行划线分离（预实验），37℃厌氧培养24~48h观察哪几个梯度的双歧杆菌分离的比较好，然后进行试验。
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌的分离与鉴定一、实验背景双歧杆菌( Bifidobacterium) 系1899 年巴斯德研究院的Tissier首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来[1]。
双歧杆菌是人体肠道内重要的益生菌之一，还具有抗肿瘤、抗衰老、营养等作用。
双歧杆菌为专性厌氧菌，对营养条件要求苛刻，活性保持相对比较困难。
因此，研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
为了丰富双歧杆菌菌种资源及开发双杆菌产品，本实验主要是了进行双歧杆菌分离、纯化、生化鉴定以及PCR检测，进行对双歧杆菌的分离与鉴定。
二、实验步骤（一）材料1、分离源母乳喂养的健康婴儿粪便2、培养基和试剂TPY培养基、生理盐水、革兰染料（结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红液）、厌氧袋（硼氢化钾、柠檬酸、碳酸氢钠）、生化鉴定试剂管（F6PPK 试验、乳糖、葡萄糖、硫化氢、纤维二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸盐、木糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、阿拉伯糖、过氧化氢、联苯胺）、双蒸水、TaKaRa Taq、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、16sRNA 90916 F、16sRNA 90916 R、3、设备PCR仪、紫外分光光度仪、凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱、厌氧罐、无菌操作台、冰箱、显微镜、接种环等微生物实验室所需的常规设备。
（二）实验内容1、样品的采集与处理（1）用灭菌棉签取母乳喂养的健康婴儿的粪便约l g，放入装有9ml生理盐水的无菌试管中，充分振荡摇匀，做成1∶10 的均匀稀释液。
另取1 mL 灭菌的移液管吸取1∶10 的稀释液注入到灭过菌的含有9 mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，做成1∶100 的均匀稀释液。
按上述操作顺序，依次做成1×10- 3～1×10- 7 梯度的均匀稀释液。
（2）分别取1×10- 1~1×10- 7 梯度的均匀稀释液在TPY培养基平板上进行划线分离（预实验），37℃厌氧培养24~48h观察哪几个梯度的双歧杆菌分离的比较好，然后进行试验。
实验方案(双歧杆菌的分离)
1双歧杆菌的分离1.1样品取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。
1.2培养基根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。
选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。
1.2.1缓冲蛋白胨水溶液（BP）成份：蛋白胨10gA磷酸氢二钠2g葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g氯化钠5g 蒸馏水1000ml制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121°C，杀菌15min后置4°C的冰箱中备用。
1.2.2选择性改良NPNL培养基（苏世彦）成份：酵母膏5g淀粉0.5g蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g胰蛋白胨5g溶液A10ml大豆蛋白胨5g溶液B5ml葡萄糖10g溶液C50ml乳糖3g琼脂A15g吐温801g pH7.2牛肝提取液150ml制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121C杀菌10min，备用。
溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g 溶于蒸馏水100ml。
溶液B：FeSO ・7H O 0.2g、MgSO ・7H O 4g、MnSO ・4H O4 2 8^42$ 4 20.135g、NaCl 0.2g 溶于蒸馏水100ml。
溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。
1.2.3 NPNL培养基（孙雪）培养基成分及用量：牛肉浸汁粉（oxoid）3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，植胨3g,酵母浸出汁5g,肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml,溶液B 5ml,吐温80 1g,盐酸半胱氨酸0.5g, 琼脂15g，蒸馏水815ml, X-Gal（5-漠-4-氯-3』引噪-。
-D-半乳糖苷）60mg。
pH 7.2, 121 °C, 15min 高压灭菌。
溶液A：K2HPO4 25g, KH2PO4 25g，蒸馏水250ml。
分离菌种的实验步骤及过程
分离菌种的实验步骤及过程嘿，朋友们！今天咱来聊聊分离菌种的那些事儿。
这可真是个有趣又有点儿神秘的过程呢！首先，你得准备好各种家伙什儿，就像战士上战场得有称手的兵器一样。
什么无菌操作台啦，培养基啦，接种环啦，都得备齐咯。
然后，咱就开始采集菌种样本啦。
这就好比是去寻找宝藏的线索，你得找对地方，小心翼翼地把那带着菌种的宝贝给弄到手。
比如说从土壤里啦，或者从一些特殊的环境里找到它们。
拿到样本后，可不能直接就往上怼啊！得给它们来个精细的处理。
把样本放在合适的溶液里，让那些菌种能乖乖地跑出来。
这就像是把藏在沙子里的金子给淘出来一样。
接下来就是关键的接种环节啦！在无菌操作台上，用接种环轻轻地蘸取一点处理后的样本，然后像画画一样在培养基上轻轻一抹。
嘿，这一下可就有讲究了，不能太重也不能太轻，得恰到好处。
就好像是在给蛋糕裱花，得有那手艺才行。
接种完了，就把培养皿放进合适的环境里培养。
这就像是给小菌种们安了个家，让它们能舒舒服服地长大。
在培养的过程中，你可得时刻关注着它们的变化。
看着那些小小的菌落一点点长出来，就像看着自己种的花儿慢慢开放一样，心里那叫一个美呀！有时候你会发现，哇，怎么会长出这么奇怪的形状啊！哈哈，这就是菌种的奇妙之处。
等菌落长到合适大小了，咱就得把它们挑出来，单独培养。
这可不容易哦，得像个细心的妈妈照顾小宝宝一样，轻手轻脚的。
要是不小心弄伤了它们，那可就前功尽弃啦！整个过程中，你得有足够的耐心和细心，就像对待珍贵的宝贝一样。
要是马虎大意了，那可就没法分离出纯纯的菌种咯！朋友们，分离菌种是不是很有意思呀？这就像是一场小小的探险，每一步都充满了惊喜和挑战。
虽然有时候会遇到困难，但当你看到自己成功分离出的菌种时，那种成就感简直无法用言语来形容！所以呀，大胆去尝试吧，去感受这个神奇的过程，说不定你会发现一个全新的微生物世界呢！。
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌实验操作双歧杆菌是一种对人体有益的细菌，它能帮助消化、增强免疫系统以及维持身体健康。
为了了解双歧杆菌的生长和培养条件，进行了以下实验操作。
实验名称：双歧杆菌的培养和生长条件研究实验目的：探究双歧杆菌的最佳生长和培养条件，为后续研究提供基础。
实验材料：1.LB琼脂平板和培养基2.双歧杆菌培养液3.双歧杆菌菌株4.灭菌剂5.培养皿6.培养瓶7.石棉网8.无菌吸管9.无菌培养箱实验步骤：1.准备工作a.所有实验器材要进行高温高压灭菌处理，确保无菌条件。
b.双歧杆菌菌株从冻存物中取出，置于LB琼脂平板上，37℃恒温培养箱中培养过夜。
c.同时准备LB琼脂平板，在培养箱中恒温保持。
2.建立原始菌种a.从培养过夜的LB琼脂平板上选取一个单独的菌落，用无菌吸管轻轻吸取，均匀涂布于另一个LB琼脂平板表面。
b.将新的LB琼脂平板颠倒放置于培养箱中，37℃恒温培养24小时。
c.检查平板上是否有单独的菌落，若有则进行后续实验。
3.建立培养液a.准备LB培养基，加入适量的琼脂，煮沸溶解后静置至37℃。
b.预测双歧杆菌菌株的生长曲线，选择合适的培养液和培养时间。
c.将适量的培养液倒入无菌培养瓶中，盖上无菌瓶盖，并用石棉网覆盖。
4.培养和生长a.在培养液中加入适量的双歧杆菌菌株，以达到适合培养的细菌浓度。
b.将培养瓶置于37℃恒温培养箱中。
c.每天监测双歧杆菌的生长情况，记录菌株的数量和培养液的浑浊度。
5.结果分析a.观察双歧杆菌的生长情况，包括生长速度、最适生长温度和最适培养液pH值。
b.对实验数据进行统计分析，绘制生长曲线和生长速率图。
c.比较不同因素对双歧杆菌生长的影响，并得出结论。
实验注意事项：1.所有实验用具和培养基要进行高温高压灭菌处理。
2.在操作过程中要保持无菌环境，避免外界细菌的污染。
3.严格遵守实验室安全规范，避免接触到有害物质。
4.在实验过程中要定期检查和记录双歧杆菌的生长情况，以便后续分析和对比。
肠道微生物的分离与鉴定方法
肠道微⽣物的分离与鉴定⽅法⼀、有益菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，柔嫩梭菌，丁酸梭菌，芽孢杆菌（枯草、地⾐）。
5种有害菌：⼤肠杆菌，沙门⽒菌，产⽓荚膜梭菌，空肠弯曲杆菌。
4种⼆、厌氧菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，产⽓荚膜梭菌，丁酸梭菌，柔嫩梭菌。
5种需氧菌：芽孢杆菌。
1种兼性厌氧菌：⼤肠杆菌，沙门⽒菌。
2种注：境中⽣长最好。
最适温度为37～42℃。
在正常⼤⽓或⽆氧环境中均不能⽣长。
肠道正常菌群中95%以上为专性厌氧菌，兼性厌氧菌和需氧菌在正常菌群中所占⽐例较少。
三、⼀般检测菌株包括厌氧菌中的双歧杆菌、拟杆菌、优杆菌、消化性球菌、乳杆菌及梭菌。
需氧菌中的肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌，及酵母菌等。
四、⽆氧环境的简易操作：1、⽅法来⾃⽂献《健康⽺驼粪球中主要正常菌群的分离与初步鉴定》采⽤⼲燥器培养，1m3空间⽤焦性没⾷⼦酸10g、10%氢氧化钠溶液l00mL，按⽐例取10%的氢氧化钠液置于⼲燥器⽫底部，然后放置2到3个略⾼于液⾯的青霉素⼩瓶，再按⽐例称取焦性没⾷⼦酸⽤纸包好，放在圆柱上。
继⽽放上隔板,将接种完毕的培养基放于隔板上，同时放美蓝指⽰剂⼀管。
盖上缸盖并⽤⽯蜡封闭。
再轻轻摇动⼲燥器，使焦性没⾷⼦酸掉⼈氢氧化钠液中，反应后，⼲燥器内⽆氧，美蓝指⽰剂由蓝变⽩。
置于温箱37℃培养24⼀48h观察结果。
2、⽅法来⾃⽂献《健康猪肠道菌群的分离培养与耐药性分析》后者先拧紧瓶盖,放⼊密封性较好的玻璃罐(⽤凡⼠林封⼝)，通过蜡烛燃烧法制作简易厌氧装置。
五、CO2培养箱不可代替⽆氧培养箱厌氧箱⼀般是组合⽓体90%氮⽓+5%氢⽓+5%⼆氧化碳，厌氧箱⾥⾯培养的微⽣物都是厌氧微⽣物；⽽⼆氧化碳培养箱⾥⾯是5%⼆氧化碳+95%空⽓，⾥⾯是有⼀部分氧⽓的。
⼀般的研究认为严格厌氧菌的培养环境中O2的浓度必须⼩于1000ppm（千分之⼀），更严格的环境是⼩于300ppm（万分之三），本实验室CO2培养箱CO2浓度范围为280-2000ppm，所以CO2培养箱是不能⽤来培养严格厌氧菌。
双歧杆菌分离培养鉴定
双歧杆菌分离培养鉴定1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 气相色谱仪配FID检测器。
2.3 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.4 天平：感量0.1 g。
2.5 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
2.6 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器（200μL～1000μL）及配套吸头。
2.7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。
2.8 显微镜2 培养基和试剂3.1 BS培养基3.2 PYG培养基3.3 TPY培养基3.4 NPNL 培养基3.5 X-GAL 培养基3.6 氟化钠：化学纯。
3.7 碘乙酸钠或碘乙酸钾：化学纯。
3.8 果糖-6-磷酸盐：化学纯。
3.9 盐酸羟胺(Hydroxy Lamine-HCl)：化学纯。
3.10 三氯乙酸(TCA)：化学纯。
3.11 三氯化铁（FeCl3·6H2O）：化学纯。
3.12 甲醇:分析纯。
3.13 三氯甲烷：分析纯。
3.14 硫酸：分析纯。
3.15 冰乙酸：分析纯。
3.16 乳酸：分析纯。
3.17 乙酸标准溶液: 吸取分析纯冰乙酸5.7mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录B.1,此溶液浓度约为1mol/L。
3.18 乙酸标准使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。
3.19 乳酸标准溶液: 吸取分析纯乳酸8.4mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录B.2，此溶液浓度约为1mol/L。
3.20 乳酸标准使用液: 将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。
3 双歧杆菌的分离和培养在无菌室内无菌称取1g双歧杆菌制剂，根据标示的活菌数量，用灭菌稀释液进行10倍梯度稀释至104-107，然后吸取0.2mL涂布于BS和NPNL琼脂平板上，放于厌氧培养箱内培养48到72小时.然后挑选菌落特征为光华、凸圆、边缘整齐、白色或乳脂色、质地柔软的中小菌落，接种于TPY琼脂平板上厌氧培养。
开题报告-双歧杆菌
对实验数据进行了收集和 整理，采用生物信息学方 法对双歧杆菌基因组进行 了注释和分析。
成功构建了双歧杆菌的培 养体系，并对其生长特性 和代谢产物进行了初步分 析。
后续计划
深入研究
进一步探究双歧杆菌的生理功能 和代谢途径，以及与其他微生物 的相互作用关系。
应用拓展
开展双歧杆菌在食品、医药和农 业等领域的应用研究，探索其产 业化前景。
双歧杆菌பைடு நூலகம்益生功能
探讨双歧杆菌对人体健康的益处，如调节肠道菌 群平衡、增强免疫力等。
3
双歧杆菌的应用研究
研究双歧杆菌在食品、保健品、药品等领域的应 用。
研究目标
揭示双歧杆菌的生物学特性和益生功能
01
通过深入研究双歧杆菌的生物学特性和益生功能，为双歧杆菌
的应用提供科学依据。
开发高效、安全的双歧杆菌制剂
遵守学术诚信
保证所引用的文献和数据来源真实可靠，不篡改、伪造数据或抄 袭他人成果。
保密原则
对于涉及商业机密或他人隐私的数据和信息，予以保密处理，不 在报告中泄露相关信息。
THANKS
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微生物培养技术
通过特定的培养基和条件， 对双歧杆菌进行纯化和扩 增。
代谢组学分析
利用质谱、核磁共振等技 术，研究双歧杆菌的代谢 产物及其功能。
实验设计
双歧杆菌的分离与纯化
从人体肠道或发酵食品中分离双歧杆菌，并通过多次传代培养， 获得纯化的菌株。
双歧杆菌的基因鉴定
提取双歧杆菌的DNA，利用特异性引物进行PCR扩增，并对扩增 产物进行测序和比对分析，以确定其种属和分类地位。
02
"双歧杆菌的分离、 鉴定及应用"
这篇论文介绍了双歧杆菌的分离和鉴 定方法，以及其在食品、医药等领域 的应用情况。
微生物学实验报告——双歧杆菌分离
微生物学实验报告乳酸菌分离纯化——双歧杆菌的分离纯化2012/6/5实验目的：从酸奶等富含乳酸菌的物质中分离到具有活性的双歧杆菌并进行初步鉴定。
实验原理：双歧杆菌是动物体肠道内的正常优势生理细菌，革兰氏阳性，无芽孢，没有运动能力，最适生长温度37℃~41℃，专性厌氧。
双歧杆菌的细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。
单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。
双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(7)。
因为双歧杆菌是严格厌氧细菌，所以双歧杆菌的培养条件必须无氧，且培养基要具有低氧化还原电势。
培养双歧杆菌最常用的方法是亨盖特厌氧滚管法(1, 5, 7)，此外还有厌氧箱法，厌氧袋法和厌氧罐法等。
亨盖特厌氧滚管法是亨盖特（Hungate）于1950年发展起来的一套严格厌氧微生物的培养技术，主要原理是利用铜柱氧化除氧的滚管分离纯化法。
亨盖特厌氧滚管法的优点是可以实时检查培养物，无氧效果好且花费不高，但需要专门的仪器和技术性很强的操作。
本实验采用的简易厌氧罐法是一种操作简单且成本很低的方法，主要原理是利用焦性没食子酸除去厌氧罐内的氧气。
该方法的缺点是焦性没食子酸与NaOH反应过程中会产生一定量的NO，可能不利于细菌的生长；此外，过量的NaOH 会将厌氧罐中的CO2一起除掉，而CO2对多数厌氧菌的生长有促进作用。
另外，在同一个培养皿上接种好氧细菌（如大肠杆菌和枯草杆菌）能加强除氧的效果。
本实验所用的培养基参考了NPNL培养基(6)和BS培养基的配方，其中鱼粉、牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨的作用是提供氮源、维生素和生长因子，葡萄糖和乳糖为乳酸菌发酵提供糖类底物，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为酸碱缓冲剂，硫酸亚铁、硫酸锰为乳酸菌提供生长因子，氯化钠维持均衡的渗透压。
如果在培养基中加入一定浓度的抗生素，比如硫酸卡那霉素（75μg/ml）、硫酸新霉素（30-200μg/ml）、硫酸巴龙霉素（20-200μg/ml）、萘啶酮酸（15或80μg/ml）、氧化锂（3mg/ml）、丙酸钠（10或15g/L）、山梨酸（0.4g/L）等，培养基就成为双歧杆菌的选择性培养基(7)。
双歧杆菌分离培养鉴定
双歧杆菌的分离、培养及鉴定一实验目的1 掌握厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法。
2 观察双歧杆菌的形态特征并了解双歧杆菌的生长特性。
3了解双歧杆菌鉴定的一般方法。
二基本原理厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。
双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。
初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生长。
其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。
单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。
革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。
双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。
双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。
该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。
该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。
双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。
这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。
本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。
双歧杆菌的分离与培养_秦玲玲
B 3种碳源质量比
1︰1︰1 1︰1︰2 1︰2︰1 2︰1︰1
C 酵母粉质量分数/%
0.3 0.5 0.7 0.9
注：4种氮源比例为：m（大豆蛋白胨）︰m（胰蛋白胨）︰m（酪蛋白水解物）︰m（牛肉浸膏）； 3种碳源比例为：m（葡萄糖）︰m（异麦芽糖）︰m（乳糖）。
2 结果
2.1 菌落与菌体形态特征 含有双歧杆菌的酸奶制品，经过系列稀释、涂布、分离纯
固定维生素、矿物质、L-半胱氨酸、吐温-80的用量，采用正交实验设计(L16(43))优化氮源（A）、碳源 （B）和酵母浸出粉（C）的用量，因素水平见表1。
表1 基础培养基优化正交实验因素水平表(L16(43))
水平
1 2 3 4
A 4种氮源质量比
1︰1︰1︰2 1︰1︰2︰1 1︰2︰1︰1 2︰1︰1︰1
双歧杆菌只生长在接种的穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性。
2.4 生长曲线的绘制
单一菌株的生长曲线如图 5 所示。
由图 5 可知，12 h 之前菌体数量大量增长，12 h 时达到对数生长期，随后菌体数量基本保持不变。 OD 值虽然不能直接准确地反映活菌数，但是可以大 致反映菌液中菌体的多少、菌液的浓度。OD 值越大 表明菌液中菌体含量越多。 2.5 培养基的优化
1︰1︰1
0.5
1.892
制作益生菌实验实习报告
一、实验背景益生菌是一种对人体有益的微生物，可以调节肠道菌群平衡，增强免疫力，预防疾病。
随着人们对健康饮食的重视，益生菌产品在市场上越来越受欢迎。
为了深入了解益生菌的制备过程，我们进行了制作益生菌的实验。
二、实验目的1. 学习益生菌的基本知识，了解其生理功能。
2. 掌握益生菌的制备方法，包括菌种筛选、培养、发酵等。
3. 分析实验过程中可能遇到的问题，并提出解决方案。
三、实验材料1. 菌种：双歧杆菌、乳酸杆菌等。
2. 培养基：MRS培养基、LB培养基等。
3. 仪器设备：恒温培养箱、无菌操作台、显微镜、移液器等。
4. 其他：无菌水、酒精、无菌滤纸等。
四、实验方法1. 菌种筛选（1）将菌种接种到MRS培养基上，在37℃恒温培养箱中培养24小时。
（2）挑取单菌落，进行纯化培养。
（3）观察菌落特征，确定目标菌种。
2. 培养基制备（1）称取MRS培养基粉末，加入无菌水溶解。
（2）调pH至6.5-7.0。
（3）分装到无菌试管中，121℃高压灭菌20分钟。
3. 菌种活化（1）将纯化后的菌种接种到MRS培养基上，37℃恒温培养箱中培养24小时。
（2）取活化后的菌液，进行梯度稀释。
4. 发酵（1）将活化后的菌液接种到LB培养基中，37℃恒温培养箱中培养24小时。
（2）观察菌液颜色变化，记录发酵时间。
5. 产物检测（1）观察发酵过程中产生的气泡、沉淀等。
（2）测定发酵液pH值、总酸度等指标。
五、实验结果与分析1. 菌种筛选通过观察菌落特征，我们成功筛选出双歧杆菌和乳酸杆菌两种目标菌种。
2. 培养基制备按照实验步骤，成功制备了MRS培养基和LB培养基。
3. 菌种活化通过活化，菌种生长良好，菌液呈乳白色。
4. 发酵发酵过程中，观察到气泡产生，发酵液颜色逐渐变深。
5. 产物检测发酵液pH值逐渐降低，总酸度增加，表明发酵成功。
六、实验总结1. 通过本次实验，我们掌握了益生菌的制备方法，了解了其生理功能。
2. 在实验过程中，我们遇到了一些问题，如菌种筛选困难、培养基制备过程中污染等。
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1 双歧杆菌的分离
1.1 样品
取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。
1.2 培养基
根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。
选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。
1.2.1 缓冲蛋白胨水溶液（BP）
成份：蛋白胨10g 磷酸氢二钠2g
葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g
氯化钠5g 蒸馏水1000ml
制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121℃，杀菌15min后置4℃的冰箱中备用。
1.2.2 选择性改良NPNL培养基（苏世彦）
成份：酵母膏5g 淀粉0.5g
蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g
胰蛋白胨5g 溶液A 10ml
大豆蛋白胨5g 溶液B 5ml
葡萄糖10g 溶液C 50ml
乳糖3g 琼脂 15g
吐温80 1g pH 7.2
牛肝提取液150ml
制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121℃杀菌10min，备用。
溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g溶于蒸馏水100ml。
溶液B：FeSO4·7H2O 0.2g、MgSO4·7H2O 4g、MnSO4·4H2O 0.135g、NaCl 0.2g溶于蒸馏水100ml。
溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。
1.2.3 NPNL培养基(孙雪)
培养基成分及用量：牛肉浸汁粉(oxoid)3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，
植胨3g，酵母浸出汁5g，肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml，溶液B 5ml，吐温80 1g，盐酸半胱氨酸0.5g，琼脂15g，蒸馏水815ml，X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖苷)60mg。
pH 7.2，121℃，15min 高压灭菌。
溶液A：K2HPO425g，KH2PO425g，蒸馏水250ml。
溶液B：MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，MnSO40.337g，蒸馏水250ml，硫酸新霉素100μg/ml，硫酸巴龙霉素200μg/ml，萘啶酮酸15μg/ml，氯化锂3mg/ml。
1.3 分离方法
取成年人的粪便1g，放人含有9ml缓冲蛋白胨水溶液中，用液枪充分混匀，制成1:10的稀释液，摇匀后取1ml注人含有9ml缓冲蛋白胨溶液中制成1:100的稀释液，在此基础上作10-3~10-9与的稀释，由于肠道中双歧杆菌的菌数一般在109左右，所以取10-4~10-9稀释液用倾注法倒平板，每个稀释液都各取1ml分别注人到两只无菌平皿中，每个稀释度重复3个平板。
待培养基凝固后倒置，将温度调至37℃进行厌氧培养48h。
用缓冲蛋白胨水溶液做稀释液可以有效地保护双歧杆菌的存活，避免受外界环境因素的影响。
1.4 分离培养
在加人样品稀释液的平皿中，分别注人适量冷却至50℃左右的选择性改良NPNL培养基，然后放人37℃的恒温培养箱中厌氧培养1.4.1 培养特性与镜检特性
双歧杆菌在改良NPNL培养基上，经过厌氧培养以后，菌落直径1-2cm，圆形、凸起，表面光滑，边缘整齐，乳白色，粘稠湿润。
经革兰氏染色后镜检，双歧杆菌为革兰氏阳性无芽抱杆菌，呈多形性、典型的双歧杆菌为V字型或Y型；也有直、弯、棒状、匙形等多种形态，排列成单、双、短链、X、Y、V 或栅状；其大小为2-8×0.4-0.6μm，不具英膜和鞭毛，无运动性。
培养48h 后，平板上菌落呈现深蓝色、白色、浅蓝色三种颜色。
见图1。
将深蓝色菌落革兰氏染色后镜检，大部分菌体呈染色不均匀、分叉形状，符合双歧杆菌的基本的形态特征。
见图2。
图1 菌落形态及颜色图2 分离出的双歧杆菌
讨论
311双歧杆菌为专性厌气菌, 标本采集后要避免暴露于空气中, 尽可能快地带回实验室, 不要冷冻, 不要使用富集培养基或转移培养基。
尽快用稀释液作适当稀释后接种于合适的培养基中, 置于适宜的厌氧条件下培养。
312每次标本检测需用标准菌株接种相同批次的培养基,并在同一厌氧罐中进行厌氧培养, 以检测培养基的质量和厌氧环境, 以保证每次检测结果的可靠性。
313培养基添加剂不宜在4℃保存时间太长, 时间太长抗生素效价下降, 抑制其他细菌作用降低, 不利于双歧杆菌的选择, 每次新鲜配制为好。
314双歧杆菌和乳酸菌均含有半乳糖苷酶, 我们在自制改良BS培养基[1]中加入52溴242氯232吲哚2B2D2半乳糖苷(X2Gal)作为底物, 半乳糖苷酶可分解底物, 释放出吲哚。
由于双歧杆菌的半乳糖苷酶活性比乳酸菌以及其他细菌高, 吲哚释放的数量不同, 使双歧杆菌与乳酸菌和其他细菌菌落呈现不同深浅的颜色, 培养基平板上双歧杆菌菌落呈深蓝色, 其他细菌一般为白色或淡蓝色[2]。
长双歧杆菌半乳糖苷酶在Mn2+的条件下可被少量激活, 因而在双歧杆菌培养基中应加入适量的硫酸锰。
据报道25种双歧杆菌90%以上对半乳糖呈阳性反应[3], 因此该培养基能对双歧杆菌进行较好的选择。
315我们自制的改良BS培养基除具有双歧杆菌生长必需的营养物质、维生素、微量元素外, 还添加了双歧杆菌生长因子“吡福多素”(异麦芽寡糖), 双歧杆菌在此培养基上能较好生长, 其他细菌受到抑制; 双歧杆菌在此培养基上形成的菌落的形态、大小与BL培养基上形成的菌落的形态、大小无多大差别, 而颜色易与其他细菌区别。
因此该培养基是大便双歧杆菌计数较好的选择性培养基。
另外有文献报道，作为缓冲体系的磷酸盐不利于菌株的冷冻保藏，限制了菌体在后期的应用效果。
NPNL中高浓度的无机盐对人体具有潜在的危险，不适于大规模使用。
其中的L-半胱氨酸盐酸盐灭菌后产生不良气味，也不利于应用于食品中。
对上述限制NPNL工业化应用的成分进行替换或剔除。
（长双歧杆菌BBMN68工业化培养基筛选）。